Name: 采用组合运用各种方法，定义质膜交付在轴突分支和神经元形态发生中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 学习利用活细胞成像与生化分析相结合的方法，研究SNARE介导的胞吐作用在Netrin-1依赖性轴突分支中的时空动态。该技术为神经发育研究提供了高分辨率的可量化观察手段。

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本工作由美国国立卫生研究院资助：RO1-GM108970（SLG）和 F31-NS087837（CW）。

研究伦理声明：本文所述所有涉及动物的实验均须遵守北卡罗来纳大学动物护理委员会（UNC Committee on Animal Care）的规定以及美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的标准。
1. 解离皮层神经元的制备与接种
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 并随后进行颈椎脱位，处死孕鼠。取出胚胎第 15.5 天（E15.5）小鼠的全脑，并从每个半球显微解剖分离出皮层。有关小鼠胚胎皮层显微解剖的详细操作步骤，请参见 Viesselmann et al8。</li>
	<li>将不超过 4 个皮层组织置于无菌 1.6 ml 微管中，加入 1 ml&#160;解剖液。加入 120 μl 的 10 倍浓度胰蛋白酶，轻轻颠倒混匀 3–5 次。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，以接种细胞培养皿。注意：一个皮层半球大约可提供三百万个细胞。
	<ol>
		<li>对于 SDS 抗性 SNARE 复合物生化检测实验，每 35 mm 培养皿接种六百万个细胞，每种实验条件使用两个培养皿。注意：当比较多个实验条件时，使用 6 孔板可简化操作。</li>
		<li>对于分支形态分析实验，将神经元接种在经硝酸清洗的圆形盖玻片上，接种密度为每 35 mm 培养皿 250,000 个细胞；若用于微分干涉差（DIC）成像观察轴突分支，则接种密度为每 35 mm 培养皿 150,000 个细胞。上述密度可避免细胞过度拥挤，并有利于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于活细胞全内反射荧光（TIRF）显微镜观察，将每转染样本两百万个神经元重悬于室温的核转染溶液中。
	<ol>
		<li>将 100 μl 细胞悬液加入含有 10 μg VAMP2-pHlourin 表达质粒的微管中，按照制造商提供的方案使用核转染仪进行电穿孔9。</li>
		<li>转染完成后立即加入 500 μl 胰蛋白酶终止液，将细胞悬液从电转杯中取出，并以每 35 mm 多聚赖氨酸（PDL）包被的玻璃底培养皿 400,000 个细胞的密度接种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有皮层神经元接种于 2 ml 无血清培养基中。</li>
</ol>
2. SNARE 复合物形成实验
注意：SDS 抗性 SNARE 复合物的处理和分析按照原始文献10所述方法进行，并进行了如下所述的修改。有关此处所用抗体的经验证替代抗体，请参见材料部分。
<ol>
	<li>刺激E15.5皮层神经元2天 体外 （DIV）用250 ng/ml netrin-1或对照溶液处理1小时，随后裂解。</li>
	<li>在处理样品前，将离心机预冷至 4 °C，水浴锅温度设为 37 °C，加热块温度设为 100 °C。</li>
	<li>将细胞培养皿从培养箱中取出，置于冰上。
	<ol>
		<li>吸去细胞培养液，加入约 2 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻洗涤 2 次，每次 1 - 2 分钟。</li>
		<li>每个条件使用两孔。</li>
		<li>从某一条件的第一孔中吸去PBS，加入250 μl裂解缓冲液。冰上孵育5分钟，然后使用细胞刮，在冰上充分裂解细胞。</li>
		<li>吸出相同条件下下一个孔中的 PBS，加入 freshly 匀浆的混合物。这将增加蛋白质浓度。对所有条件重复此操作。</li>
		<li>完成后，将匀浆液用移液器转移至冰上预冷的1.6 ml微量离心管中，并加入20% TritonX-100，使其终浓度为1% TritonX-100。用1,000 μl移液器轻轻吹打混匀10次，尽量避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将试管置于冰上孵育 2 分钟&#160;用于溶解蛋白质。孵育后，在 4 °C 条件下以 6,010 rcf 离心 10 分钟，使未溶解的物质沉淀。将裂解液上清转移至预冷的 1.6 ml 离心管中，置于冰上。</li>
	<li>使用 Bradford 法进行蛋白质浓度分析11 用剩余的匀浆缓冲液将样品稀释至终浓度为 3 - 5 mg/ml 的蛋白质浓度，匀浆缓冲液中添加 1% TritonX-100 和含 B-巯基乙醇（BME）的 5x 上样缓冲液。</li>
	<li>将每个实验样品均匀分成2管，其中一管在37 °C下孵育30分钟&#160;（SNARE复合物），另一组在100 °C加热30分钟（SNARE单体）。间歇颠倒离心管以保持样品处于溶液状态。</li>
	<li>将样品在 -20 °C 下冷冻，直至准备进行 SDS-PAGE 分离。在采用标准技术进行电泳前，将先前煮沸过的样品重新煮沸 5 分钟。&#160;在100 °C下操作，但将37 °C的样品在室温下解冻。</li>
	<li>每个样品上样量为30–40 μg蛋白，分别在8%和15%的凝胶中进行重复电泳；8%凝胶可实现复合物的最佳分离，而15%凝胶用于SNARE蛋白单体的定量（SNAP-25约25 kDa，VAMP2约18 kDa，syntaxin-1约35 kDa）。电泳开始时维持70 V电压，待染料前沿通过浓缩胶后，将电压升至90 V，继续电泳至染料跑出凝胶。</li>
	<li>为保留单体，将蛋白质在冰上使用含20%甲醇（MeOH）的冷转膜缓冲液，于70 V电压下转至0.2 μm硝酸纤维素膜，持续45分钟。</li>
	<li>在室温下将膜置于加盖培养皿中干燥2小时或过夜（过夜效果最佳）。</li>
	<li>用10%牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭SNARE复合物膜1小时。</li>
	<li>将一抗（识别特定SNARE复合物组分）按1:1,000稀释，于4 °C在旋转摇床上孵育过夜。
	<ol>
		<li>用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）清洗印迹膜，每次5分钟，共洗3次&#160;每个。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含1% BSA的TBS-T缓冲液按1:20,000稀释荧光二抗溶液，室温避光孵育1小时。孵育1小时后，重复步骤2.12.1。</li>
	<li>使用配备软件套件的荧光扫描仪，按照制造商关于绘制矩形感兴趣区域（ROI）的操作说明，对SNARE蛋白复合物（位于40 kDa以上位置的免疫反应性条带）以及单体条带（SNAP-25、VAMP2和syntaxin-1的免疫反应性条带分别位于25 kDa、18 kDa和35 kDa处）进行成像和定量分析。</li>
</ol>
3. 通过全内反射荧光显微镜成像胞吐事件
注意：本实验方案需要专用的显微成像设备，包括可维持温度、湿度和 CO2 浓度的环境培养箱、配备落射荧光照明装置的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜、高倍率/高数值孔径（NA）的 TIRF 物镜、自动化的 XYZ 载物台，以及高灵敏度的电荷耦合器件（CCD）探测器。本方案使用一台全自动倒置显微镜，配备 100 倍、1.49 NA 的 TIRF 物镜、固态 491 nm 激光器和电子倍增 CCD（EM-CCD）。所有设备均由成像与激光控制软件进行调控。在开始成像方案之前，请先开启环境培养箱、载物台、光源、计算机和相机的电源。
<ol>
	<li>在成像软件中选择物镜。物镜就位后，将物镜加热器固定在物镜环上。</li>
	<li>确认物镜已完全下降后，再将载物台培养箱固定到载物台插槽中。均匀地向载物台培养箱的注水口注入蒸馏水，以防溢出。</li>
	<li>打开培养系统。打开 CO₂ 气瓶阀门。2 储液罐并根据制造商说明确认系统压力是否合适。让腔室有足够时间达到5% CO₂2 以及 37 °C。在放入成像培养皿之前，先将一个空培养皿放入培养箱中，以避免物镜上产生水凝结。</li>
	<li>打开激光光源。</li>
	<li>打开活细胞培养室，向物镜中添加浸油。将样品放入培养室中，并使用稳定臂或培养皿配重固定。升高物镜，直至浸油与样品底部接触。切换至透射光照明，通过目镜找到神经元的焦平面。</li>
	<li>启动激光软件并连接至激光控制软件。将照明模式设为宽场，选择正在使用的物镜（推荐使用100倍、数值孔径1.49的TIRF物镜）。设置样品的折射率（细胞约为1.38）。通过取消勾选来调节激光强度 &#34;TTL&#34; 对于491 nm激光器，将滑块调至100，然后回调至20–40%之间的某一数值。重新检查 &#34;TTL&#34;.</li>
	<li>再次在透射光照明下观察样品。进入成像软件，选择491 nm激光照明并打开快门。在移除聚光镜的情况下，微调激光焦点至载物台顶部，并将焦点中心对准闭合视场光阑的中心。将聚光镜倒置放置于光学平台上，以免划伤镜头。</li>
	<li>更换冷凝器，进入TIRF软件并将穿透深度（PD）设置为110 nm。将照明模式从宽场照明切换至TIRF照明模式进行成像。</li>
	<li>使用宽场落射荧光显微镜及落射荧光光源，通过目镜寻找表达 VAMP2-phluorin 的细胞。
	<ol>
		<li>调整成像参数（曝光时间、增益和激光功率），在尽可能缩短曝光时间并降低激光强度以减少光漂白和光毒性的同时，优化信噪比和动态范围（例如：曝光时间50 - 100毫秒，增益15 - 30，激光功率为最大输出的30%）。</li>
		<li>为每个细胞设置连续自动对焦。以每0.5秒采集一次图像的频率，持续5分钟，获取延时成像图像集。对于netrin-1刺激条件，在超净台中向细胞培养皿中加入500 ng/ml netrin-1，随后将培养皿放回培养箱中孵育1小时，再进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了量化单位细胞面积和时间内的胞吐事件频率，可通过将文件拖入窗口或进入文件菜单在 ImageJ 中打开图像堆栈&#62; 打开&#62; 文件名（图&#160;2A 插图 1).
	<ol>
		<li>为去除不代表囊泡融合事件的稳定荧光信号，使用 Image 对整个图像栈创建平均 z 投影&#62;堆叠&#62;Z轴投影&#62;投影类型：平均强度。使用“处理”功能从时间序列中的每幅图像中减去该平均图像&#62; 图像计算器&#62; 图像1：你的图像栈，操作：减去图像2新创建的平均z投影。这可以突出胞吐事件（图&#160;2A 插图 2 - 3).</li>
		<li>通过肉眼计数胞吐融合事件。胞吐事件定义为出现一个衍射极限范围内的荧光信号，该信号随着VAMP2-phluorin在质膜内的扩散而迅速弥散图&#160;2A 插图 6).</li>
		<li>使用“阈值”命令通过图像突出显示第一幅图像&#62;调节&#62;阈值&#62; 调节滑块，直至整个细胞被阈值高亮显示（图&#160;2A 插图 7 - 8).</li>
		<li>在“分析”中，选择“设置测量值”，并勾选面积和显示标签。使用魔棒追踪工具选中经阈值处理的细胞区域，然后按“m”进行测量（图&#160;2A 插图 7 - 8).</li>
		<li>将胞吐融合事件计数、细胞面积测量值以及成像持续时间一并转移至电子表格，用于计算每平方毫米的胞吐事件数量2/时间（图&#160;2A 插图 9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 轴突分支的微分干涉差（DIC）延时显微成像
注意：关于微分干涉差（DIC）成像通用方法的完整实验方案及演示可参见文献12。本实验方案虽采用DIC技术，但其他透射光显微镜方法亦可用于相同目的（例如：相差显微镜）。
<ol>
	<li>在2 DIV时，将含有未转染神经元的玻璃底成像培养皿放入预热的环境培养箱中，以维持37 °C、5% CO2的湿润环境。使用配备60X&#160;Plan-Apochromat、1.4 NA DIC物镜和高NA聚光镜的显微镜，以获得最佳图像质量和分辨率。</li>
	<li>通过目镜使用透射光照明调节焦平面，找到神经元。</li>
	<li>利用成像软件中的多区域采集功能，寻找并保存至少6个细胞的XYZ位置。调整载物台位置，使目标神经元位于视野范围内，以获得最佳成像效果。
	<ol>
		<li>加入250 ng/ml netrin-1进行刺激，并点击“开始多区域采集”。每20秒在每个位置依次采集图像，持续24小时，根据需要暂停采集并重新对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在成像软件中使用Apps&#62;Review Multi Dimensional Data&#62;打开文件名，查看图像。识别在成像期间形成的稳定轴突分支（长度达20 µm）。使用线条绘制工具从轴突基部到分支末端测量稳定轴突分支，确保满足20 µm长度的标准。
	<ol>
		<li>在电子表格中记录netrin刺激后，在分支最终形成区域出现膜突起时的帧数，以及新生分支长度达到20 µm时的帧数。</li>
		<li>将突起出现至分支形成之间的帧数乘以20秒，计算每个分支的形成时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 毒素处理与固定细胞免疫荧光
<ol>
	<li>在2 DIV时，用250 ng/ml&#160;netrin-1 和/或10 nM 肉毒杆菌毒素A（BoNTA）处理实验组神经元，BoNTA可切割SNARE蛋白SNAP25，有效抑制SNARE介导的胞吐作用13，并加入250 ng/ml netrin-1。保留一组未经处理的神经元作为对照组。 
	注意：配制和使用BoNTA溶液时需佩戴眼部和呼吸防护装备。所有被污染的材料应作为生物危害物处理，并尽快进行高压灭菌。</li>
	<li>在3 DIV（处理后24小时）吸除培养基，并立即替换为至少1 ml预热至37 °C的PHEM固定液（详见表&#160;1）。在室温下避光孵育20分钟&#160;。</li>
	<li>用PBS清洗3次（如需后续使用，可用封口膜密封后于4 °C保存）。</li>
	<li>将盖玻片置于避光、湿润的染色盒中，用新稀释的含0.2% TritonX-100的PBS（由10% TritonX-100母液配制）透化细胞膜10分钟&#160;。</li>
	<li>移除透化液，用50 µl 1× PBS清洗。在室温下用约50 µl含10%牛血清白蛋白的PBS（BSA-PBS）或含10%煮沸驴血清的PBS封闭30分钟&#160;。</li>
	<li>再次用1× PBS清洗。将盖玻片在50 µl含1% BSA-PBS的一抗溶液（βIII微管蛋白，1:1,000稀释，用于确认神经元身份）中室温避光孵育1小时。</li>
	<li>用PBS进行3次、每次5分钟&#160;的洗涤。将盖玻片在50 µl含光谱区分的微管蛋白二抗（1:400稀释）和荧光标记鬼笔环肽（根据激发波长不同而异：488标记鬼笔环肽为1:400，647标记鬼笔环肽为1:100）的1% BSA-PBS溶液中孵育1小时。</li>
	<li>用1×&#160;PBS洗涤3次，每次5分钟&#160;，然后将盖玻片用封片剂封固于载玻片上。</li>
	<li>从盖玻片边缘抽去多余的封片剂，并用透明指甲油密封。</li>
	<li>在倒置显微镜上使用40倍、数值孔径1.4的物镜、落射荧光装置及EM-CCD采集宽场落射荧光图像。
	<ol>
		<li>使用ImageJ手动分析分支情况。通过将文件拖入窗口或选择文件&#62;打开&#62;文件名的方式在ImageJ中打开图像堆栈（见图&#160;4A插图1）。</li>
		<li>使用线条&#62;分段线条工具，沿轴突进行描记，轴突定义为从胞体延伸出的最长神经突（见图&#160;4A插图2 - 3）。</li>
		<li>使用分析&#62;工具&#62;感兴趣区域管理器（ROI Manager），将轴突描记保存为感兴趣区域。描记并保存每个轴突分支，定义为长度≥20 µm的神经突。分析中仅包含初级分支（直接从轴突发出的突起）（见图&#160;4A插图3 - 4）。</li>
		<li>按“m”键测量已保存的感兴趣区域，并将像素长度导入电子表格以换算为µm。</li>
		<li>将长度≥20 µm的轴突分支数量除以轴突长度（单位为µm）除以100，得到每100 µm轴突长度上的分支数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drachman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+we+have+brain+to+spare%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Do we have brain to spare?</a> Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+netrin-1+in+the+guidance+of+cortical+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents.</a> Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
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<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
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<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+membrane+fusion+complex%3A+action+of+clostridial+neurotoxins+on+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly.</a> The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Centonze Frohlich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Contrast+and+Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Blasi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+selectively+cleaves+the+synaptic+protein+SNAP-25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25.</a> Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

轴突分支是一种基本的神经发育过程，是哺乳动物神经系统广泛神经连接的基础。理解局部质膜扩张所涉及的机制，对于我们认识正常和病理状态下的神经发育均至关重要。采用结合群体水平与单细胞水平方法的多角度研究策略，可在不牺牲群体水平分析的前提下，提高实验的可重复性，并增强空间和时间分辨率。在单细胞水平上，结合固定细胞和活细胞技术来研究netrin依赖性的轴突分支具有三重优势：能够在多个实验中收集到较大的样本量，通过微分干涉差（DIC）成像实现时间分辨率，以及利用全内反射荧光（TIRF）显微镜实现对外排融合事件的时空分辨率观察。
SDS抗性SNARE复合物检测法可用于测量培养皮层神经元中SNARE活性，同时考虑了神经元群体的异质性。SNARE复合物极为稳定，大多数其他蛋白质复合物在加入SDS后会解离，而SNARE复合物则具有SDS抗性，但不耐高温。这一特性使得定量检测SNARE复合物及SNARE单体的含量成为可能。由于需要在不同丙烯酰胺浓度下进行多次SDS-PAGE凝胶电泳，因此接种细胞时密度应不少于每孔600万个，以获得足够的蛋白量，这一点至关重要。该方法仅需常规实验室试剂、具备进行Weste...

最近的估计表明，人脑包含约1011个神经元和1014个突触连接1，凸显了体内轴突分支的重要性。体外轴突导向信号分子（如netrin-1）可引导轴突到达合适的突触伙伴，并促进轴突分支，从而增加突触容量2-5。netrin-1依赖的轴突分支过程涉及大量质膜的扩展6，我们推测这一过程需要通过SNARE复合物介导的胞吐囊泡融合来递送额外的膜组分7。
研究SNARE介导的胞吐作用在netrin-1依赖性轴突分支中的功能受到多种因素的制约。首先，皮层神经元的异质性增加了识别显著效应所需的样本量，使成像等单细胞技术的应用变得复杂。其次，尽管生化技术能够观察到群体水平上的变化，但其在时间和空间分辨率上的局限性，使其难以在轴突分支发生的时间窗口内将质膜扩展精确定位于轴突。最后，尽管轴突分支的形成需要数小时，但参与轴突延伸的细胞变化可能在数分钟内启动，并在数秒量级的时间尺度上发生，从而进一步扩大了实验所需考虑的时间范围。
我们概述了一种多技术联合的方法，该方法能够应对胞吐作用和轴突分支在时间和空间尺度上的多样性，从而加深了我们对基本细胞机制的理解。采用这些方法提供了证据，支持SNARE介导的胞吐作用在轴突分支中具有关键作用。

<table><tbody><tr><td>6孔组织培养处理板</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5；必须用硝酸处理24小时，用去离子水冲洗两次，并在使用前干燥。使用前必须用1 mg/ml多聚赖氨酸（Poly-d-lysine）包被并冲洗。</td></tr><tr><td>Amaxa核转染溶液</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>每转染100 ml</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/电穿孔仪</td><td>Lonza</td><td></td><td>程序O-005</td></tr><tr><td>35 mm玻璃底活细胞成像培养皿</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>必须用1 mg/ml多聚赖氨酸（Poly-d-lysine）包被并在接种细胞前冲洗</td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC2倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda LS氙灯</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环境控制载物台培养箱</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100倍 1.49 NA TIRF物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD相机</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor红外成像系统</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>用于印迹扫描</td></tr><tr><td>Image Studio软件套件</td><td>LI-COR</td><td></td><td>用于Odyssey红外系统的扫描；Image Studio Lite用于印迹的离线分析</td></tr><tr><td>Metamorph for Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>版本 7.7.6.0</td><td>用于所有成像及DIC延时图像分析的软件</td></tr><tr><td>CELL TIRF控制软件</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于控制TIRF成像激光的软件</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ 版本 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60倍 Plan Apochromat 1.4 NA物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40倍 1.4 NA Plan Apochromat物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>无血清培养基和胰酶中和培养基的基础溶液</td></tr><tr><td>B27补充剂</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>每500 ml培养基中加入50 ml，用于无血清培养基和胰酶中和培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td></td><td>35050-061</td><td>每50 ml无血清培养基中加入1 ml</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>10%溶液（溶于1x PBS）用于盖玻片封闭；5%溶液（溶于TBS-T）用于硝酸纤维素膜封闭。</td></tr><tr><td>10x&amp;nbsp;胰酶</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>汉克氏平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS碱</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸丙酯</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>甘油（光度级）</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>甘油（非光学级）</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>溶于无菌水，配制成1 mg/ml溶液</td></tr><tr><td>肉毒杆菌毒素A（BoNTA）</td><td>List Biological Laboratories</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗人VAMP2抗体</td><td>Cell signaling</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>鼠单克隆抗大鼠Syntaxin1A抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>山羊多克隆抗人SNAP-25抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>鼠单克隆抗人&amp;beta;III-微管蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 488鬼笔环肽，或Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR红外染料二抗</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800标记驴抗小鼠，680标记驴抗兔，680标记驴抗山羊</td></tr><tr><td>孔径0.2 &amp;#956;m的硝酸纤维素膜</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;经验证的替代抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鼠单克隆抗Syntaxin HPC-1克隆抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;鼠单克隆Synaptobrevin 2 (VAMP2)抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>鼠单克隆SNAP25抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

在神经发育过程中，生长中的轴突通过形成轴突分支延伸至多个突触靶点。轴突分支的形成受到细胞外导向信号分子（如netrin-1）的促进，并导致轴突质膜表面积显著增加。netrin-1依赖的轴突分支可能涉及对质膜扩展在时间和空间上的精确调控，而质膜组分则通过胞吐囊泡的融合得以补充。这些融合事件之前通常会发生SNARE复合物的形成，该复合物由囊泡SNARE蛋白（如VAMP2，即囊泡相关膜蛋白2）以及质膜上的靶SNARE蛋白syntaxin-1和SNAP25（突触小体相关蛋白25）共同组成。本文详细描述了一种多角度的研究方法，用于探究SNARE介导的胞吐作用在轴突分支中的功能。该联合方法的优势在于能够在不同的时空分辨率下获取数据，范围涵盖单个神经元中单个囊泡融合事件的动力学，到培养神经元群体中SNARE复合物的形成及轴突分支的整体分析。本实验方案结合了成熟的生物化学方法，用于检测内源性SNARE复合物的水平，同时利用表达pH敏感型GFP标记VAMP2（VAMP2-pHlourin）的皮层神经元进行全内反射荧光（TIRF）显微成像，以识别单个神经元中netrin-1依赖的胞吐活性变化。为了阐明netrin-1依赖性分支发生的时间进程，采用延时微分干涉差（DIC）显微成像技术对单个神经元进行数小时尺度的动态观察。通过固定细胞免疫荧光染色，并结合可切割SNARE蛋白机器并阻断胞吐作用的肉毒神经毒素处理，结果表明netrin-1依赖的轴突分支需要SNARE介导的胞吐活性参与。

利用 体外 用于检测神经元群体中SDS抗性SNARE复合物含量的生化技术 图1 显示SDS抗性SNARE复合物检测完成后，针对SNAP-25、syntaxin1A和VAMP2探查所得的Western印迹结果。
在细胞基底膜上进行全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，可对单个细胞中单个胞吐融合事件提供高分辨率图像。图2A展示了用于识别由VAMP2-phluorin介导的胞吐事件的图像分析方法。插图显示了囊泡融合发生时，VAMP2-phluorin在质膜内扩散的单个胞吐事件。图2B展示了一个皮层神经元中随时间（秒）发生的胞吐事件示例。放大插图标示了胞体、轴突分支以及轴突生长锥，体现了该检测方法的空间应用价值。圆形标记代表可通过TIRF显微镜观察到的单个胞吐融合事件。
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结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。

在神经发育过程中，生长中的轴突通过形成轴突分支延伸至多个突触伙伴。细胞外因子可促进轴突分支。

本实验的总体目标是定量观察神经元胞吐囊泡融合及轴突分支在时间和空间上的发生过程。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如在神经元发育过程中，囊泡融合在何时何地将膜物质插入到不断扩展的质膜中。该技术的主要优势在于，它结合了活细胞成像技术，可在单细胞水平上同时获得高空间和时间分辨率的图像，以及生化方法以获取基于细胞群体的信息。根据实验方案文本，用Netrin-1或对照物培养并模拟皮层神经元后，吸去某一条件第一孔中的PBS，加入250 µL裂解缓冲液。冰上孵育5分钟，然后使用细胞刮刀在冰上裂解细胞。吸出同一条件下下一孔中的 PBS，加入新近均质化的混合液以提高蛋白浓度。随后，将均质化溶液转移至预冷的冰上 1.6 毫升微量离心管中，加入 20% Triton X-100 使终浓度达到 1%。使用 1,000 微升移液器反复吹打混合液十次，尽量避免产生气泡。将离心管置于冰上孵育 2 分钟，以溶解蛋白质。然后在 4 摄氏度下以 6,010 RCF 离心 10 分钟，使未溶解的物质沉淀。将上清液转移至预冷的 1.6 毫升离心管中，置于冰上。接着，使用 Bradford 法测定蛋白浓度。然后，使用含有1% Triton X-100的匀浆缓冲液和添加了BME的5倍上样缓冲液，将样品稀释至终浓度为每毫升3-5毫克。将每个实验样品均分为两份，分别置于两个离心管中。一份样品在37摄氏度孵育30分钟，另一份在100摄氏度孵育30分钟。间歇性颠倒试管以保持样品处于溶液中。随后根据正文方案进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。在按照正文方案设置好TIRF显微镜和样品，并找到神经元的焦平面后。启动激光软件并连接至激光控制软件。将照明模式设为宽场，并选择物镜。然后设置样品的折射率，并通过取消勾选491激光器的TTL来调节激光强度。成像参数优化在对完整基底外排囊泡进行成像时至关重要，可避免焦平面漂移和光毒性，同时生成足够用于分析的高信噪比图像。将滑块调至100，然后将其回调至20至40之间的某一数值，随后重新检查TTL。接下来，在透射光照明下重新聚焦样品。然后在成像软件中选择 491 激光照明并打开快门。将聚光镜倒置放置在光学平台上，以免划伤镜头。精细调节激光在天花板上的焦点位置，移除聚光镜后，将焦点中心对准闭合的视场光阑中心。然后重新安装聚光镜，并在TIRF软件中将穿透深度设置为110纳米。随后切换至TIRF照明模式进行成像，取代宽场照明。现在，使用宽场落射荧光通过目镜寻找表达 VAMP2 荧光蛋白的细胞。为减少光漂白和光毒性，调整成像参数，以最短的曝光时间和激光强度来最大化信噪比和动态范围。为每个细胞设置连续自动对焦。然后以每0.5秒采集一次图像的方式，连续采集5分钟的时间序列图像。对于在层流罩内进行的Netrin-1刺激条件，向细胞培养皿中加入Netrin-1，使其终浓度为500纳克/毫升，加样后将培养皿放回培养箱中孵育1小时，再进行成像。用于量化单位细胞面积和单位时间内的胞吐事件频率。在 ImageJ 中，通过将文件拖入窗口，或选择“文件”、“打开”、文件名，来打开图像堆栈。为了去除不代表囊泡融合事件的稳定荧光信号，使用“图像”、“堆栈”、“Z 投影”，投影类型选择“平均强度”，以创建整个堆栈的平均 Z 投影。使用“Process”（处理）菜单中的“Image Calculator”（图像计算器），将时间序列中的每幅图像与所得的平均图像进行减法运算，即 Image 1 选择你的图像栈，Operation（运算）选择 Subtract（减去），Image 2 选择平均图像，生成一个新的 Z 投影。该处理可突出胞吐事件。现在通过肉眼计数胞吐融合事件，这些事件可识别为衍射极限的荧光信号点，随着VAMP2荧光蛋白在质膜内扩散而迅速弥散。使用“图像-调整-阈值”功能高亮显示第一幅图像，并调节滑块直至整个细胞被阈值高亮。然后在“分析”中选择“设置测量”，并勾选面积和显示标签。使用笔刷追踪工具设定阈值化的细胞区域，按 M 键进行测量。根据文本方案将采集的数据转移至电子表格中。体外培养两天时，将含有未转染神经元的玻璃底成像培养皿置于预热的加湿环境培养箱中。使用配备六 DX 平场复消色差 1.4 NA DIC 物镜和高数值孔径聚光镜的显微镜，以获得最佳的图像质量和分辨率。接下来，通过透射光照明，调节焦平面，利用目镜观察寻找神经元。对于轴突分支的 DIC 成像，正确设置冷光源照明对图像优化至关重要，是获得可分析结果的关键。然后，在视野中找到目标神经元，使用成像软件中的多区域采集功能定位并保存至少六个细胞的 XYZ 坐标。接着，加入终浓度为 250 纳克/毫升的 Netrin-1 或其他感兴趣的因子以刺激细胞，并启动多区域采集程序。每 20 秒在每个位置依次采集一次图像，持续 24 小时。必要时暂停采集并重新对焦。在成像软件中，通过选择“应用程序”、“查看多维数据”来打开所需文件以审阅图像。识别在成像期间形成的稳定轴突分支。使用轨迹区域工具测量从轴突基部到末端的稳定轴突分支。根据文本方案，用Netrin和肉毒杆菌毒素处理神经元后，进行固定并开展β-3微管蛋白和肌动蛋白的免疫荧光染色。使用倒置显微镜采集宽场落射荧光图像。在 ImageJ 中打开图像堆栈，使用直线、分段直线和追踪工具手动分析分支，将轴突定义为从胞体延伸出的最长的神经突起。通过“分析”→“工具”→“ROI 管理器”，将轴突的轨迹保存为感兴趣区域。然后追踪并保存每一条轴突分支，分支定义为长度大于或等于 20 微米的神经突起。分析时仅包含主分支。图中显示的是完成SDS抗性SNARE复合物检测后进行的Western blot结果，检测靶点为SNAP25、Syntaxin 1A和VAMP2。此处展示了复合体中的SNARE蛋白以及可识别的单体。此处还展示了一个皮层神经元中随时间发生的VAMP2荧光介导的胞吐事件示例。放大插图标示了细胞体、一条轴突分支以及一个轴突生长锥，体现了该检测方法在空间上的应用价值。圆圈标记了单个胞吐融合事件的爆发点，可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察到。该时间序列微分干涉差（DIC）成像实时展示了Netrin刺激下轴突分支的形成过程。这些位置表示分支位点处初始突起的出现位置。这些代表从主轴突到分支末端测量长度至少为20微米的完全形成且稳定的分支。在本实验中，培养3天的皮层神经元分别用Netrin-1或肉毒杆菌毒素A处理：Netrin-1可促进分支形成，而肉毒杆菌毒素A可切割SNAP25（SNARE复合物的一个组分），从而阻断胞吐作用。结果表明，SNARE介导的胞吐作用是Netrin依赖性分支所必需的。掌握之后，微分干涉差（DIC）成像可在一次过夜成像过程中完成。单个胞吐事件的全内反射荧光（TIRF）成像可在4至5小时内完成。SNARE复合物形成生化实验方案可在两小时内完成。在进行这些操作时，重要的是要注意掌握节奏，切勿急于完成任何单一的步骤。每个实验步骤都需要专注与耐心，以获得最佳结果。完成本实验方案后，可进一步采用其他方法，如共转染标记的囊泡组分与标记的候选货物分子，以回答更多科学问题。例如，胞吐囊泡的内含物是什么？该技术发展之后，为神经科学领域的研究人员探索任何解离神经元培养中的神经突发生、轴突分支以及形态发生过程中的其他阶段铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何观察并量化与神经元形态发生变化相对应的神经元胞吐囊泡融合事件在空间和时间上的特征。请注意，操作肉毒杆菌毒素或高功率激光器可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取相应预防措施，例如穿戴适当的防护装备，并使用显微镜安全锁定装置。

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