牙龈免疫细胞网络的分离、表征与功能检测

本方法的总体目标是分离牙龈免疫细胞，以深入表征与口腔免疫和牙周炎相关的免疫应答。该方法有助于解答口腔免疫领域的一些关键问题，例如哪些细胞因子参与了牙周炎的发病机制。该技术的主要优势在于，它能够评估口腔免疫细胞网络，并分离出足够数量的活细胞，用于后续的体外研究。

本方案的第一步是，先用大头针固定小鼠身体，打开胸腔和腹腔以暴露心脏和内脏器官。接着，在下腔静脉处做一切口，使用装有27号针头的3毫升注射器经左心室灌注3毫升PBS。待血液完全冲洗干净后，将小鼠头部用大头针固定在解剖蜡盘上，使腹部朝上。

然后使用剪刀从唇部每侧口角向颈部方向剪开，分离覆盖下颌和颈部区域的皮肤，暴露其下方的组织和肌肉。在下门牙之间剪开，以分离下颌骨的两侧。用25号针头将分离后的下颌骨每侧固定，以便进入口腔腔隙。

确定腭部后，使用10号手术刀在第一磨牙前方和第三磨牙后方做垂直切口。随后将组织从鼻腔分离，并将上颌和下颌骨块从下颌骨分离。然后清除牙龈边缘的多余组织，将上颌和下颌骨块转移至含有5毫升胶原酶和DNase并置于冰上的50毫升锥形管中。

将组织置于37摄氏度的摇床培养箱中消化1小时，在最后5分钟加入50微升0.5摩尔EDTA。然后向组织中加入5毫升冷DNase培养基，轻轻旋转混匀管内物质。接着，将四块组织转移至培养皿中。

加入 500 µL 新鲜的 DNase 培养基覆盖组织。使用解剖刀从每块组织上剥离牙龈组织。将培养皿中的全部内容物转移至置于 50 mL 离心管上方的 70 µm 细胞滤筛中。

用 3 至 5 毫升新鲜 DNase 培养基冲洗培养皿和滤筛。然后用无菌的 3 毫升注射器的推杆将牙龈组织在滤筛网面上研磨。用 30 至 35 毫升冷 DNase 培养基冲洗滤筛，并将滤液离心。

然后将腭组织重悬于1毫升完全培养基中，并测定活细胞数量。如上所述的免疫细胞分离与处理方法，能够获得足够数量的细胞，用于对野生型及易患牙周炎动物的牙龈细胞进行离体刺激，并表征其细胞因子分泌模式。事实上，可通过如图所示的密度图分析小鼠牙龈免疫细胞组成，评估易患牙周炎的LFA基因敲除小鼠中T细胞与自然杀伤细胞区室的情况。

通过采用适当的设门策略，还可检测 TCR beta CD4 阳性、TCR beta CD8 阳性以及 TCR gamma delta 阳性 T 细胞，以及 NK 细胞和天然淋巴细胞的细胞内细胞因子产生情况。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三小时内完成细胞分离并进行免疫染色。在进行该操作时，需注意高效且迅速地完成所有步骤，并在不操作细胞时始终将其置于冰上。

完成此操作后，还可进行其他方法，如细胞分选，以回答与特定细胞亚群功能相关的其他问题。