使用尺寸排阻ICP-MS进行定量金属蛋白质组学分析的标准

该技术的总体目标是基于已知的金属蛋白标准品，对复杂标准品中的不同金属蛋白进行定量分析。该方法可以解答关于金属在生物学中作用的关键问题。例如，蛋白质的金属状态在疾病中会发生怎样的变化？

该技术的一个关键优势在于，它能够让你在蛋白质的天然状态下测定其金属结合状态。本次演示将由我实验室的博士生Amber Lothian进行。首先，使用Tris缓冲盐水，通过手动研磨或超声处理五分钟，对组织匀浆或细胞培养样品进行均质化处理。

将匀浆在16,000 × g条件下离心5分钟以澄清。收集上清液后，按照文本方案中所述方法测定蛋白质浓度，以标准化总蛋白量。根据制造商的操作规程，预热并调试电感耦合等离子体质谱仪。

使用1%硝酸将金属蛋白标准品稀释至浓度范围为0至500微克/升。为获得在此范围内的标准品，稀释倍数不应超过1:20。通过首先分析七个校准水平来设置进样顺序。

浓度范围为 0 至 500 微克每升，随后为金属蛋白标准品。七个校准水平分别为 0、1、5、10、50、100 和 500 微克每升。接下来，选择目标元素。

此处使用铁、铜、锌、钴和碘，因为这些元素是蛋白质标准品所结合的元素。在采集方法中，通过打开元素选择选项卡，添加待分析的元素及其相应的同位素质量来选择元素。

然后，使用仪器进行样品分析。仪器软件会自动为所分析的每种元素生成校准曲线。利用这些校准曲线确定未知样品中金属的浓度。

根据整体分析结果，通过混合铜、锌超氧化物歧化酶和铁蛋白，制备包含哺乳动物组织中三种最丰富痕量元素的金属蛋白标准品。以每分钟5毫升的流速，用200毫摩尔每升的硝酸铵缓冲液冲洗高效快速色谱（HPLC）泵5分钟。系统冲洗完毕后，将流速设定为0.1毫升每分钟。

连接侧面的排阻柱，将柱子的另一端连接至紫外检测器，并使用峰流管路将检测波长设定为280纳米。以每分钟0.1毫升的增幅逐步增加柱子的流速，直至最终流速达到每分钟0.4毫升。

在此过程中，检查色谱柱管路连接处是否有泄漏。通过观察软件中色谱图上的压力曲线，监测系统压力，确保其不超过色谱柱的耐压上限。以所需的流速用五到十个柱体积的平衡缓冲液对色谱柱进行平衡。

平衡完成后，连接仪器以进行样品分析。设置高效液相色谱方法，以每分钟0.4毫升的流速将缓冲液A泵入色谱柱，持续15分钟。在更改硬件设置前，先将ICPMS置于待机模式。

进入待机模式后，关闭自动进样器的通信，并将样品引入方式切换为其他模式。使用PEEK管将紫外检测器的流出液直接连接到ICPMS的雾化器。启动ICPMS，使仪器预热10至20分钟。

等离子体点燃后，将ICPMS的远程电缆连接到HPLC自动进样器的背面。必须在等离子体点燃后进行此操作，否则由于ICPMS未开启，HPLC系统将自动关闭。

通过首先将采集模式从光谱模式更改为时间分辨采集模式，来调整ICPMS方法以收集LC-ICPMS数据。然后选择待分析的元素，包括铁、铜、锌、钴、碘以及其他任何感兴趣的元素，并设置积分时间。

选择目标元素后，调整采集时间以匹配色谱运行时间。在色谱缓冲液（其中含有铯和锑）流动的条件下，手动调节ICPMS的灵敏度和碰撞池氦气流速。待金属离子计数稳定且相对标准偏差低于5%时，系统即可投入使用。

在高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体质谱（ICPMS）软件程序中创建样品运行列表。样品运行列表包含每个样品的进样顺序，以及数据保存时所使用的文件名称。

检查两个程序中的样品总数是否一致。应先启动ICPMS的样品批次，再启动HPLC，因为HPLC进样会触发ICPMS开始采集数据。如果顺序不正确，将导致数据缺失。

通过注入不同体积的超氧化物歧化酶和铁蛋白混合标准品来生成校准曲线点，注入体积范围为1微升至30微升。最后，在分析数据之前，按照文本方案中所述，分析每种未知样品，如组织、血浆或细胞培养物。

显示了在色谱柱上注入 2000 至 60,000 皮克铁范围内铁蛋白的假象。采用峰面积进行回归分析。分别展示了铜和锌的铜、锌、超氧化物歧化酶的假象谱型。

还展示了使用峰面积生成的回归分析结果。回归分析的结果用于将原始数据（每秒计数）转换为皮克每秒，从而能够对与蛋白质结合的金属量进行定量测定。

该技术可用于鉴定复杂生物样品中的金属蛋白。此处显示的是通过尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法（SEC ICPMS）分离的人类脑组织样品，其中每个峰代表一种不同的目标金属。

即铜、锌或铁。此处显示的是对人血浆样本应用该技术后获得的图谱。样本的复杂性和丰度将影响所观察到的峰的数量。

正如预期，血浆中主要由少数几种金属蛋白组成，包括铜蓝蛋白和转铁蛋白。观看本视频后，您应能充分理解如何设置仪器，以检测复杂样品中金属蛋白的天然状态。一旦掌握，该技术可在三到四小时内成功完成。

这使得每天可分析 20 至 36 个样品。在进行该操作时，重要的是使用适当的金属蛋白标准品，例如，若关注铜和锌，则应使用铜锌超氧化物歧化酶（copper zinc SOD）。此外，缓冲液中还需加入内标物，如铯，以便校正仪器随时间发生的数据漂移。

通过此实验流程，您还可以采用其他形式的质谱技术来回答重要问题。例如，我的样品中存在哪些金属结合蛋白？这可以通过标准的蛋白质消化及质谱肽段测序来实现。

或者通过分析完整且处于天然状态的蛋白质。该技术在发展完善后，可为蛋白质组学领域的研究人员阐明金属蛋白质在阿尔茨海默病等疾病中的作用提供新的途径。请务必注意操作浓硝酸以及临床样本时的安全事项。

应穿戴适当的个人防护装备。