采用组合运用各种方法，定义质膜交付在轴突分支和神经元形态发生中的作用
2016年3月16日
该程序的总体目标是对神经元胞外细胞囊泡梭子和轴突分支的时间和空间发生进行可量化的观察。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如在神经元发育过程中囊泡融合何时何地将膜材料插入膨胀的质膜。该技术的主要优点是它结合了活细胞成像以获得单细胞中的高空间和时间分辨率，以及获取基于群体信息的生化方法。
根据协议文本用 Netrin-1 或对照培养和模拟皮层神经元后。从条件的第一个孔中吸出 PBS，并用 250 微升的均质缓冲液替换。在冰上孵育 5 分钟，然后使用细胞提升器在冰上匀浆细胞。
从相同条件的下一个井中吸出 PBS，并将最近匀浆的混合物添加到孔中，这将增加蛋白质浓度。接下来，将匀浆溶液转移到冰上预冷的 1.6 毫升微量离心管中，加入 20%Triton X-100 以达到 1% 的最终浓度，然后用 1， 000 微升移液器研磨混合物 10 次，同时尽量减少气泡。将试管在冰上孵育 2 分钟以溶解蛋白质。
然后在 4 摄氏度下以 6， 010 RCF 离心 10 分钟，以沉淀未溶解的材料。将 Lie 状态上清液转移到冰上新的冷藏 1.6 毫升试管中。接下来，使用 Bradford 测定法测定蛋白质浓度。
然后，使用含有 1% Triton X-100 的均质缓冲液和补充有 BME 的 5X 样品缓冲液将样品稀释至最终浓度为 3-5 毫克/毫升。将每个实验样品均匀地分成两管。然后将一个样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，另一个样品在 100 摄氏度下孵育 30 分钟。
间歇性地倒置试管以保持样品在溶液中。然后根据文本方案进行 SDS 页面和 Western 印迹。设置 TIRF 显微镜和样品并根据文本协议找到神经元焦平面后。
启动激光软件并连接到激光控制软件。将照明设置为宽视场并选择物镜。然后设置样品的折射率，并通过取消选中 491 激光器的 TTL 来调整激光强度。
在对地板完整胞吐囊泡进行成像时，成像参数优化非常重要，以避免焦点漂移和光毒性，同时产生足以用于分析的高信噪比图像。将滑块调整为 100，然后将其调回 20 到 40 之间的值。然后重新检查 TTL。
接下来，在透射光照明下再次聚焦样品。然后在成像软件中，选择 491 激光照明并打开快门。将聚光镜倒置在光学工作台上，以免刮伤镜头。
微调激光在天花板上的焦点，并在移除聚光镜后，将该点居中到闭场光阑的中心。然后更换冷凝器，并在 TIRF 软件中将穿透深度发送到 110 纳米。然后从宽视场照明切换到 TIRF 照明模式进行成像。
现在，使用宽视野落射荧光通过眼部找到表达 VAMP2 荧光的细胞。然后，为了减少光漂白和光毒性，调整成像参数，以使用最少的曝光时间和激光强度最大限度地提高信噪比和动态范围。设置每个单元格的连续自动对焦。
然后采集一个延时图像集，每 0.5 秒采集一次，持续 5 分钟。对于层流罩中的 Netrin-1 刺激条件，将终浓度为每毫升 500 纳克的 Netrin-1 添加到细胞培养皿中，并在成像前将培养皿放回培养箱中一小时。量化按细胞面积和时间标准化的胞吐事件的频率。
在 ImageJ 中，通过将文件拖动到窗口中或依次选择文件、打开、文件名来打开图像堆栈。要删除不代表囊泡融合事件的稳定荧光信号，请使用 Image、Stack、Z Project、Projection 类型的 Average Intensity。创建整个堆栈的平均 Z 投影。
使用 Process、Image Calculator、Image 1 your stack、Operation Subtract image two 从延时摄影中的每张图像中减去结果的平均图像。生成新创建的 Z 投影。这将强调胞外切事件。
现在通过肉眼计数胞外吞 fushion 事件，这可以被识别为衍射受限的荧光信号点，当 VAMP2 芴在质膜内扩散时，这些荧光信号会迅速扩散。使用图像、调整、阈值突出显示第一张图像，然后调整滑块，直到整个单元格的阈值突出显示。然后在 Analyze（分析）下，选择 Set Measurements （设置测量）并检查区域和显示标签。
使用棒描摹工具，设置阈值蜂窝区域，然后按 M 进行测量。根据文本协议将收集的数据传输到电子表格。在体外两天，将含有未转染神经元的玻璃底成像皿置于预热的潮湿环境室中。
使用配备 6 DX 平场复消色差物镜 1.4 NA DIC 物镜和高数值孔径聚光镜的显微镜，以获得最佳图像质量和分辨率。接下来，使用透射光照明调整焦平面以通过目镜找到神经元。对于轴突分支的 DIC 成像，正确设置较冷的照明对于图像优化是不可或缺的，并且对于产生可分析的结果至关重要。
然后，在视野内使用感兴趣的神经元，使用成像软件中的多区域采集功能查找并保存至少六个细胞的 XYZ 位置。现在，添加终浓度为每毫升 250 ng 的 Netrin-1 或其他感兴趣的因子以模拟细胞并按下开始多区域采集。每 20 秒顺序采集一次每个位置的图像，持续 24 小时。
根据需要暂停采集并重新聚焦。在成像软件中，通过选择应用程序、查看多维数据来查看图像并打开所需的文件。识别在成像过程中形成的稳定轴突分支。
使用追踪区域工具测量从轴突基部到尖端的稳定轴突分支。用 Netrin 和肉毒杆菌毒素处理神经元并固定和免疫染色后，根据文本方案对 β-3 微管蛋白和肌动蛋白进行免疫染色。使用倒置显微镜收集宽视场落射荧光图像。
在 ImageJ 中打开图像堆栈并手动分析分支使用线、分割线并追踪轴突，该轴突被定义为从体细胞延伸的最长神经突。使用 Analyze、Tools 和 ROI Manager，将轴突追踪保存为感兴趣区域。然后追踪并保存每个轴突分支，轴突分支定义为长度大于或等于 20 微米的神经突。
在分析中仅包括主要分支。此处显示的是 SDS 抗性 SNARE 复合物测定完成后的蛋白质印迹。探测 SNAP25、Syntaxin 1A 和 VAMP2。
复合物中的 SNARE 蛋白，一种可识别的单体，如下所示。此处显示了皮质神经元中随时间发生的 VAMP2 氟罗恩介导的胞吐事件的实例。放大的插图表示体细胞、轴突分支和轴突生长锥，显示了该测定的空间效用。
圆圈引爆单个胞吐融合事件，这可以通过 TIRF 显微镜看到。这种延时 DIC 成像实时显示了 Netrin 刺激的轴突分支的形成。这些位置表示分支站点的初始突出部分。
这些代表从主轴突到分支尖端测量的至少 20 微米的完全形成的稳定分支。在本实验中，3 个 DIV 的皮层神经元要么用刺激分支的 Netrin-1 处理，要么用肉毒杆菌 A 毒素处理，后者裂解 SNARE 复合物的一个组成部分 SNAP25 并阻断胞吐作用。结果表明，SNARE 介导的胞吐作用是 Netrin 依赖性分支所必需的。
一旦掌握，DIC 成像就可以在一次过夜成像会话中完成。单个胞吐事件的 TIRF 成像可以在 4-5 小时内进行管理。SNARE 复合物形成生化方案可在 2 小时内完成。
在尝试这些程序时，重要的是要记住调整自己的节奏，不要急于迈出任何一步。每个程序都需要关注和耐心才能获得最佳效果。按照此程序，可以执行其他方法，例如标记的囊泡组分与标记的候选货物的共转染，以回答其他问题。
比如胞外细胞囊泡的货物是什么？发展之后，这项技术为神经科学领域的研究人员铺平了道路，以探索任何解离神经元培养物中神经发生、轴突分支和形态发生的其他阶段。看完这个视频后，你应该对如何观察和量化与神经元形态发生变化相对应的神经元外吞囊泡融合事件的空间和时间性质有一个很好的理解。
不要忘记，使用肉毒杆菌毒素或高功率激光器可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着适当的安全服和使用显微镜安全锁机制。
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概览
本研究采用光学显微镜技术和生化分析方法来研究依赖netrin的轴突分支中SNARE介导的胞吐作用。这些方法的整合允许识别调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 了解轴突分支对神经元发育至关重要。
- SNARE蛋白在胞吐过程中的囊泡融合中起重要作用。
- Netrin-1是影响轴突引导和分支的关键因素。
- 活细胞成像提供了对动态细胞过程的洞察。
研究目的
- 观察神经元胞吐囊泡融合的时机和位置。
- 确定囊泡融合如何促进轴突分支。
- 将活细胞成像与生化分析结合用于全面分析。
使用的方法
- 用于高空间和时间分辨率的活细胞成像。
- 用于收集群体水平数据的生化分析。
- 用Netrin-1培养和刺激皮层神经元。
- 细胞的均质化以进行进一步分析。
主要结果
- 确定了SNARE介导的胞吐在轴突分支中的作用。
- 展示了囊泡融合的空间和时间动态。
- 洞察了神经元发育过程中膜材料如何被整合。
- 建立了一种在神经科学中可量化观察的方法。
结论
- 该研究增强了对轴突分支机制的理解。
- 结合成像和生化技术对神经科学研究有效。
- 研究结果可能为未来的神经元发育和功能研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the spatiotemporal regulation of plasma membrane delivery during axon branching provides mechanistic insights into neuronal morphogenesis relevant to neurodevelopmental disorder modeling. This combined methodology enables de-risking of target validation by linking SNARE-mediated exocytosis to structural plasticity in neuronal networks. The approach supports predictive confidence in early discovery by quantifying vesicle fusion dynamics as a functional readout of guidance cue signaling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of SNARE complex formation in netrin-1-dependent axon branching to validate vesicle fusion as a mechanistic node in neuritogenesis.
- Operational Value: Enables correlation of single-vesicle exocytic events with population-level SNARE biochemistry for multi-scale target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes TIRF microscopy of VAMP2-pHluorin as a quantitative assay for netrin-1-stimulated exocytic frequency normalized to cell area and time.
- Operational Value: Provides a standardized imaging protocol to detect changes in vesicle fusion kinetics upon pharmacological or genetic perturbation of SNARE machinery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates that botulinum toxin-mediated SNARE cleavage blocks netrin-1-dependent axon branching, establishing exocytosis as a necessary step in morphological plasticity.
- Operational Value: Supports use of DIC time-lapse imaging to quantify stable axon branch formation over 24 hours as a phenotypic readout for pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery imaging assays with biochemical validation to support target hypothesis testing in neuronal development pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guidance cue signaling through direct observation of vesicle fusion events in response to netrin-1 stimulation.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs of exocytic event frequency and axon branch metrics for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates measurable readouts including SNARE complex levels via Western blot, exocytic event counts via TIRF, and branch length via DIC imaging for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects molecular mechanism (SNARE-dependent exocytosis) to cellular phenotype (axon branching) enabling preclinical continuity in neurite outgrowth models.
- Enterprise Reuse: Combines live imaging and biochemical assays into a reusable platform for studying membrane dynamics in neuronal differentiation and regeneration models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by establishing SNARE-mediated exocytosis as a required process for netrin-1-driven axonal branching.
- Operational Value: Standardizes correlative imaging and biochemical workflows to improve reproducibility across laboratories studying neuronal morphogenesis.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking molecular perturbations (e.g., SNARE cleavage) to structural outcomes in neuronal networks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in vesicle trafficking and axonal connectivity based on functional phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, live-cell TIRF microscopy, and SNARE biochemistry.
- Depends on access to microfluidic imaging chambers, laser-based TIRF systems, and Western blotting infrastructure.
- Necessitates standardization of netrin-1 stimulation timing and toxin treatment protocols across experimental groups.
- Involves adaptation considerations for applying the assay to different neuronal subtypes or disease-relevant models.
- Limited by the technical complexity of correlating single-vesicle events with population biochemical assays without automated image analysis pipelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
SNARE Complex Formation Assay
3:12
Imaging Exocytic Events via TIRF Microscopy
8:08
Differential Interference Contrast Timelapse Microscopy of Axon Branching
10:10
Toxin Manipulations and Fixed Cell Immunofluorescence
11:13
Results: SNARE-mediated Exocytosis in Netrin-dependent Axon Branching
12:58
Conclusion
