用尺寸排阻ICP-MS标准定量分析Metalloproteomic
2016年4月13日
体积排阻色谱法与电感耦合等离子体质谱法 （ICP-MS） 联用是一种强大的工具，可直接测量生物样品中金属蛋白丰度的变化。在这里，我们描述了一组用于估计与未知蛋白质相关的分子量和金属量的金属标准品。
该技术的总体目标是能够根据已知金属蛋白标准品对复杂标准品中的不同金属蛋白进行定量。这种方法可以回答有关金属在生物学中的作用的关键问题。例如，蛋白质的金属状态在疾病中是如何变化的？
该技术的一个关键优点是它允许您测量蛋白质在其天然状态下的金属状态。演示这项技术的将是我实验室的博士生 Amber Lothian。首先，通过手动下放或使用 Tris 缓冲盐水超声处理 5 分钟来匀浆组织或细胞培养样品。
以 16， 000 倍 G 离心 5 分钟，澄清匀浆。收集所得上清液后，通过测定文本方案中描述的蛋白质浓度来标准化蛋白质总量。使用制造商的协议预热并调整电感耦合等离子体传感器。
使用 1% 的硝酸稀释金属蛋白标准品，使其在 0 至 500 μg/L 的范围内下降。要获得此范围内的标准品，请勿使用超过 1 和 20 的稀释度。通过首先分析七个校准水平来设置进样顺序。
浓度范围为 0 至 500 μg/L，然后是金属蛋白标准品。七个校准水平为 0、1、5、10、50、100 和 500 μg/L。接下来，选择感兴趣的元素。
在这里，使用铁、铜、锌、钴和碘。因为它们是蛋白质标准品所结合的元素。通过打开元素选择器选项卡，并添加要分析的元素及其各自的同位素质量，在采集方法中选择元素。
然后，使用仪器进行样品分析。仪器软件会自动为正在分析的每个元素创建校准曲线。使用校准曲线确定未知样品中的金属浓度。
根据批量分析结果，使用铜、锌超氧化物歧化酶和铁蛋白的混合物生成金属蛋白标准品，其中包括哺乳动物组织中含量最高的三种痕量元素。用 200 毫摩尔硝酸铵缓冲液以每分钟 5 mL 的流速吹扫 Hyperformance 快速色谱或 HPLC 泵 5 分钟。吹扫系统后，将流速设置为零点，每分钟 1 毫升。
并连接侧面的排除列。将色谱柱的另一端连接到 UV 检测器，使用峰管将测量吸光度设置为 280 纳米。以 0 点 1 mL/min 的增量逐渐增加色谱柱的流速，直到达到 0 点 4 mL/min 的最终流速。
发生这种情况时，请检查色谱柱的管道连接是否有任何泄漏。通过观察软件中色谱图上的压力轨迹，监测该系统的压力，以确保其不超过色谱柱要求。让色谱柱在 5 到 10 个柱体积上以所需的流速平衡。
平衡后，连接仪器以进行样品分析。设置 HPLC 方法，以零点每分钟 4 mL 的速度将缓冲液 A 泵送到色谱柱上，持续 15 min。在更改硬件设置之前，将 ICPMS 置于待机模式。
进入待机模式后，关闭自动进样器的通信，并将样品引入更改为其他。使用 PEEK 管将 UV 检测器的流出直接连接到 ICPMS 上的雾化器。打开 ICPMS 的电源，让仪器预热 10 到 20 分钟。
等离子体点燃后，将 ICPMS 的远程电缆连接到 HPLC 自动进样器的背面。等离子体点燃后执行此作。否则，HPLC 系统将自动关闭，因为 ICPMS 未打开。
首先将采集方法从谱更改为时间分辨采集，更改 ICPMS 方法以收集 LC ICPMS 数据。然后，选择要分析的元素。铁、铜、锌、钴、碘以及任何其他感兴趣的元素，并设置积分时间。
选择目标元素后，调整采集时间以匹配色谱的运行时间。使用缓冲液中含有铯和锑的色谱缓冲液手动调整 ICPMS 的灵敏度和碰撞池氦气流速。一旦金属离子计数稳定，并且相对标准偏差值低于 5%，系统就可以使用了。
在 HPLC 和 ICPMS 软件程序中制作样品运行列表。样品运行列表包含每个样品的进样顺序。以及保存数据的名称。
检查列表中的样本总数是否与两个程序匹配。在 HPLC 之前开始 ICPMS 的样品批次，因为 HPLC 注入样品将触发 ICPMS 开始收集数据。如果未按正确的顺序执行此作，则会导致数据丢失。
通过进样不同体积的超氧化物歧化酶和铁蛋白混合标准品生成校准曲线点。注射量从 1 μL 到 30 μL 不等。最后，在按照文本方案中的说明分析数据之前，分析每个未知样品，例如组织、血浆或细胞培养物。
显示了在色谱柱上注入 2000 至 60， 000 pg 铁的铁的错觉。使用峰面积进行回归分析。铜、锌、超氧化物歧化酶的错觉曲线图显示了铜和锌的错觉曲线。
还显示了使用峰面积生成的回归分析。回归分析的结果用于将以每秒计数为单位的原始数据转换为每秒皮克。因此可以定量测定与蛋白质相关的金属量。
该技术可用于鉴定复杂生物样品中的金属蛋白。图中显示了被 SEC ICPMS 分隔的人脑。每一种都代表不同的目标金属。
即铜、锌或铁。这里显示的是人体血浆使用这种技术时获得的痕迹。样品的复杂程度和丰度会影响所见峰的数量。
正如预期的那样，血浆以一些金属蛋白为主，包括铜蓝蛋白和转铁蛋白。观看此视频后，您应该对如何设置仪器以测量复杂样品中金属蛋白的天然状态有很好的了解。一旦掌握，这项技术可以在 3 到 4 小时内成功应用。
这允许在一天内分析 20 到 36 个样品。在尝试此程序时，使用适当的金属蛋白标准品非常重要，例如，如果您对铜和锌感兴趣，请使用铜锌 SOD。以及缓冲液中的内标，例如铯，它允许您校正仪器随时间推移的任何漂移。
按照此程序，您还可以实施其他形式的质谱法来回答重要问题。例如，我的样品中存在哪些金属蛋白？这可以通过酶解和质谱蛋白质肽测序中的标准行程来完成。
或者，通过分析处于天然状态的蛋白质。该技术开发后，可以为蛋白质组学领域的研究人员了解金属蛋白在阿尔茨海默病等疾病中的作用铺平道路。不要忘记使用浓硝酸和临床样品。
应穿戴适当的个人防护装备。
概述
本文描述了一种使用尺寸排阻色谱与感应耦合等离子体质谱（ICP-MS）结合的方法来定量测定金属蛋白。该技术允许测量生物样品中蛋白质中的金属状态，为其在各种生物过程中的作用提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 蛋白质组学
背景
- 金属蛋白在生物系统中扮演着至关重要的角色。
- 了解蛋白质中的金属状态可以揭示疾病机制的见解。
- 传统方法可能无法测量蛋白质的天然状态。
- ICP-MS为金属分析提供了高灵敏度和特异性。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来定量测定金属蛋白。
- 建立估算分子质量和金属含量的标准。
- 分析生物样品中蛋白质的金属状态。
所用方法
- 金属蛋白标准的制备和样品均质化。
- 尺寸排阻色谱分离蛋白质。
- 感应耦合等离子体质谱用于金属定量。
- 生成校准曲线以准确测量金属浓度。
主要结果
- 成功定量了各种生物样品中的金属蛋白。
- 建立了多种感兴趣金属的校准曲线。
- 展示了该方法分析蛋白质天然状态的能力。
- 对金属在生物过程和疾病中的作用的见解。
结论
- 开发的方法对于研究金属蛋白是有效的。
- 它为未来研究金属-蛋白相互作用提供了框架。
- 进一步应用可以加深对健康和疾病中金属蛋白的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative metalloproteomic analysis using SEC-ICP-MS enables biopharma R&D to measure metal-protein interactions in native states, supporting target validation in neurodegenerative disease research. This approach provides predictive confidence by linking trace element imbalances to protein function, informing mechanistic de-risking in Alzheimer's and Parkinson's disease programs. The method facilitates portfolio triage through reproducible, quantitative outputs that clarify metalloprotein abundance changes across disease-relevant biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by quantifying metalloprotein abundances in disease versus control samples.
- Operational Value: Establish trace element-specific calibration curves using copper-zinc SOD and ferritin standards for iron, copper, and zinc quantification.
- Strategic Value: Enable biological de-risking through native-state metal status measurement, reducing uncertainty in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream workflows by resolving metalloproteins via size exclusion prior to ICP-MS detection.
- Operational Value: Address assay standardization and reproducibility through internal standardization with cesium and antimony in chromatography buffer.
- Strategic Value: Highlight screening readiness and platform reuse by enabling 20-36 sample analyses per day after system equilibration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discuss disease relevance by analyzing human brain and plasma samples to identify metalloprotein peaks linked to copper, zinc, and iron.
- Operational Value: Describe continuity from discovery through preclinical validation by using peak area regression to convert raw counts to picograms per second for quantitative comparison.
- Strategic Value: Address risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative outputs that support go/no-go criteria in metalloprotein-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
Position SEC-ICP-MS within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, where quantitative metalloprotein data informs target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by measuring metal status changes in proteins under disease conditions using calibrated trace element detection.
- Screening: Describe assay readiness through reproducible SEC separation and element-specific quantification enabled by external calibration curves.
- Analytics: Highlight measurements and readouts such as peak area conversion to picograms per second, enabling cross-sample comparison of metalloprotein abundance.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by demonstrating applicability to human brain and plasma samples for disease-relevant target validation.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability through standardized hardware setup, software acquisition methods, and sample run list synchronization between HPLC and ICPMS platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative metalloprotein analysis in native state.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via cesium-antimony internal standards and fixed flow rate protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by clarifying metal-protein relationships early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative metalloprotein abundance data across biological systems.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in metalloprotein biochemistry, HPLC operation, and ICP-MS optimization for trace element analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including size exclusion column, UV detector at 280 nm, and ICP-MS with time-resolved acquisition mode.
- Cross-team standardization requirements for sample preparation, normalization by total protein concentration, and injection volume calibration from 1 to 30 microliters.
- Adaptation considerations across model systems such as tissue homogenization, cell culture preparation, and plasma analysis using appropriate metalloprotein standards.
- Practical limitations supported by source material including the need to avoid dilutions exceeding 1:20 for standards and monitor system pressure to prevent column damage during equilibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Bulk Analysis of Metalloprotein Standards using Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (ICP-MS)
2:41
HPLC System Setup and Size Exclusion Chromatography Column Equilibration
4:00
Setting Up and Running Size Exclusion - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (SEC-ICP-MS)
6:41
Results: Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS
8:25
Conclusion
