Name: RNAi的触发传送到冈比亚按蚊蛹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习在冈比亚按蚊蛹期进行RNA干扰触发物递送的技术，实现基因敲低以研究媒介生物学功能。该方法支持快速功能基因组学研究，揭示成蚊前发育阶段的关键基因作用。

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我们感谢 Flaminia Catteruccia 博士及其研究团队（哈佛大学公共卫生学院，美国马萨诸塞州波士顿）向我们的实验室提供了本研究所用的 G3 蚊株以及 LacZ 模板 DNA。感谢 Adam Jenkins（波士顿学院，美国马萨诸塞州栗树山）在昆虫饲养室维护方面提供的协助。波士顿学院生物系慷慨资助了本技术开发相关的研究工作。

1. 合成与制备dsRNA
<ol>
	<li>在目标基因内确定一个200-800 bp的敲低区域（用于生成相应的dsRNA），该区域预计不会产生可识别的脱靶效应例如，无其他基因内≥18 bp的序列同源性）及阴性对照（例如，一段在靶标昆虫基因组中不存在的异源序列，例如 大肠杆菌lacZ 基因（GenBank 基因 ID：945006）。或者，使用阳性对照（例如，可产生易于观察的表型，例如 SRPN221,22, GenBank 基因 ID：1270169）。靶向该基因的 dsRNA 序列 SRPN2 在 Michel 中定义 等 (2005)21. 
	注：E-RNAi 是一个开源的生物信息学资源，可用于识别此类区域以及设计寡核苷酸引物的过程。23.</li>
	<li>进行标准PCR扩增（即，使用基因组DNA或cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶作用下进行30-35个循环扩增，获得两侧带有T7启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）的双链RNA合成模板，随后利用商业化试剂盒进行双链RNA的制备与纯化 体外 按照制造商说明书使用转录试剂盒。使用 SRPN2 PCR扩增条件及引物信息如An中所述 等 (2011)22.</li>
	<li>通过260 nm波长下的紫外吸收光谱法定量纯化的RNA扩增子产量，并调整至所需浓度（例如，3 µg/µl）溶于无RN酶的水中。
	<ol>
		<li>若遇到RNA浓度偏低的问题，可通过以下方法减少液体体积：将样品在室温下使用真空离心浓缩仪离心，或对样品进行冻干后重新溶解于较小体积的水中。样品冻干所需时间取决于初始样品体积和双链RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有1×TBE或TAE缓冲液并用溴化乙锭（EtBr）染色的2%琼脂糖凝胶上，检测dsRNA的质量和长度，并同时检测转录反应所用的模板DNA。dsRNA的迁移速度比模板DNA更慢。通过确认无非特异性dsRNA产物，可评估其质量；通过与标准DNA Marker比较产物大小，可评估其长度。 
	注意：溴化乙锭（EtBr）是一种强效诱变剂，应谨慎操作。 
	注意：当dsRNA浓度为3 µg/µl时，取0.5 µl样品已足以在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上进行可视化检测。</li>
	<li>将dsRNA储存于-20 °C，直至使用。多次冻融循环可能导致降解，因此对于大量dsRNA应分装保存。</li>
</ol>
2. 准备快绿FCF染料（FGD）管
<ol>
	<li>将快绿FCF染料从储备液（染料含量≥85%）用无RNase水稀释至0.1%（v/v），配制成工作液。</li>
	<li>用移液器将1 µl染料加入1.5 ml微量离心管底部。</li>
	<li>将离心管置于65 °C金属浴中加热约3小时，使液体完全蒸发，随后于室温下静置至少30分钟，冷却后备用。此干燥的固体染料可在双链RNA重悬液中重新溶解。</li>
</ol>
3. 拉制注射针头
<ol>
	<li>使用加热式玻璃微电极拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃针，使其尖端直径达到 10–30 µm。拉制参数设置为：加热调节档位 1 = 100，加热调节档位 2 = 70。</li>
	<li>为避免损伤针尖的精细结构，将拉制好的玻璃针水平放置于培养皿中，并置于一条成型腻子条上。 
	&#8203;注意：有关毛细玻璃针拉制方法的更多详细信息，可参见疟疾研究与参考试剂资源中心（MR4）手册24。</li>
</ol>
4. 准备注射站
<ol>
	<li>准备所需材料：拉制成细尖的玻璃毛细注射针、显微注射仪、薄滤纸和厚滤纸、培养皿、移液管、毛笔及解剖显微镜。</li>
	<li>按照显微注射仪使用说明书中的指示设置显微注射仪，并将每次脉冲的注射体积调节至所需体积（例如，每脉冲最大69 nl）。</li>
	<li>在显微镜下易于操作的平台（例如，泡沫塑料试管架的平整面）上，将两张滤纸叠放，薄滤纸置于上层，并用胶带固定边缘。</li>
	<li>将每种dsRNA溶液分别用10 µl有色染料溶液重悬，置于冰上保存。</li>
</ol>
5. 收集蛹用于注射
<ol>
	<li>用一个小的 60 mm × 15 mm 培养皿加入 10 ml 去离子水，使用一次性塑料移液管从昆虫饲养盘中收集约 50 只浅色蛹（化蛹后前 24 小时内）。</li>
	<li>去除任何具有中度至深色表皮鞣化（黑化）的蛹。 
	&#8203;注意：一旦表皮开始鞣化，穿透表皮将变得更加困难，注射会导致显著升高的致死率。</li>
</ol>
6. 双链RNA注射
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，用一对精细镊子折断注射针的远端尖端。</li>
	<li>通过使用带有3英寸、30号针头的注射器将矿物油从针尾注入注射针内，完成注射针的准备，并用显微注射仪排出多余的油。</li>
	<li>从前端将最大量的dsRNA充满注射针，并在显微镜下释放一次脉冲，以确认液体能够正常排出。如果未吸入和/或排出液体，请检查针尖远端是否有堵塞，并确保注射针牢固地固定在显微注射仪中。</li>
	<li>挑选1–3只蛹，将其放置在滤纸上。</li>
	<li>使用画笔将蛹在滤纸上调整至背侧表皮朝上，并用画笔轻压滤纸以吸除多余的水分。</li>
	<li>用画笔尖端固定蛹体，以约30°角将注射针插入蛹体背侧表皮的胸腹部交界处，注射方向应指向蛹体后端，针头应沿前向后方向移动。</li>
	<li>向血淋巴中注射两脉冲（每脉冲69 nl）浓度为3 µg/µl的dsRNA溶液，并观察颜色在体内是否均匀分布。若未观察到颜色扩散，可轻微调整注射针位置以清除针尖堵塞，然后重复液体输送。</li>
	<li>用湿润的画笔轻轻将蛹从针头转移到水中进行培养。蛹在轻微接触时应能粘附在画笔上。</li>
</ol>
7. 注射后条件
<ol>
	<li>将注射后的蛹放入具有适宜气流的蚊笼中的培养皿内例如，带网罩或网盖的笼子或容器）。蛹的饲养条件应始终保持在27 ± 3 °C的温度、75 ± 5%的湿度，并置于16:8小时的光暗循环环境中。</li>
	<li>配制10% (w/v)的葡萄糖溶液，并将浸透该溶液的棉球置于蚊子饲养笼的网面上，供成蚊取食。</li>
</ol>
8. 评估基因敲低效果
<ol>
	<li>在预定的时间点，评估实验组（注射dsRNA的昆虫）与对照组相比的表型变化。
	<ol>
		<li>评估 dsSRPN2 和 dsLacZ 将成虫在 -20 °C 下冷藏约 2–3 分钟以每日观察昆虫，随后转移至 2 °C 的冷板，利用体视显微镜在 15 倍明场照明下检查是否存在假性肿瘤形成。评估完成后，将成虫重新放回饲育条件（27 ± 3 °C，75 ± 5% 湿度）。 
		注意：本实验方案中使用的实验组和对照组 dsRNA 为 dsSRPN2 和 dsLacZ分别为。对照有许多合适的选择；但建议使用表型和/或表达易于观察的阳性对照（例如，通过解剖显微镜观察）和/或定量分析[例如，学习该技术时应使用定量实时PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）等方法。 SRPN2 通过蛋白质印迹法和qRT-PCR分别对蛋白质和转录本进行定量分析的方法详见Michel 等 (2005)21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

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目前用于在蚊子中诱导非转基因RNA干扰（RNAi）的方法包括将双链RNA（dsRNA）直接注射到成虫血腔12,13，或通过幼虫摄食经RNAi触发物包被的纳米颗粒14-17，或摄食基于微藻的dsRNA分子18。虽然以成虫为靶标具有极高价值，但该方法可能遗漏大量在早期发育阶段发挥功能的基因。通过幼虫摄食启动的基因沉默，可能由于蛋白质在蛹期的存留程度存在差异，导致成虫阶段表型不一致。因此，引入一种专门针对蛹期发育阶段启动RNAi的新方法，将有助于更全面地评估基因在成虫前发育阶段的功能，同时增强对成虫阶段基因功能的分析能力。与基于dsRNA注射或表达的基因沉默方法类似，基因沉默的持续时间无法准确预测。因此，应在感兴趣的发育阶段检测目标基因的转录本或蛋白质水平。尽管我们在注射SRPN2 dsRNA的动物中观察到SRPN2蛋白水平在注射后第5天仍持续降低，但不同靶标蛋白的周转率和半衰期可能存在差异。此外，必须确保用于注射的dsRNA浓度足够高，并且在琼脂糖凝胶上显示完整无降解。若基因沉默效果不理想，建议实验人员重新评估这些因素，并针对特定基因靶标通过实验经验性地优化dsRNA的使用浓度。
我们描述了一种在冈比亚按蚊（An. gambiae）发育的蛹期启动RNA干扰的方法。该方法通过显微注射将dsRNA直接导入早期蛹的血腔，并利用染料标记的dsRNA评估注射质量。能够可视化注射质量是确保基因有效沉默的关键改进，而这一方面在以往大多数针对成虫阶段的dsRNA实验方案中尚未被考虑。通过在蛹期发育起始阶段进行干预，可对可能在此关键发育时期或成虫早期阶段发挥功能的基因进行功能评估。此外，该方法可能实现将dsRNA递送至细胞，并在变态过程中可及、但在完全发育的成蚊中较难接近的细胞中建立RNA干扰。
Harker最近进行的一项微阵列分析 等 (2012) 鉴定出 560 An. gambiae 在从胚胎到成虫的不同发育阶段中，表达水平至少上调或下调4倍的转录本。在鉴定出的560个转录本中，有309个在蛹期发育过程中表达上调27这些发现表明，蚊子在发育过程中存在大量差异基因表达的需求，其中包括蛹期发生的基因表达，这一阶段是生物体经历变态的时期。在包括许多昆虫物种中 An. gambiae，参与发育等过程的基因（即蛹期表皮蛋白和几丁质结合蛋白27-31 和免疫反应（即，Toll受体样蛋白）27,32-34 在蛹期高度表达。一旦完全成形的成虫羽化，基因表达仍会持续，以响应环境和生理变化35值得注意的是，在成年早期发育过程中，发育相关基因的表达有所增加（即成虫角质层和肌浆蛋白36，以及其他关键基因（即，精子特异性蛋白和细胞色素P450代谢酶）27,36.
本方案开发中使用的阳性对照 SRPN2 是一种源自An. gambiae的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）。SRPN2 在昆虫黑色素化反应的负向调控中发挥重要作用，而黑色素化是昆虫中一种广谱的先天免疫应答21,22。在成蚊中敲低SRPN2会导致假性肿瘤的形成21,22，该表型可通过光学显微镜轻松观察到。鉴于这一明显表型可在活体昆虫中轻易评分，我们选择SRPN2作为初期蛹期RNAi注射的靶基因。此外，SRPN2在所有发育阶段均有表达37，因此是蛹期RNAi注射及在早期成虫中评估基因功能的理想靶点。我们证明，本研究建立的方法能够通过蛹期注射dsRNA，诱导成虫产生类似的黑色素性假性肿瘤表型。在本方案的开发过程中，我们发现，在蛹发育早期（即幼虫-蛹蜕皮后的前24小时）进行注射，对获得最佳的成虫羽化率至关重要。若注射后羽化率较低，我们建议更精确地对幼虫进行分期，以获得表皮硬化程度较低的蛹，确保在早期蛹阶段完成注射。此外，尽量减少对表皮的损伤可提高羽化率，而在注射过程中增加放大倍数有助于确保仅穿刺动物的预定区域。若注射针穿透至腹侧表皮，可见染料标记的液体在蛹体外聚集，或浸润滤纸。强烈建议弃用任何具有多个表皮穿刺孔的蛹。
由于许多实验室在成蚊注射操作方面拥有丰富的经验，先前已确定的显微注射方法只需经过简单的方案修改，即可适用于蛹期RNAi实验。总体而言，本方法旨在使研究人员能够扩展可进行反向遗传学分析的时间窗口，从而进一步推动支持新型媒介控制策略开发的研究。有趣的是，在其他物种（如Rhodnius prolixus和Spodoptera frugiperda）中开展的实验表明，当基因沉默在成虫前阶段启动时，其效应往往显著更强38,39。在发育的各个阶段，RNAi介导的基因敲低均需考虑基因沉默的速度与持续性，以及靶基因编码蛋白的稳定性。理想的RNAi靶基因通常是那些编码半衰期短、周转率高的蛋白或RNA的基因11,40。
尽管转基因RNAi策略也可用于解决在成年前阶段RNAi作用的快速性和持久性问题，但转基因技术存在诸多缺点（例如，生成转基因品系所需时间、用于蚊虫交配以获得可调控dsRNA表达昆虫的实验周期，以及转基因品系的保种维护）。相比之下，本方案提供了一种更为简便且快速的方法，可在蛹期发育阶段启动基因敲低，并靶向那些在变态过程中形成且易于接触、但在成虫中较难接近的细胞类型。使用染料标记的dsRNA悬浮液，可方便地评估注射是否成功以及引入物质在蛹体内的分布情况。我们关于蛹期注射个体成虫中肿瘤形成起始时间的数据，与在蛹期即启动RNAi介导的基因敲低结果一致。在使用G3蚊虫品系及本实验室饲养条件下，对羽化后3至5天的成虫进行注射，最早可在注射后10天观察到成虫中黑色素样假性肿瘤的形成；而通过早期蛹期注射，最早在注射后5天即可观察到明显的黑色素样假性肿瘤形成即，羽化后三至四天）。这些数据表明，该方法能够在此前研究较少的发育阶段启动基因敲低即，蛹期发育）。由于幼虫各龄期的表皮均具有半透明特性，本染料标记方法也可能有助于开发新的幼虫注射方案。本研究中所使用的对照需要发育至成虫阶段才能显现基因敲低表型，而未来针对早期蛹注射后蛹期特异性表型的实验，将有助于进一步拓展该方法至其他发育时期（如晚期蛹发育）的应用。综上所述，本方法提供了一种有效的RNAi技术方案，可实现从蛹期启动RNAi介导的基因敲低，从而扩展了媒介昆虫研究领域可用的功能基因组学工具。

疟疾是一种由蚊子传播的传染病，每年影响数以百万计的个体。世界卫生组织（WHO）报告称，2013年约有58.4万人死于疟疾，其中78%为五岁以下儿童1。引起人类疟疾的病原体是属于Plasmodium属的顶复门寄生虫，通过雌性按蚊（Anopheles）在人类宿主之间传播。当蚊子从感染者体内吸血时获得病原体，随后在下一次吸血过程中将具有感染性的寄生虫注入未感染的个体体内，从而完成传播。在Anopheles属中，Anopheles gambiae是传播能力最强的物种，也是撒哈拉以南非洲地区最主要的疟疾传播媒介1-3。
目前，通过使用杀虫剂来控制蚊媒仍是降低人类疟疾负担的主要方法。尽管自20世纪60年代以来杀虫剂的使用已被证明极为有效，但杀虫剂抗性的上升促使人们需要开发新型杀虫剂和替代性的媒介控制策略4-7。2010年，向世界卫生组织报告的63个国家中有49个报告了疟疾媒介中存在杀虫剂抗性现象1。此外，IR Mapper工具利用同行评审文献评估非洲热带地区的抗性数据，报告指出在2001年至2012年期间，蚊媒对拟除虫菊酯类和滴滴涕（DDT）的抗性分别上升了46%和27%7。
RNA干扰（RNAi）于20世纪90年代初被发现，是一种可用于使矮牵牛植物中的基因失活的技术8,9 以及在真菌中 Neurospora crassa9,10不久之后，1998年，RNAi 首次被报道于 秀丽隐杆线虫 通过注射或饲喂方法引入反义RNA或双链RNA（dsRNA），以在动物模型中降低基因表达水平9,11自发现以来，RNAi 通过一种高度选择性的转录后基因沉默机制，使研究人员能够利用反向遗传学快速探究目的基因的功能作用，从而彻底改变了功能基因组学的研究。在某些生物体中，例如 黑腹果蝇，表达干扰RNA构建体的转基因生物在基因敲低（KD）中已得到广泛应用并取得显著成功。尽管转基因在 An. gambiae 由于RNAi已被应用并可能适用于大规模筛选，而转基因蚊株的构建则既费时又费力，通常需要两到三个月才能从目标基因的鉴定完成合适的转基因品系的建立12目前，基因敲低（KD）的主要方法是 An. gambiae 通过在成虫阶段将针对特定基因的dsRNA注射到血淋巴中实现12,13该过程通常需要约一个月即可完成从目标基因的鉴定到基因敲低效果的评估，相较于转基因方法显著更快。12. 近期已建立了幼虫阶段的RNAi方法 An. gambiae 和 埃及伊蚊 通过纳米颗粒喂养14-17 或通过口服基于微藻的dsRNA分子18，为发育早期阶段的功能基因组学分析提供了机会。在直接注射、饲喂和纳米颗粒递送方法中，dsRNA 由靶细胞自主摄取，并被 Dicer 酶切割成 21-25 个核苷酸长度的片段 &#34;小干扰RNA&#34; (siRNAs)19,20这些siRNA随后被整合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，其中一条链将被丢弃，使与RNA结合的RISC复合体能够结合并切割靶mRNA，从而降低其水平并抑制其翻译。19,20.
蚊子生物学中的许多内在特征会调节其媒介能力，包括宿主偏好（例如，嗅觉、味觉）、交配、繁殖和免疫。鉴于这些生物学过程的重要性，通过遗传或药理学手段对其进行调控，可能为媒介控制提供新的机遇，包括克服杀虫剂抗性，并为更广泛整合的媒介管理策略提供新工具。利用功能基因组学来评估调控这些内在生物学特征的基因功能，将有助于发现新的靶点，并加深我们对如何有效开发更高效防控策略的理解。本文描述了一种在冈比亚按蚊（An. gambiae）蛹期启动RNA干扰（RNAi）的快速注射方法。我们观察到，在蛹期注射RNAi触发物，可在成虫早期阶段即观察到相应的表型，即比在成虫羽化后才启动基因沉默更早地观察到效应。该方法可实现从蛹期发育阶段开始并延续至成虫阶段的基因沉默，使得在蛹期发育过程中启动的基因沉默能够持续存在，并影响成虫早期血淋巴可及的细胞类型，以及在变态过程中比在成虫中更易被血淋巴接触的细胞类型，例如成虫羽化后附肢中所含的感觉神经元。

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 注射仪</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 脚踏开关</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微量移液器拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>亮蓝 FCF 染料</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>可用无毒食用染料替代。</td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>剪去尖端约&amp;frac14;英寸以形成更宽的开口。</td></tr><tr><td>Whatman &amp;ldquo;薄型&amp;rdquo;滤纸&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>此为直径 9 cm 的 Grade 1 滤纸，但可根据注射垫大小进行调整。</td></tr><tr><td>Western blot &amp;ldquo;厚型&amp;rdquo;滤纸</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>此为通常用于 Western blot 的滤纸。</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>画笔（0 号）</td><td>Michael&amp;rsquo;s Art</td><td>10474940</td><td>画笔型号和品牌可根据可获得性及用户偏好调整。</td></tr><tr><td>解剖用光学显微镜</td><td>&amp;nbsp;----&amp;nbsp;</td><td>-----</td><td>可根据可获得性及用户偏好选择不同型号。</td></tr></tbody></table>

向anopheles gambiae蛹体内递送rnai触发物

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA干扰（RNAi）是真核生物中一种自然发生的现象，作为一种反向遗传学技术，可在实验室中用于功能基因组学研究，具有极高的应用价值。通过该技术选择性地敲低特定基因，研究人员能够通过评估功能缺失表型，快速揭示多种生物中大量基因的生物学功能。在主要的人类疟疾传播媒介中 Anopheles gambiae，目前用于降低靶基因功能的主要方法是将双链RNA（dsRNA）注射到成蚊的血腔中。尽管该方法已取得成功，但在成蚊中进行基因敲低会排除对在未成熟阶段表达并可能发挥功能的基因，以及在成蚊中仅于少量细胞中表达的基因的功能评估。本文描述了一种注射方法 丝氨酸蛋白酶抑制剂 2 (SRPN2) 在蛹发育早期阶段注射 dsRNA，并通过检测目标蛋白水平降低以及黑化假性肿瘤的形成来验证 SRPN2 蛋白的表达敲低 SRPN2 敲低成蚊。这种明显的表型此前已有报道，见于成虫阶段的基因敲低研究 SRPN2 功能，并通过以下方式重现了这种成年表型 SRPN2 在蛹期发育阶段启动基因敲低。当与染料标记的dsRNA溶液联合使用时，该技术可通过简单的光学显微镜观察，直观评估注射质量及dsRNA在血腔中的分布情况。

在蛹期早期（表皮鞣化程度较低时）进行注射，可获得最佳的基因敲低（KD）效果（图1A，左图；1B）。注射后蛹死亡率随表皮鞣化和硬化程度增加而升高，通常在发育24小时后更为明显（图1A，中图和右图）。蛹的发育速率可能因昆虫饲养条件和个体密度不同而有所差异24,25；因此，最好通过肉眼观察色素沉积情况来判断发育阶段。
注射过程中，将毛细玻璃针以约30°的角度从前向后插入昆虫背部体壁（图2A）。当针头插入并注入dsRNA和0.01%（w/v）FGD后，可见染料在血淋巴中广泛分布（图2B）。
对注射了0.01%（w/v）FGD的蛹进行成虫羽化评估，结果显示平均羽化率为70%，而未注射对照组的羽化率为96.7%（图3A）。值得注意的是，在大量未能存活的蚊虫中观察到从蛹壳部分羽化的现象（图3B）。注射个体在羽化时间上未表现出延迟（图4A），且对任一性别均无偏向性影响（图4B）。对成虫羽化后存活情况的进一步评估持续至羽化后第10天，结果显示对羽化后成虫的存活无明显影响（图4C）。
通过SRPN2基因敲低相关的黑色素假性肿瘤（深色色素组织簇）表型作为敲低的阳性对照，以及dsLacZ注射后无相关表型作为阴性对照，来评估敲低效果的质量21,22。注射后第8天（出蛹后第6-7天）对羽化的成蚊进行评分。在93.5%的dsSRPN2成蚊中可通过表皮观察到黑色素假性肿瘤（图5A和5B），而在dsLacZ成蚊中则未观察到（0%）（图6A）。解剖色素斑块后可识别出深黑色素化组织的簇集（图5C）。假性肿瘤最早在出蛹后第3天即可在成蚊表皮上观察到，且在部分dsSRPN2个体的血淋巴和肠道组织中也存在（数据未显示）。在注射后第5天（成蚊早期阶段），dsSRPN2组血淋巴蛋白提取物中的SRPN2水平显著降低，而dsLacZ组或未注射组则无此变化（图6B）。
<img alt="昆虫发育阶段；幼虫存活率；实验比较；最佳至较差存活率。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：蛹期注射dsRNA的发育阶段选择。 在蛹发育早期注射dsRNA可获得最佳存活率，并顺利进入成虫阶段。在化蛹后0–24小时内，可见较低程度的表皮色素沉积（A，左图；B）。若在注射前蛹体表皮已发生硬化变暗（A，中图和右图），则导致中等至较差的存活率。
<img alt="胚胎注射实验；注射与未注射胚胎的比较显微图像。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：染料标记的 dsRNA 的注射位置及分布情况。（A）以约 30° 角度，从前向后方向，将染料标记的 dsRNA 注射至背侧表皮。(B) 染料在蛹期血淋巴中明显分布。dsRNA 注射体积为 138 nl，含 0.01% FGD (w/v) 标记。
<img alt="显示羽化率、昆虫发育的柱状图；标注的昆虫解剖显微图像。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：注射后的成虫羽化情况。（A）注射0.01% FGD（w/v）的蛹中，有70%成功羽化（n = 60），而未注射对照组的羽化率为96.7%（n = 60）。实验共进行三次生物学重复。（B）大量未能存活的蚊虫表现出蛹壳部分羽化现象。误差条表示均值的标准误（SEM）。
<img alt="实验结果：注射对羽化率和存活率影响的柱状图、饼图和折线图。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4：羽化率、性别评估及成虫存活率。（A）蛹期注射0.01% FGD后，羽化时间与未注射蛹相比无显著差异（24小时：80%，48小时：20%）；未注射蛹为24小时83%、48小时17%。（B）注射0.01% FGD的蛹羽化出的成虫中，雌雄比例相近（雌性48%，雄性52%），未注射蛹羽化个体中亦观察到类似比例（雌性52%，雄性48%）。（C）生存分析显示，注射0.01% FGD对成虫存活率无显著影响，观察期至羽化后第10天。数据来自三次独立实验，包括注射0.01% FGD的蛹（n = 60）和未注射蛹（n = 60），雌雄数量相等。误差线表示均值标准误（SEM）。
<img alt="显微镜下dsSRPN2与dsLacZ处理昆虫解剖结构比较；近观结构分析。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：假肿瘤阳性对照表型反映基因敲低成功。 在注射dsSRPN2的成年蚊子中，第8天观察到（A）腹部和（B）胸部体壁出现假肿瘤，而注射dsLacZ的蚊子未见此现象。（C）体壁高倍放大（400X）图像（a）及色素斑块解剖（b）显示大量深黑色素化细胞聚集。
<img alt="dsSRPN2对动物假性肿瘤减少作用的柱状图和蛋白质印迹分析。" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：假性肿瘤形成情况及SRPN2蛋白水平下降的定量分析。（A）蛹期注射后，93.5%的dsSRPN2成虫（n = 21）出现假性肿瘤，而dsLacZ对照组为0%（n = 19）。结果为注射后第8天获得。（B）蛋白质印迹分析（左图）显示，注射dsSRPN2个体的SRPN2蛋白水平降低，而dsLacZ组或未注射组的血淋巴蛋白提取物（注射后第5天）未见降低。结果基于三次独立实验。抗SRPN221和抗SRPN326一抗的稀释比例分别为1:1,000和1:2,000。二抗为山羊抗兔IgG-HRP（产品编号sc-2004，Santa Cruz Biotechnology，Dallas TX），稀释比例为1:5,000。所有蛋白水平（右图）通过条带强度（ImageJ软件，NIH，Bethesda，MD）进行定量，以SRPN3为内参进行标准化，并采用非配对t检验进行统计学比较。P &lt;0.05：*；P ≥0.05：n.s.（无显著差异）。误差线表示均值的标准误（SEM）。

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中，利用RNAi在成虫前阶段靶向基因的能力受到限制。本文描述了一种通过在蛹期发育阶段直接注射实现基因功能下调的RNAi实验方案。

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

RNA干扰（RNAi）是真核生物中一种自然发生的现象，是一种在实验室中极具价值的工具，可用于……

本方法的总体目标是向冈比亚按蚊递送RNA干扰触发因子，以启动在蛹期发育阶段开始的基因敲低。该方法有助于回答媒介生物学领域的关键问题，并揭示在未成年期或成虫早期发育阶段发挥作用的基因。该技术的主要优势在于，它为研究人员提供了开展快速功能基因组学研究的机会，能够在发育阶段（即以往尚未建立RNA干扰注射方案的蛹期）开始基因敲低。该方法的可视化演示至关重要，因为注射步骤需要极高的精确度，且蛹在这一发育阶段十分脆弱，操作难以掌握。在选定目标基因后，需确定一段200至800个碱基对的区域，该区域应预测无脱靶效应，并通过标准PCR扩增获得两侧带有T7启动子序列的双链RNA合成模板。随后，利用商业化的体外试剂盒合成双链RNA，并纯化产物。将最终RNA浓度调整至每微升3微克。接着，使用标准的2%琼脂糖凝胶，将0.5微升双链RNA与模板DNA及标准分子量标记物进行比较。电泳完成后，检测双链RNA条带的质量和长度。不应出现可见的非特异性产物。双链RNA的迁移速度将慢于模板DNA。储存时，将双链RNA分装成 aliquots，并于-20摄氏度保存。首先配制快绿 FCF 染料。将染料用无 RNase 水稀释至 0.1%（体积分数）。然后，取 1 微升该溶液加入 1.5 毫升微量离心管中。将装有样品的管子在 65 摄氏度下加热约三小时，以蒸发水分。然后在使用染料固体前，将管子冷却至少 30 分钟。接下来，用硼硅酸盐玻璃管制备拉制玻璃注射针。将拉针仪的针尖直径设置为10至30微米。对于NARISHIGE拉针仪，将第一加热器设为100，第二加热器设为70。然后将毛细管针固定在夹具中，开始拉制。现在，准备注射工作站。选择一个可轻松在显微镜下移动的平台。在平台上，首先用胶带固定一张厚滤纸。然后，在厚滤纸上用胶带固定一张薄滤纸。接着，向染料固体管中分别加入 10 微升待注射的双链 RNA，并重新悬浮染料。将这些管子置于冰上保存。现在，收集待注射的蛹。用10毫升去离子水填充一个60毫米的培养皿，并使用塑料移液管将约50只浅色蛹转移至培养皿中。仅使用色素较浅的蛹，因为已经到达中等至深色鞣化程度的蛹会出现表皮损伤，且存活率较低。显微注射的第一步是打开针头。在显微镜下，使用精细镊子折断针头最远端的尖端。然后使用30号针头和注射器将矿物油反向填充至针头中。填充后，使用显微注射器排出多余油液。将显微注射器设置为抽取69纳升体积。随后，用制备好的注射用RNA从前端填充针头。测试双链RNA的点样是否存在异常。针尖堵塞和针头固定不牢是导致问题的主要原因。注射装置准备就绪后，选取一至三只蛹，转移至滤纸载物台上。使用画笔将蛹调整至背侧表皮可接触的位置。通过按压纸张，吸收蛹体表面多余的水分。用湿润的画笔固定蛹体使其保持静止，同时从前往后以约30度角将针头插入腹部与胸部之间的背侧表皮。然后，向血淋巴中注射一到两脉冲的双链RNA。如果注射成功，可见染料在体内广泛扩散。注射蛹时，关键是要确保针头仅穿刺背侧表皮。如果针头穿刺穿透了腹侧表皮，则可在蛹体外部观察到染料标记液体的积聚，或染料会转移到滤纸上。出现此类情况时，必须弃用该蛹。如果染料未在血淋巴中扩散分布，则最可能的原因是针尖被堵塞。轻微移动针尖，判断是否有RNA和染料释放。若无染料释放迹象，则弃去该蛹。随后评估针尖状态，并在新的蛹上进行下一次注射。成功注射蛹后，使用湿润的画笔将其轻轻从针头上取下，并移入盛有水的培养皿中，使其完成后续发育。将注射后的蛹置于蚊笼或容器内的培养皿中，在正常饲养条件下培养。成虫食物来源可提供浸泡在棉球中的10%（质量/体积）葡萄糖溶液。成虫羽化后，将其与对照组进行比较。例如，应每天评估双链SRPN2昆虫的假性肿瘤形成情况。为此，将成虫在零下20摄氏度下冷藏两到三分钟，然后转移至2摄氏度的冷板上进行观察。观察成虫后，将其放回昆虫饲养室的饲养区域。掌握注射技术后，注射过的蛹羽化频率约为70%。在部分注射过的蛹中，出现了从蛹壳部分羽化的现象，导致蚊虫无法存活。注射组与未注射组蚊虫的羽化时间无延迟差异，且注射的影响不因性别而异。羽化后十天，与未注射对照组相比，注射蚊虫的存活率未见显著变化。丝氨酸蛋白酶抑制剂SRPN2作为阳性对照，双链LacZ作为双链RNA注射的阴性对照。羽化后三天，通过光学显微镜可观察到注射双链SRPN2成虫体内出现假性肿瘤。注射八天后，假性肿瘤非常明显。在成虫期蚊子中，大多数注射双链SRPN2的个体通过表皮即可观察到黑色素性假性肿瘤，而对照组则未观察到任何假性肿瘤。注射后第五天，与注射双链LacZ的对照组及未注射对照组相比，注射双链SRPN2蚊子体内的SRPN2蛋白水平显著降低。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用这种新开发的注射方案，将RNA干扰触发物递送至冈比亚按蚊蛹体内。通常，初次接触该方法的研究人员会因蚊蛹不可预测的移动而遇到困难。然而，通过练习正确地定位和稳定蚊蛹，可显著提高注射成功率及注射质量。掌握该技术后，每只蛹的注射操作约需30秒。随着该技术的建立，我们为媒介生物学领域的研究人员探索和评估冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）在未成年期及成虫早期发育阶段的基因功能铺平了道路。在完成该操作后，可进一步采用蛋白质印迹分析（Western blot analysis）或定量PCR等方法，分别检测目标基因在蛋白或转录水平上的敲低程度。最终，该技术可帮助鉴定对蚊媒寄生虫传播至关重要的基因，这一方法将有助于我们发现新的靶点，并为开发更有效的病媒控制策略提供新的见解。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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