向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

本方法的总体目标是向冈比亚按蚊递送RNA干扰触发因子，以启动在蛹期发育阶段开始的基因敲低。该方法有助于回答媒介生物学领域的关键问题，并揭示在未成年期或成虫早期发育阶段发挥作用的基因。该技术的主要优势在于，它为研究人员提供了开展快速功能基因组学研究的机会，能够在发育阶段（即以往尚未建立RNA干扰注射方案的蛹期）开始基因敲低。

该方法的可视化演示至关重要，因为注射步骤需要极高的精确度，且蛹在这一发育阶段十分脆弱，操作难以掌握。在选定目标基因后，需确定一段200至800个碱基对的区域，该区域应预测无脱靶效应，并通过标准PCR扩增获得两侧带有T7启动子序列的双链RNA合成模板。随后，利用商业化的体外试剂盒合成双链RNA，并纯化产物。

将最终RNA浓度调整至每微升3微克。接着，使用标准的2%琼脂糖凝胶，将0.5微升双链RNA与模板DNA及标准分子量标记物进行比较。电泳完成后，检测双链RNA条带的质量和长度。

不应出现可见的非特异性产物。双链RNA的迁移速度将慢于模板DNA。储存时，将双链RNA分装成 aliquots，并于-20摄氏度保存。

首先配制快绿 FCF 染料。将染料用无 RNase 水稀释至 0.1%（体积分数）。然后，取 1 微升该溶液加入 1.5 毫升微量离心管中。

将装有样品的管子在 65 摄氏度下加热约三小时，以蒸发水分。然后在使用染料固体前，将管子冷却至少 30 分钟。接下来，用硼硅酸盐玻璃管制备拉制玻璃注射针。

将拉针仪的针尖直径设置为10至30微米。对于NARISHIGE拉针仪，将第一加热器设为100，第二加热器设为70。然后将毛细管针固定在夹具中，开始拉制。

现在，准备注射工作站。选择一个可轻松在显微镜下移动的平台。在平台上，首先用胶带固定一张厚滤纸。

然后，在厚滤纸上用胶带固定一张薄滤纸。接着，向染料固体管中分别加入 10 微升待注射的双链 RNA，并重新悬浮染料。将这些管子置于冰上保存。

现在，收集待注射的蛹。用10毫升去离子水填充一个60毫米的培养皿，并使用塑料移液管将约50只浅色蛹转移至培养皿中。仅使用色素较浅的蛹，因为已经到达中等至深色鞣化程度的蛹会出现表皮损伤，且存活率较低。

显微注射的第一步是打开针头。在显微镜下，使用精细镊子折断针头最远端的尖端。然后使用30号针头和注射器将矿物油反向填充至针头中。

填充后，使用显微注射器排出多余油液。将显微注射器设置为抽取69纳升体积。随后，用制备好的注射用RNA从前端填充针头。

测试双链RNA的点样是否存在异常。针尖堵塞和针头固定不牢是导致问题的主要原因。注射装置准备就绪后，选取一至三只蛹，转移至滤纸载物台上。

使用画笔将蛹调整至背侧表皮可接触的位置。通过按压纸张，吸收蛹体表面多余的水分。用湿润的画笔固定蛹体使其保持静止，同时从前往后以约30度角将针头插入腹部与胸部之间的背侧表皮。

然后，向血淋巴中注射一到两脉冲的双链RNA。如果注射成功，可见染料在体内广泛扩散。注射蛹时，关键是要确保针头仅穿刺背侧表皮。

如果针头穿刺穿透了腹侧表皮，则可在蛹体外部观察到染料标记液体的积聚，或染料会转移到滤纸上。出现此类情况时，必须弃用该蛹。如果染料未在血淋巴中扩散分布，则最可能的原因是针尖被堵塞。

轻微移动针尖，判断是否有RNA和染料释放。若无染料释放迹象，则弃去该蛹。随后评估针尖状态，并在新的蛹上进行下一次注射。

成功注射蛹后，使用湿润的画笔将其轻轻从针头上取下，并移入盛有水的培养皿中，使其完成后续发育。将注射后的蛹置于蚊笼或容器内的培养皿中，在正常饲养条件下培养。成虫食物来源可提供浸泡在棉球中的10%（质量/体积）葡萄糖溶液。

成虫羽化后，将其与对照组进行比较。例如，应每天评估双链SRPN2昆虫的假性肿瘤形成情况。为此，将成虫在零下20摄氏度下冷藏两到三分钟，然后转移至2摄氏度的冷板上进行观察。

观察成虫后，将其放回昆虫饲养室的饲养区域。掌握注射技术后，注射过的蛹羽化频率约为70%。在部分注射过的蛹中，出现了从蛹壳部分羽化的现象，导致蚊虫无法存活。注射组与未注射组蚊虫的羽化时间无延迟差异，且注射的影响不因性别而异。

羽化后十天，与未注射对照组相比，注射蚊虫的存活率未见显著变化。丝氨酸蛋白酶抑制剂SRPN2作为阳性对照，双链LacZ作为双链RNA注射的阴性对照。羽化后三天，通过光学显微镜可观察到注射双链SRPN2成虫体内出现假性肿瘤。

注射八天后，假性肿瘤非常明显。在成虫期蚊子中，大多数注射双链SRPN2的个体通过表皮即可观察到黑色素性假性肿瘤，而对照组则未观察到任何假性肿瘤。注射后第五天，与注射双链LacZ的对照组及未注射对照组相比，注射双链SRPN2蚊子体内的SRPN2蛋白水平显著降低。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用这种新开发的注射方案，将RNA干扰触发物递送至冈比亚按蚊蛹体内。通常，初次接触该方法的研究人员会因蚊蛹不可预测的移动而遇到困难。然而，通过练习正确地定位和稳定蚊蛹，可显著提高注射成功率及注射质量。

掌握该技术后，每只蛹的注射操作约需30秒。随着该技术的建立，我们为媒介生物学领域的研究人员探索和评估冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）在未成年期及成虫早期发育阶段的基因功能铺平了道路。在完成该操作后，可进一步采用蛋白质印迹分析（Western blot analysis）或定量PCR等方法，分别检测目标基因在蛋白或转录水平上的敲低程度。

最终，该技术可帮助鉴定对蚊媒寄生虫传播至关重要的基因，这一方法将有助于我们发现新的靶点，并为开发更有效的病媒控制策略提供新的见解。