分离，鉴定和牙龈免疫细胞网络的功能性考试
2016年2月16日
我们已经建立了隔离，表型特征，并从小鼠牙龈免疫细胞的功能分析的技术。
该方法的总体目标是分离牙龈免疫细胞，以深入表征与口腔免疫和牙周炎相关的免疫反应。这种方法可以帮助回答口腔免疫领域的关键问题，例如哪些细胞因子与牙周炎的发病机制有关。该技术的主要优点是它允许评估口服免疫细胞网络并分离足够的活细胞用于下游体外研究。
作为该协议的第一步，首先放置针头以固定小鼠的身体，并打开胸腔和腹腔以暴露心脏和内脏器官。接下来，在腔静脉上切开一个切口，并使用配备 3 号针头的 27 毫升注射器通过左心室注入 3 毫升 PBS。冲洗完所有血液后，将鼠标头固定在解剖垫上，胃朝上。
然后用剪刀剪掉嘴唇朝向颈部的每个连合处，分离覆盖下颌骨和颈部区域的皮肤，并露出下面的组织和肌肉。在下切牙之间切开，将下颌骨的两侧分开。用 25 号针头固定分离的下颌骨的每一侧以进入口腔。
确定上颚后，使用 10 号手术刀片在第一磨牙前方和第三磨牙后方做垂直切口。然后从鼻腔解剖组织，并从下颌骨上解剖块。然后从牙龈边缘去除多余的组织，并将上颌骨和下颌骨块转移到含有 5 毫升胶原酶和 DNase 的 50 毫升锥形管中。
在 37 摄氏度的摇床培养箱中消化组织 1 小时，最后 5 分钟内加入 50 μL 0.5 摩尔 EDTA。然后向组织中加入 5 毫升冷的 DNase 培养基，并通过旋转轻轻混合试管内容物。接下来，将四块组织转移到培养皿中。
并用 500 微升新鲜的 DNase 培养基覆盖它们。使用手术刀从每个组织块中去除牙龈。并将培养皿中的所有内容物转移到 70 毫升试管顶部的 50 微米细胞过滤器中。
用 3 至 5 mL 新鲜 DNase 培养基清洗培养皿和过滤器。然后使用无菌 3 毫升注射器的柱塞将牙龈组织捣碎在过滤器的网眼上。用 30 至 35 毫升冷 DNase 培养基冲洗过滤器，然后离心滤液。
然后将上颚重悬于 1 毫升完全培养基中，并确定活细胞的数量。正如刚刚证明的那样，免疫细胞的分离和加工产生了足够数量的细胞来执行野生型和牙周炎易感动物的牙龈细胞细胞因子分泌模式的离体刺激和表征。事实上，可以分析小鼠牙龈免疫细胞的组成，如这些评估牙周炎易感 LFA 敲除小鼠的 t 和自然杀伤细胞区室的密度图所示。
使用适当的门控策略，还可以测定 TCR β CD4 阳性、TCR β CD8 阳性和 TCR γ δ 阳性 T 细胞以及 NK 和先天淋巴细胞的细胞内细胞因子产生。一旦掌握，如果技术执行得当，可以在 3 小时内分离细胞进行免疫染色。在尝试此过程时，重要的是要记住高效快速地完成所有步骤，只要不作细胞，就将细胞保持在冰上。
按照此过程，可以执行其他方法（如细胞分选）来回答与特定细胞子集的功能相关的其他问题。
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概览
本文介绍了一种从小鼠牙龈中分离和表征免疫细胞的技术。该方法旨在增进对口腔免疫和牙周病的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 口腔生物学
- 牙周病学
背景
- 理解口腔内的免疫反应对于解决牙周疾病至关重要。
- 牙龈免疫细胞在口腔免疫中发挥重要作用。
- 目前的方法可能无法提供足够的活细胞进行详细分析。
- 该技术旨在填补这一空白，允许进行深入的功能研究。
研究目的
- 分离牙龈免疫细胞以进行表征。
- 调查牙周病发病机制中涉及的细胞因素。
- 评估口腔免疫细胞网络。
使用的方法
- 小鼠固定和内脏暴露。
- 在大静脉切口以进行血液冲洗。
- 使用注射器通过左心室注入大量PBS。
- 为进一步分析准备小鼠。
主要结果
- 成功分离出活性牙龈免疫细胞。
- 表征与口腔健康相关的免疫反应。
- 对牙周病发病机制的洞察。
- 下游体外研究的潜力。
结论
- 该技术为研究口腔免疫提供了一个宝贵的工具。
- 它增进了对牙龈组织中免疫细胞动态的理解。
- 未来的研究可以利用这种方法对牙周疾病有更深入的认识。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise isolation and functional profiling of gingival immune cells enables mechanistic de-risking in oral immunology and supports target validation for inflammatory disease research. This workflow provides high-viability cell populations for quantitative phenotyping and ex vivo functional assays, strengthening predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions in immunology and oral health R&D by enabling robust interrogation of tissue-resident immune networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell subsets implicated in oral inflammatory pathogenesis.
- Supports functional target validation through ex vivo cytokine secretion assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune cell contributions to disease models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers viable, phenotypically characterized immune cells for downstream assay development.
- Supports reproducible preparation of biological samples for standardized screening workflows.
- Enables quantitative readouts of immune function for compound evaluation.
- Improves scalability and assay readiness for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant oral models for translational continuity.
- Enables functional biomarker discovery in preclinical oral immunopathology studies.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting oral tissues.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality immune cell preparations for both mechanistic studies and functional screening in oral disease models.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on immune cell roles in oral tissue homeostasis and pathology.
- Screening: Supplies reproducible, viable cell populations for assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine secretion and immune cell phenotypes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant oral models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse oral immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oral immune research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune cell isolation for cross-study comparability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of oral immunology assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and approaches in oral and mucosal immunology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and immune cell handling.
- Demands access to flow cytometry and ex vivo functional assay infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible cell isolation and analysis.
- Adaptation to other mucosal tissues may require protocol optimization.
- Cell viability and yield are sensitive to procedural timing and temperature control.
