Name: A磁条微珠缺血模型，以诱导小鼠高眼压，青光眼相关 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用磁条微珠注射法在小鼠眼前房建立高眼压青光眼模型。该方法可稳定维持眼压升高至少六周，帮助研究人员探索青光眼早期病理变化及潜在治疗策略。

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作者感谢范德比尔特大学的大卫·卡林斯博士（David Calkins）和卡迪夫大学的詹姆斯·摩根博士（James Morgan）分享他们的专业知识，并为本实验方案的开发提供了有益的建议。本研究得到了加拿大卫生研究院（A.D.P.）的资助。Y.A.I. 和 N.B. 获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec-Santé, FRQS）的博士后奖学金。N.B. 获得了神经科学研究中心小组（Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, GRSNC）颁发的 H.H. 贾斯珀奖学金。A.D.P. 是魁北克健康研究基金会（FRQS）的国家资助研究员（Chercheur Boursier National FRQS）。

以下实验程序均遵循加拿大实验动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）关于实验动物使用的指南，以及视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科和视觉研究中动物使用声明》。
1. 前房内注射用微针的制备
<ol>
	<li>使用拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备微针。</li>
	<li>在显微镜下，使用锋利刀片小心地在微针尖端制造一个开口。所得开口应呈椭圆形，其长轴和短轴直径分别约为 190 µm 和 70 µm。通过在显微镜下放置标尺并拍摄图像，随后使用图像分析软件进行量化，测量所制备微针开口的面积。</li>
	<li>在微移液管斜面系统中，将微针相对于斜面板倾斜 20 度角放置，使微针开口接触斜面板。研磨约 10 分钟，直至边缘平整光滑。过程中可添加数滴蒸馏水以辅助研磨。</li>
	<li>旋转微针，对开口周围的两个边缘进行研磨，直至针尖变得尖锐。</li>
	<li>使用气雾除尘器清除微针尖端开口处的所有碎屑和水分。</li>
	<li>在显微镜下仔细检查完成的微针。丢弃有裂纹的微针，以最大限度降低手术过程中微针断裂的风险。</li>
	<li>通过先用乙醇冲洗，再用无菌平衡盐溶液（BSS）冲洗的方式对微针进行灭菌。</li>
</ol>
2. 磁性微珠溶液的制备
注意：本研究中使用的磁性微珠表面包被有环氧基团。为防止产生诸如微珠聚集或非特异性分子相互作用等不良影响，在进行注射手术前，必须首先将微珠表面的环氧基团去除。
<ol>
	<li>磁珠上环氧基团的去除
	<ol>
		<li>在10倍Tris缓冲液（MW 121.14 g/mol）中配制0.02 M氢氧化钠（NaOH，MW 39.997 g/mol）溶液。</li>
		<li>轻轻涡旋磁性微珠溶液（4.5 µm 直径，4 x 10⁷8 珠粒/ml），直至珠粒在溶液中均匀悬浮。</li>
		<li>迅速将1 ml磁珠溶液加入到含50 ml 0.02 M NaOH的10倍浓度Tris缓冲液中。</li>
		<li>旋转培养24小时&#160;在室温下&#160;去除珠子上的环氧基团。</li>
		<li>将磁铁固定在管底以收集磁珠。将管子水平放置，确保所有磁珠均被吸附至磁铁一侧。继续旋转孵育4小时。&#160;室温下</li>
		<li>使用微量移液器小心移除上清液，避免扰动珠子沉淀。</li>
		<li>轻轻涡旋振荡沉淀物，加入50 ml 10倍浓度Tris缓冲液，直至珠粒充分悬浮。</li>
		<li>重复步骤 2.1.4 至 2.1.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌平衡盐溶液中磁性微珠的浓缩与重悬</li>
</ol>
注意：必须将磁珠溶液原液用无菌平衡盐溶液（BSS）浓缩，使其终浓度达到 1.6 × 106 个珠/µl，以便在 1.5 µl 的终体积中向眼前房注射 2.4 × 106 个磁珠，该体积适用于小鼠的小眼球。
<ol>
	<li>用5 ml超纯实验室级水轻轻涡旋振荡2分钟，洗涤磁珠。</li>
	<li>用磁铁将磁珠吸附至管底，收集磁珠。</li>
	<li>用微量移液器小心吸除上清水相，避免扰动磁珠沉淀。</li>
	<li>重复步骤2.2.1至2.2.3，共再进行三次。</li>
	<li>在超净工作台中，用移液器吹打500 µl BSS洗涤磁珠。本节后续所有步骤均需在超净工作台的无菌条件下进行。</li>
	<li>用磁铁将磁珠吸附至管底，收集磁珠。</li>
	<li>用微量移液器小心吸除BSS，避免扰动磁珠沉淀。</li>
	<li>重复步骤2.2.5至2.2.7，共再进行三次。</li>
	<li>在250 µl BSS中通过反复吹打重悬磁珠。</li>
	<li>确保磁珠溶液充分混匀。随后迅速将25 µl悬浮液分装至无菌的0.5 ml离心管中。储备磁珠溶液的终浓度为1.6 × 106 个磁珠/µl。</li>
	<li>于4 °C保存。</li>
</ol>
3. 诱导眼内高压
注意：第3节操作需要两人配合完成。若某一特定操作需由指定人员执行，文中将明确标注。通常情况下，人员1负责在显微镜下操作小鼠，人员2负责操控显微注射泵。整个手术过程总时长应少于10分钟（步骤3.9至3.17）。
<ol>
	<li>在成年C57BL/6小鼠中进行实验操作。将小鼠饲养于标准环境中，自由摄食和饮水 随意摄取本文中使用3至4.5月龄的雌性C57BL/6小鼠。然而，本方案也可适用于雄性小鼠、不同年龄的小鼠以及其他小鼠品系，包括转基因小鼠和基因敲除小鼠。</li>
	<li>使用校准的回弹式眼压计测量小鼠在麻醉及微珠注射前清醒状态下的基线眼内压。在角膜上滴加一滴盐酸丙美卡因。
	<ol>
		<li>轻轻抓住小鼠耳间皮肤以固定其头部。将小鼠置于实验台面上，使其体位舒适且双眼易于接触。持眼压计垂直于角膜表面，每眼至少测量三组、每组连续十次的读数，以获得眼内压（IOP）的平均值。建议在清醒小鼠中进行眼内压测量，以避免麻醉对眼内压的干扰。 Alternatively，可在完成步骤3.4后对麻醉小鼠进行眼内压测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备小鼠麻醉混合液（储备液），组分如下：20 mg/ml 氯胺酮、2 mg/ml 赛拉嗪、0.4 mg/ml 乙酰丙嗪。</li>
	<li>通过腹腔注射麻醉剂混合物（每克体重1 µl）对小鼠进行麻醉诱导。优先使用注射用麻醉剂混合物，而非气体麻醉剂（例如， 异氟烷）因为使用该方法时小鼠头部未连接吸入式面罩，操作更为灵活。此外，注射类麻醉剂所需的较长恢复时间有助于微珠稳定沉积于虹膜角膜角，避免其重新移位至前房。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺，剂量为每公斤体重0.05 mg。</li>
	<li>使用托吡卡胺滴眼液处理眼睛以诱导瞳孔扩张。由于小鼠前房较小，必须扩张瞳孔，以便在注射过程中清晰观察微针的定位与推进。</li>
	<li>在手术过程中，为防止对侧眼（未手术眼）角膜干燥，应涂抹局部眼膏。</li>
	<li>将一根洁净的微针连接至微量注射泵的注射装置上。每次操作后均需更换微针，以避免动物间的交叉污染。</li>
	<li>操作者1：将麻醉后的小鼠转移至手术平台。在显微镜下确认瞳孔完全散大，眼肌松弛，无眼球运动。无眼球运动可确保注射过程中的稳定性。使用吸水棉签轻轻擦去眼睛表面的托吡卡胺滴眼液。</li>
	<li>人员2：通过反复吹吸使磁珠溶液混匀。</li>
	<li>使用微型注射泵，立即将1.5 µl匀浆后的磁性微珠溶液（2.4 x 10⁶）加载至微针（第1节中制备）中6 微珠）。确保微量针尖端无气泡。微量针加载后，尽快执行步骤 3.12 至 3.13，以保持磁性微珠溶液处于均匀悬浮状态。</li>
	<li>将装有微针的装置置于相对于角膜缘前部45°角的位置。操作者1：使用塑料镊子固定眼球，确保微针与塑料镊子之间的夹角约为90°。</li>
	<li>操作者2：使用装载好的微针，轻柔地穿刺角膜，使微针尖端进入前房。穿刺过程中，确保微针与角膜缘保持45°角。避免微针接触晶状体或虹膜，确保微针不进入后房。操作者1：继续使用塑料镊子固定眼球。</li>
	<li>操作者1：保持小鼠头部不动，将磁铁置于眼球侧面，与微针尖端相对，以吸引磁珠进入前房，并尽量减少磁珠与角膜内表面的接触。 
操作者2：使用微量注射泵，将1.5 µl磁珠溶液注入前房，注射过程持续15至30秒。 
操作者1：在整个注射过程中，持续将磁铁保持在与微针尖端相对的位置。</li>
	<li>操作者2：注入全部体积的微珠后，缓慢将微针从眼球中抽出。 
操作者1：为避免微珠反流，将磁铁置于眼球旁继续吸引磁性微珠至前房，持续额外30至60秒。</li>
	<li>操作者1：利用磁铁将微珠吸引至虹膜角膜角。确保微珠在前房周围绕成均匀分布的环状结构。在此步骤中，应避免将微珠吸引至角膜，因为微珠一旦接触角膜，容易黏附在其内表面。</li>
	<li>使用抗生素滴眼液治疗手术眼，以降低感染风险。</li>
	<li>让小鼠在加热垫上恢复直至完全清醒（约3至4小时）。将小鼠放置为手术眼朝上。此体位可防止注射的微珠因重力作用而积聚于角膜内表面。此外，该体位还可降低感染风险，因为手术眼不会接触笼内任何垫料和/或其他可能存在的材料。&#160;如果动物出现任何痛苦迹象，可根据需要追加布托啡诺剂量。&#160;</li>
	<li>让小鼠在手术后至少恢复2天，再进行眼内压（IOP）测量。按照3.2节所述方法测量IOP。每周至少监测一次IOP，或根据需要更频繁地监测，并在每天相同时间进行，以尽量减少与昼夜节律相关的波动。</li>
	<li>进行眼内压测量时，可采用手术小鼠的对侧眼作为内部对照。或者，采用完整未手术小鼠或假手术小鼠的测量值作为正常对照。</li>
</ol>
4. 视网膜神经节细胞胞体与轴突存活的评估
<ol>
	<li>通过心脏内注射0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），立即灌注经眼内压升高处理的小鼠，随后立即使用冰冻的4%多聚甲醛（PFA）进行灌注。</li>
	<li>按照步骤4.1所述方法灌注完整、未经手术的小鼠，并将其作为未损伤对照组。不建议使用手术小鼠的对侧眼来评估视网膜神经节细胞（RGC）存活，因为已有报道指出损伤后对侧眼可能发生改变15,16，从而干扰数据解读。作为替代方案，可使用假手术眼（注射1.5 µl BSS）作为对照。</li>
	<li>使用显微剪刀小心剪除眼球周围的眼眶结缔组织，以将眼球从眼窝中分离。在视神经乳头水平处剪断视神经，使其与眼球分离。</li>
	<li>使用30 G针头在角膜上穿刺一个小孔，以便固定液能够进入眼内。将眼球置于4% PFA中，在4 °C下孵育1小时以进行进一步固定。</li>
	<li>将视神经置于含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠溶液（分子量：214 g/mol）中，在4 °C下过夜&#160;孵育以进行进一步固定。</li>
</ol>
5. 视网膜平铺切片中RGC胞体密度的定量分析
注意：以下实验步骤改编自 Nadal-Nicolas 的实验方案 等 17 并概述了在视网膜铺片上使用针对脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A（Brn3a）的抗体对视网膜神经节细胞（RGCs）进行定量的方法。其他可用于标记RGCs的方法还包括：使用针对含多个剪接位点的RNA结合蛋白（RBPMS）抗体的免疫组织化学染色，或采用Fluorogold或DiI进行逆行标记。
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，沿角膜缘全长切开，直至前部眼球组织易于分离，移除眼球前部。去除角膜和晶状体。沿锯齿缘和视神经处进行切割，小心地将视网膜从眼球上分离下来。</li>
	<li>从视网膜周边向视神经方向做四个等距的小切口，制备视网膜平铺片，以清晰区分四个视网膜象限。使用小刷子轻轻去除视网膜上残留的玻璃体。尽可能彻底清除玻璃体液对于获得清晰且强健的免疫组织化学信号至关重要。</li>
	<li>小心将视网膜转移至含有含0.5% Triton X-100的PBS溶液的48孔平底培养板中，使视网膜自由漂浮。确保节细胞层朝上。</li>
	<li>将培养板置于-70 °C环境中15分钟。待视网膜解冻后，用新鲜的含2% Triton X-100的PBS溶液洗涤两次，进一步增强通透性。</li>
	<li>用含有2% Triton X-100和2%正常驴血清的PBS溶液将Brn3a抗体稀释至0.3–0.5 µg/ml。将视网膜置于Brn3a一抗溶液中，在4 °C条件下轻轻振荡孵育过夜（O/N）。视网膜应始终完全浸没于150至200 µl的溶液中。</li>
	<li>用含有2% Triton X-100的PBS溶液将驴抗山羊IgG二抗稀释至2 µg/ml，并将视网膜在此溶液中室温（RT）轻轻振荡孵育2小时&#160;。视网膜应始终完全浸没于抗体溶液中。从本步骤起，用铝箔覆盖培养板以避免荧光淬灭。</li>
	<li>使用刷子小心将视网膜转移至载玻片上，使组织尽可能平展。室温下空气干燥10分钟，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察视网膜平铺片。按照所述方法，在每个视网膜象限中选取三个无重叠的区域，定量统计Brn3a阳性视网膜节细胞（RGCs）的数量18。</li>
</ol>
6. 视神经横切面上RGC轴突的定量分析&#160;
<ol>
	<li>从步骤4.5中获取视神经，并在2%四氧化锇（OsO4，分子量254.23 g/mol）中孵育2小时。 
	注意：由于四氧化锇具有高毒性，操作时必须在通风橱中进行，并穿戴适当的实验服。</li>
	<li>将视神经依次浸入浓度递增的乙醇（50%、70%、90%、95%和100%）中进行脱水，每次15分钟。</li>
	<li>使用以下配方配制环氧树脂：15.72 ml Embed-812，6.45 ml 十二烯基琥珀酸酐，7.83 ml 纳迪克甲基酸酐，0.45 ml DMP-30。</li>
	<li>将视神经依次在环氧树脂与丙烯氧化物（MW 58.08 g/mol）按以下比例配制的溶液中孵育：0:1、1:1、0.75:0.25 和 1:0。每次孵育均在室温下进行过夜（O/N）处理。</li>
	<li>将包埋于100%环氧树脂中的视神经（步骤6.4的最后一步）在60 °C下继续孵育48小时。</li>
	<li>使用切片机制备视神经的半薄横切片（厚度0.75 µm）。</li>
	<li>用1%甲苯胺蓝对视神经横切片进行染色。</li>
	<li>按照文献19所述方法，在每张视神经切片的五个无重叠区域定量计数RGC轴突。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍的视频技术提供了详细的分步说明，指导如何对小鼠进行前房注射磁性微珠，以有效且可重复地诱导眼内压（IOP）升高。该操作可导致眼内压持续上升，无需额外注射，并在眼高压诱导后的前3周内即可观察到明显的视网膜神经节细胞（RGC）胞体及轴突的丢失。眼内压升高是人类发生青光眼的主要危险因素。因此，这是一种有价值的依赖于小鼠眼高压的青光眼模型，具有广泛的应用潜力。
将微珠注入前房时，常见的缺点是在拔出针头时微珠会通过注射部位反流，这通常导致房水流出道仅部分受阻，并增加实验变异性。为解决这一问题，已实施若干重要改进措施。首先，制备一根锋利、洁净且带有斜面的玻璃微针对于成功注射微珠至关重要。经过适当制备的微针能够实现对角膜的可控、顺畅穿刺，同时最大限度减少对脆弱眼表组织施加压力。微小的角膜穿刺口可防止微珠反流。此外，细的微针还可降低损伤虹膜和晶状体等邻近结构的风险，从而避免引发非疾病相关的炎症。其次，在注射过程中及注射后，将手持磁铁置于眼部特定位置是该技术的另一关键环节。注射期间，磁铁用于吸引磁性微珠进入前房，从而在撤出微针时防止微珠反流；注射完成后，再利用磁铁将微珠引导至虹膜角膜角，以阻断房水流出。
在微珠阻塞模型中，另一个常见的问题是通常需要多次注射微珠才能实现眼内压（IOP）的持续升高10,11。这可能是由于随着时间推移，微珠从虹膜角膜角移位所致。如上所述，结合使用手持磁铁和术后对小鼠的体位管理可显著改善实验结果。推荐使用可注射麻醉剂，因其可在操作过程中灵活调整头部位置，且需要较长的术后恢复时间。手术后将小鼠置于手术眼朝上的体位数小时，有助于微珠沉积于虹膜角膜角，降低其重新移位回前房的风险。
确保注射的微珠数量相对一致是减少个体间差异的另一个关键步骤。由于微珠会沉降到管底，因此必须充分混匀微珠溶液，并及时吸取适量体积至微针中。若注入前房的微珠数量过少，可能导致房水引流结构阻塞不完全，从而引起眼内压（IOP）升高效果不佳或不稳定。值得注意的是，尽管微珠注射的最终目的是升高眼内压，但当清醒小鼠的眼内压测量值高于本研究报道的峰值（约25 mmHg）时，应格外谨慎。过高的眼内压会增加缺血性损伤的风险，并可能引起动物疼痛。眼内压升高应被视为评估手术成功与否的多个因素之一。因此，手术效果应综合多个参数进行评估，包括眼内压升高程度、视网膜神经节细胞胞体死亡以及轴突丢失情况。
尽管此处描述的方案可使大多数微珠成功停留在目标角度，但该模型的一个潜在局限性在于，仍漂浮在前房中的微珠可能会干扰经由角膜进行的活体视网膜成像，以及需要有效透光的电生理或行为学检测。使用微珠阻塞模型时另一个需要考虑的重要因素是，眼内压（IOP）升高的程度以及随之发生的视网膜神经节细胞（RGC）变性程度会因手术小鼠的年龄和遗传背景而异[4]。因此，对于每一种特定的转基因小鼠品系和/或年龄范围，均需确定其眼内压升高的幅度以及视网膜神经节细胞变性的时间进程。
该模型的一个特征是，在微珠注射后的前三周内，眼内压升高导致视网膜神经节细胞（RGC）逐渐死亡，术后3周即可检测到显著的RGC死亡。因此，该模型可用于研究在明显RGC胞体和轴突丢失之前，该疾病发生的早期和/或细微变化。在眼压升高诱导后的3至6周之间，并未观察到RGC死亡的显著增加。事实上，尽管在这些时间点成功且持续地升高了眼内压，RGC胞体和轴突的丢失在3至6周期间仍稳定在约22–25%。在C57BL/6小鼠中，可能需要更长时间的持续性高眼压才能导致进一步的RGC丢失，因为这些小鼠相较于其他品系对RGC损伤更具抗性5。若需研究更晚期时间点的RGC丢失，可能需要对本方案进行额外修改，包括调整微珠尺寸或进行额外注射。因此，本方案特别适用于研究与轻度RGC神经退行性变相关的早期病理生理变化，这些变化与人类青光眼的发病及早期进展密切相关。

青光眼是一种进行性且不可逆的致盲性疾病，预计到2020年全球将有约8000万人受其影响1。在青光眼患者中，视力丧失是由于视网膜神经节细胞（RGCs）的选择性死亡所致，这些细胞是将视觉信息从视网膜传递到大脑的输出神经元。青光眼是一种与年龄相关的神经退行性疾病，具有多种风险因素，其中最常见的是眼内压（IOP）升高。事实上，IOP是青光眼中唯一可调节的风险因素，目前的治疗方法也仅专注于控制眼压。然而，多种遗传、细胞和环境因素均会影响该疾病的发病和进展。因此，理解最终导致神经元死亡的各种机制，对于开发有效的青光眼治疗手段至关重要。
青光眼的动物模型对于研究疾病的病理生理机制以及发现和测试有前景的治疗方法至关重要。随着转基因小鼠品系（包括条件性基因敲除品系和携带遗传编码荧光示踪剂的小鼠）的日益可及，对可诱导的小鼠青光眼模型的需求不断增长。多年来已开发出多种啮齿类动物青光眼模型（详见文献2,3综述）。在这些模型中的许多情况下，通过干扰房水动力学诱导青光眼，导致眼内压（IOP）升高。近年来，阻塞模型逐渐受到青睐，该模型通过将微珠或其他物质注射到眼前房以阻断房水引流，部分原因在于其相对容易实现眼内压升高4-14。
青光眼的微珠阻塞模型最初在灵长类动物12、兔子8和大鼠4,9,11中实施，最近已被改进用于小鼠5,6,10。在这些研究中，向眼前房注射聚苯乙烯微珠（单独使用或与粘弹性物质联合使用）可导致眼内压升高，进而引起视网膜神经节细胞死亡6,10。然而，在拔出注射针时容易发生反流，以及微珠从角巩膜缘脱离，是该操作过程中常见的问题。为尽量减少这些缺陷，已有研究采用磁铁将磁性微珠吸引至眼球的角巩膜缘区域4,9。
本文所述方案基于先前研究9,10，采用磁性微珠和适配小鼠眼球的手持磁铁进行操作（图1）。我们在原方案基础上引入了多项重要改进，以确保在小鼠中实现有效且可重复的眼内压升高。首先，微珠注射使用精心制备的带多面斜面的玻璃微针完成。该玻璃微针具有光滑的表面和锋利的针尖，可在穿刺角膜时造成最小损伤。使用这种玻璃微针还能在针尖进入前房时提供更好的操控性，从而降低损伤虹膜和晶状体等邻近结构的风险。此外，微小的注射创口有助于角膜自我修复，并减少与损伤相关的非特异性效应。
其次，通过注射磁性微珠并使用手持磁铁，可精确控制将微珠吸引至小鼠眼球较小的虹膜角膜角区域。选用直径为 4.5 µm 的磁性微珠，因为该尺寸的微珠不会堵塞制备好的微针开口，且在注射后能有效阻塞房水流出通路。该方法不仅减少了微珠回流，还确保最大数量的微珠在目标区域聚集，从而有效阻断房水引流。此外，该策略还可减少微珠在前房中漂浮，避免其接触虹膜和晶状体等其他结构，并防止微珠进入后房。综上所述，这些改进使得微珠注射手术操作相对简便、耗时较短，能够在小鼠中高度可重复地诱导出稳定且有效的高眼压状态。

<table><tbody><tr><td>拉针仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>毛细管外径为1.5 mm，内径为1.12 mm</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>MZ9.5</td><td>变倍范围为2.5至6.0。用于制针和微珠注射手术。</td></tr><tr><td>脚踏开关</td><td>Linemaster</td><td>T-91-SE</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢刀片</td><td>Feather</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>微电极斜面研磨仪</td><td>Science Products</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>气雾除尘罐</td><td>Fisher</td><td>23-022-523</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450环氧磁珠</td><td>Life Technologies</td><td>14011</td><td>磁珠直径为4.5 &amp;micro;m。储存液浓度为4 × 10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; 珠子/ml。4&amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>小型管旋转混合仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr><tr><td>3个手持磁铁</td><td>Geomag</td><td></td><td>0.45 特斯拉。用于微珠制备和微珠注射手术。</td></tr><tr><td>25 ml 移液管</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>生物安全罩</td><td>Biostad</td><td>377355</td><td></td></tr><tr><td>平衡盐溶液（BSS）</td><td>Alcon</td><td>0065-0800-25</td><td></td></tr><tr><td>P1,000 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>P200 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR管</td><td>Sarstedt</td><td>72737.002</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td>管制药品</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Ohaus</td><td>CS 200</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td>管制药品</td></tr><tr><td>托吡卡胺滴眼液</td><td>Alcon</td><td>0998-0355-15</td><td>1% 美多丽</td></tr><tr><td>带数字显示的手动微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>平台</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-52</td><td>8 × 8 英寸</td></tr><tr><td>吸水棉签</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>P20 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Euroband</td><td>1001</td><td>确保镊子为塑料材质且表面平整，以避免损伤眼睛</td></tr><tr><td>氟喹诺酮类滴眼液</td><td>Alcon</td><td></td><td>Vigamox</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-834</td><td></td></tr><tr><td>眼压计</td><td>iCare</td><td>TV02</td><td>TONOLAB 反冲式眼压计&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚甲醛，Para</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小刷子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Canemco and Marivec</td><td>124-65-2</td><td></td></tr><tr><td>Brn-3a抗体（C-20）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-31984</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板，48孔</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>2% 四氧化锇水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>3294949</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812 包埋剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>甲基纳迪克酸酐</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold-Dykstra 包埋模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Porter-Blum超薄切片机</td><td>Sorvall</td><td>MT-2</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝O（认证生物染料）</td><td>Fisher-Scientific</td><td>T161-25</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用磁性微珠阻塞模型诱导小鼠眼压依赖性青光眼的方法

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

使用啮齿类动物青光眼模型对于理解这种多因素神经退行性疾病病理生理背后的分子机制至关重要。随着大量转基因小鼠品系的出现，人们对可诱导的小鼠高眼压模型的兴趣日益增加。本文介绍了一种基于磁性微珠阻塞的青光眼模型，该方法通过改良的带斜面尖端的微针将磁性微珠注入眼前房。利用手持磁铁将磁性微珠吸引至虹膜角膜角，从而阻塞房水从前房的排出通路。这种房水动力学的紊乱导致眼内压持续升高，继而引起视网膜神经节细胞的丢失，这与人类青光眼患者的病理表现一致。与其它可诱导性青光眼模型相比，本文所描述的微珠阻塞模型操作简便，且高效、可重复。尤为重要的是，本研究中提出的改进措施显著减少了阻塞模型中常见的问题。首先，采用斜面玻璃微针可防止微珠回流，并确保注射过程中对角膜的损伤最小化，从而降低由损伤引起的继发效应。其次，使用磁性微珠可有效将大部分微珠吸引至虹膜角膜角，显著减少悬浮在眼前房内的微珠数量，避免其与其他眼内结构接触例如最后，使用手持磁铁可在操作小鼠眼球时提供灵活性，有效引导磁性微珠，并确保在拔出微针时微珠从眼球回流极少。综上所述，本文所述的微珠阻塞小鼠模型是研究青光眼发病及进展过程中发生的神经退行性变化的一种强大研究工具。

本方案中所述将磁性微珠注射至成年小鼠前房的操作，可导致眼内压（IOP）显著且可重复地升高。术后一周，对侧眼的平均基线眼内压为 10 ± 0.6 mm Hg（均值 ± 标准误），而高血压眼的眼内压升至 19 ± 0.5 mm Hg（Student's t-检验；***p &lt;0.001，n = 12，表1，图2）。此后眼内压趋于稳定，并在至少6周内维持在平均20 mm Hg的水平，该时间点为本研究中观察的最长时程。微珠注射眼在术后2、3和6周时的平均峰值眼内压为25 mm Hg。绝大多数经处理的小鼠均出现持续性高眼内压，因此本方案无需进行第二次微珠注射。
为了评估该模型中视网膜神经节细胞（RGC）丢失的时间进程，首先通过Brn3a免疫染色对RGC胞体进行定量分析，Brn3a是一种RGC特异性标记物17。在眼内压升高诱导后1、2、3和6周，对铺片视网膜中Brn3a阳性细胞的数量进行定量。尽管在微珠注射后1周即可检测到眼内压（IOP）显著升高，但在手术后的前2周内未观察到RGC胞体数量的显著减少（图3）。然而，在眼内压升高诱导后3周（2,430 ± 67 个RGCs/mm2，均值 ± 标准误，n = 12）和6周（2,350 ± 74 个RGCs/mm2，n = 10），已出现明显的RGC死亡（减少22%），与未手术小鼠的正常对照眼（3,141 ± 49 个RGCs/mm2，n = 23）相比具有统计学差异（ANOVA，p &lt;0.001）。
视网膜神经节细胞（RGC）轴突的功能障碍与退化是青光眼的核心特征。因此，在微珠注射后3周和6周，通过定量染色为甲苯胺蓝的视神经横截面中的RGC轴突数量来评估轴突丢失情况（图4）。与未手术眼的完整视神经（39,467 ± 137 轴突/神经，均值 ± 标准误，n = 4）相比，注射微珠后3周（28,401 ± 702 轴突/神经，n = 5）和6周（29,426 ± 948 轴突/神经，n = 6）均观察到明显的RGC轴突丢失（25%）（ANOVA，p &lt;0.001）。总体而言，这些数据表明，将磁性微珠注射至小鼠前房可导致可重复且持续的眼内压升高，进而引起RGC胞体和轴突的退变。
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">OHT 手术后时间</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="3">平均眼内压（mmHg）± 标准误</td>
			<td colspan="2">峰值眼内压（mmHg）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>对侧眼</td>
			<td>青光眼眼</td>
			<td>差异</td>
			<td>对侧眼</td>
			<td>青光眼眼</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 周</td>
			<td>12</td>
			<td>10 ± 0.4</td>
			<td>19 ± 0.5</td>
			<td>9 ± 0.6</td>
			<td>12 ± 0.4</td>
			<td>22 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 周</td>
			<td>13</td>
			<td>11 ± 0.5</td>
			<td>20 ± 0.8</td>
			<td>9 ± 0.5</td>
			<td>12 ± 0.9</td>
			<td>25 ± 0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 周</td>
			<td>10</td>
			<td>11 ± 0.8</td>
			<td>20 ± 0.7</td>
			<td>10 ± 0.9</td>
			<td>13 ± 0.2</td>
			<td>25 ± 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6 周</td>
			<td>12</td>
			<td>12 ± 0.5</td>
			<td>20 ± 0.6</td>
			<td>9 ± 0.7</td>
			<td>13 ± 0.5</td>
			<td>24 ± 0.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 小鼠磁性微珠阻塞模型中眼内压的升高。 在清醒的雌性C57 BL/6小鼠中，使用校准的回弹式眼压计测量眼内压。手术眼在术后一周即检测到眼内压升高，并在手术后至少六周内持续维持在较高水平。
<img alt="磁性微珠注射示意图；小鼠眼部显微注射过程用于研究分析。" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠磁性微珠阻塞型青光眼模型手术流程图。 手术前、手术中及手术后所有操作步骤的逐步说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="眼内压随时间变化的曲线图；显示注射微珠眼与对照眼在微珠注射后的比较。" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠磁性微珠阻塞模型中眼内压的升高。 在清醒的雌性C57 BL/6小鼠中，使用校准的回弹式眼压计测量眼内压（IOP）。微珠注射眼的眼内压在术后一周显著升高（ANOVA，p &lt;0.001）。与同只小鼠的对侧眼相比，注射眼的眼内压在至少6周内持续显著升高（ANOVA，p &lt;0.001）。（完整眼：n = 12；1周：n = 12；2周：n = 13；3周：n = 10；6周：n = 12）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜神经节细胞显微图像与图表。OHT后0、3、6周RGC存活率分析。" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 小鼠磁性微珠阻塞模型中视网膜神经节细胞的死亡。 通过Brn3a对平铺视网膜进行免疫染色，可视化完整对照视网膜（A）以及注射微珠诱导眼压升高（OHT）后3周和6周的青光眼视网膜（B, C）中的RGCs。比例尺：20 µm。（D）定量分析证实，与对照眼相比，注射微珠后3周和6周RGC胞体显著减少。完整、非青光眼C57/BL6小鼠视网膜中RGC胞体密度作为参考（白色柱状图，100%存活率）。数据以均值±标准误表示（完整：n = 23；1周：n = 6；2周：n = 6；3周：n = 12；6周：n = 10，ANOVA，*** p &lt;0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="轴突变性的显微图像及柱状图；眼内压升高后3-6周的轴突存活分析。" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 小鼠磁性微珠阻塞模型中的轴突变性。 通过甲苯胺蓝染色视神经横切面，对完整对照组（A）以及微珠注射诱导眼内压升高（OHT）后3周和6周的青光眼小鼠视网膜（B, C）中的RGC轴突进行可视化观察。比例尺：10 µm。（D）定量分析证实，与对照眼相比，微珠注射在术后3周和6周均导致RGC轴突显著丢失。完整、非青光眼C57/BL6小鼠中RGC轴突的密度作为参考（白色柱，100%存活率）。数据以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示（完整组：n = 4；3周组：n = 5；6周组：n = 6，ANOVA，*** p &lt;0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种在小鼠眼球中诱导眼压升高的实验方案，该过程可导致视网膜神经节细胞丢失，类似于青光眼中所观察到的现象。将磁性微珠注射至前房，并利用磁铁将其吸引至虹膜角膜角，以阻塞房水的流出通道。

使用青光眼啮齿类动物模型对于理解这种多因素疾病病理生理学背后的分子机制至关重要……

该手术的总体目标是通过将磁性微珠注射到小鼠眼球的前房中，诱导依赖性眼压升高型青光眼。该方法有助于回答青光眼研究领域中的关键问题，例如在视网膜神经节细胞明显死亡之前，眼部发生的早期病理变化是什么。该技术的主要优势在于，可可靠地升高眼内压，同时在操作过程中对眼睛造成的损伤最小。初次使用该方法的人在注射过程中可能会因微针制备不当或微针位置不正确，导致角膜穿刺困难，并损伤晶状体等邻近结构。首先，使用毛细管拉制仪从 Bohr 硅酸盐玻璃毛细管中拉制出微针。在显微镜下，用锋利的刀片小心地在微针尖端开一个孔，使尖端呈椭圆形，其长轴和短轴直径分别约为 190 微米和 70 微米。在微移液器修尖系统中，将微针相对于修尖板以20度角放置，使微针开口接触修尖板。使用水滴修尖约10分钟，直至边缘平整光滑。接着，旋转针头，修尖开口周围的两个边缘，直至微针尖端变得锋利。然后，使用气雾除尘器清除微针尖端开口处的所有碎屑和水分。在显微镜下仔细检查制备完成的微针。丢弃有裂纹的微针。以下操作步骤需要两人共同完成。当某一特定操作需由指定人员执行时，将标明“人员1”或“人员2”。请根据文本方案配制磁性微珠溶液。为测量清醒小鼠的基线眼内压（IOP），需轻轻固定小鼠，方法是握住其两耳之间的皮肤。将小鼠置于实验台面上，确保动物体位舒适且眼睛易于接触。在角膜表面滴加一滴盐酸丙帕他卡因，然后将眼压计垂直于角膜表面放置，每只眼睛至少采集三组连续10次的读数，以获得眼内压（IOP）平均值。随后，按照文本所述方案对小鼠进行麻醉，并皮下注射0.05毫克/千克体重的丁丙诺啡。然后使用托吡卡胺滴眼液处理眼睛，以诱导瞳孔扩张，便于在注射过程中观察微针的位置。在对侧眼涂抹局部眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。现在，将无菌微针连接到微量注射泵的注射装置上。然后将麻醉后的小鼠转移至手术平台。在显微镜下，由操作者1确认瞳孔已完全散大，眼外肌松弛，无眼球运动，以确保手术过程中的稳定性。使用吸水棉签轻轻擦拭眼表的托吡卡胺滴眼液。让人员2通过反复吹打混匀磁性微珠溶液。然后，使用微注射泵，将1.5 µL均质化的磁性微珠溶液吸入微针中。确保微针尖端无气泡。尽快将针头相对于角膜缘向前呈45度角定位。由人员1使用塑料镊子支撑眼球，保持微针与塑料镊子之间的角度约为90度。由人员2使用微注射泵，轻轻用装载好的微针穿刺角膜，使微针尖端进入前房，同时避免接触晶状体、虹膜和后房。保持小鼠头部不动，由操作者1将磁铁放置在与针尖相对的一侧眼球旁，以将磁性微珠吸引至前房，并尽量减少微珠与角膜内表面的接触。在操作者1持续持握磁铁的同时，由操作者2使用微量注射泵在15至30秒内向前房注入1.5 µL磁性微珠溶液。当全部体积的微珠注射完毕后，缓慢将微针从眼球中抽出。为避免微珠反流，操作者1应继续将磁铁置于眼球旁额外30至60秒，以吸引微珠进入前房。随后，使用磁铁将微珠吸引至虹膜角膜角，同时避免将微珠吸引至角膜内表面，以防其黏附于该处。确保微珠在前房周边形成均匀分布的环状结构。术后使用抗生素滴眼液处理小鼠眼睛，以降低感染风险。将小鼠置于加热垫上恢复，直至完全清醒，期间保持手术眼朝上，以防止感染以及微珠在角膜内表面聚集。经过至少两天的恢复后，按照视频中先前演示的方法测量眼内压（IOP），并根据需要在每天相同时间每周至少监测一次或更频繁。按照文本方案分析结果。本方案中所述将磁性微珠注射到成年小鼠前房的操作，可导致眼内压（IOP）显著且可重复地升高。如图所示，在手术后一周，高血压眼的眼内压（IOP）从平均基线值10 ± 0.6 mmHg升高至19 ± 0.5 mmHg。该表格显示，此后眼内压趋于稳定，并在至少六周内维持在平均20 mmHg的升高水平，这是本研究中观察的最长时点。在手术后两周、三周和六周时，注射微珠眼的平均峰值眼内压为25 mmHg。为了评估视网膜神经节细胞（RGC）的丢失情况，在眼内压升高诱导后的一周、两周、三周和六周，对视网膜平铺标本中BRN-3A阳性细胞的数量进行了定量分析。尽管在一周时已检测到眼内压（IOP）显著升高，但在前两周内未观察到RGC胞体的显著丢失。然而，在术后三周和六周时观察到了显著的细胞死亡现象。在本图中，甲苯胺蓝染色的视神经横切面显示，与完整的视神经相比，在三周和六周时视网膜神经节细胞（RGC）轴突出现显著丢失，表明该手术导致了类似青光眼中所观察到的轴突丧失。一旦掌握该技术，单只小鼠的注射操作可在15分钟内完成。在实施该操作时，必须采取适当措施，确保注入前房的微珠数量一致。这将减少动物之间可能出现的差异。观看视频后，您应能充分了解如何通过向小鼠眼眼前房注射磁性微珠来诱导眼内高压。

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A磁条微珠缺血模型，以诱导小鼠高眼压，青光眼相关

在本视频中，一只麻醉的大鼠接受眼部手术，通过在磁场作用下将磁性微珠注入前房，以阻塞虹膜角膜角。这种阻塞会妨碍小梁网，阻止房水排出，导致眼内压升高，进而损伤视网膜神经节细胞和视神经，从而形成类似青光眼的病理状态。...

通过小鼠模型虹膜角膜角阻塞诱导实验性青光眼

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

我们介绍一种通过将磁性微球注入大鼠眼内以诱导眼内压（IOP）升高的方法，用于模拟青光眼。该方法可引起显著的眼压升高，并导致广泛的神经元死亡。本方案操作简便，无需重复注射，且可产生稳定、持久的眼压升高。...

通过眼内注射磁性微球诱导实验性青光眼

青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法...

诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。...

一种通过巩膜周缝合诱导大鼠和小鼠青光眼的模型

本文介绍了一种通过向小鼠眼内前房注射硅油以诱导眼压升高及青光眼性神经变性的实验方案，以及从前房中清除硅油从而使升高的眼内压恢复至正常水平的操作步骤。...

一种可逆的硅油诱导小鼠眼压升高模型

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。...

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

大脑中动脉线栓法阻塞是研究小鼠缺血性脑卒中的常用模型。...

小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

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使用悬挂重物系统实现小鼠冠状动脉闭塞

学习使用磁条微珠注射法在小鼠眼前房建立高眼压青光眼模型。该方法可稳定维持眼压升高至少六周，帮助研究人员探索青光眼早期病理变化及潜在治疗策略。

一种利用磁性微珠阻塞模型诱导小鼠眼压依赖性青光眼的方法

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