利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本实验的总体目标是定量观察神经元胞吐囊泡融合及轴突分支在时间和空间上的发生过程。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如在神经元发育过程中，囊泡融合在何时何地将膜物质插入到不断扩展的质膜中。该技术的主要优势在于，它结合了活细胞成像技术，可在单细胞水平上同时获得高空间和时间分辨率的图像，以及生化方法以获取基于细胞群体的信息。

根据实验方案文本，用Netrin-1或对照物培养并模拟皮层神经元后，吸去某一条件第一孔中的PBS，加入250 µL裂解缓冲液。冰上孵育5分钟，然后使用细胞刮刀在冰上裂解细胞。

吸出同一条件下下一孔中的 PBS，加入新近均质化的混合液以提高蛋白浓度。随后，将均质化溶液转移至预冷的冰上 1.6 毫升微量离心管中，加入 20% Triton X-100 使终浓度达到 1%。使用 1,000 微升移液器反复吹打混合液十次，尽量避免产生气泡。将离心管置于冰上孵育 2 分钟，以溶解蛋白质。

然后在 4 摄氏度下以 6,010 RCF 离心 10 分钟，使未溶解的物质沉淀。将上清液转移至预冷的 1.6 毫升离心管中，置于冰上。接着，使用 Bradford 法测定蛋白浓度。

然后，使用含有1% Triton X-100的匀浆缓冲液和添加了BME的5倍上样缓冲液，将样品稀释至终浓度为每毫升3-5毫克。将每个实验样品均分为两份，分别置于两个离心管中。一份样品在37摄氏度孵育30分钟，另一份在100摄氏度孵育30分钟。

间歇性颠倒试管以保持样品处于溶液中。随后根据正文方案进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。在按照正文方案设置好TIRF显微镜和样品，并找到神经元的焦平面后。

启动激光软件并连接至激光控制软件。将照明模式设为宽场，并选择物镜。然后设置样品的折射率，并通过取消勾选491激光器的TTL来调节激光强度。

成像参数优化在对完整基底外排囊泡进行成像时至关重要，可避免焦平面漂移和光毒性，同时生成足够用于分析的高信噪比图像。将滑块调至100，然后将其回调至20至40之间的某一数值，随后重新检查TTL。

接下来，在透射光照明下重新聚焦样品。然后在成像软件中选择 491 激光照明并打开快门。将聚光镜倒置放置在光学平台上，以免划伤镜头。

精细调节激光在天花板上的焦点位置，移除聚光镜后，将焦点中心对准闭合的视场光阑中心。然后重新安装聚光镜，并在TIRF软件中将穿透深度设置为110纳米。随后切换至TIRF照明模式进行成像，取代宽场照明。

现在，使用宽场落射荧光通过目镜寻找表达 VAMP2 荧光蛋白的细胞。为减少光漂白和光毒性，调整成像参数，以最短的曝光时间和激光强度来最大化信噪比和动态范围。为每个细胞设置连续自动对焦。

然后以每0.5秒采集一次图像的方式，连续采集5分钟的时间序列图像。对于在层流罩内进行的Netrin-1刺激条件，向细胞培养皿中加入Netrin-1，使其终浓度为500纳克/毫升，加样后将培养皿放回培养箱中孵育1小时，再进行成像。用于量化单位细胞面积和单位时间内的胞吐事件频率。

在 ImageJ 中，通过将文件拖入窗口，或选择“文件”、“打开”、文件名，来打开图像堆栈。为了去除不代表囊泡融合事件的稳定荧光信号，使用“图像”、“堆栈”、“Z 投影”，投影类型选择“平均强度”，以创建整个堆栈的平均 Z 投影。

使用“Process”（处理）菜单中的“Image Calculator”（图像计算器），将时间序列中的每幅图像与所得的平均图像进行减法运算，即 Image 1 选择你的图像栈，Operation（运算）选择 Subtract（减去），Image 2 选择平均图像，生成一个新的 Z 投影。该处理可突出胞吐事件。

现在通过肉眼计数胞吐融合事件，这些事件可识别为衍射极限的荧光信号点，随着VAMP2荧光蛋白在质膜内扩散而迅速弥散。使用“图像-调整-阈值”功能高亮显示第一幅图像，并调节滑块直至整个细胞被阈值高亮。然后在“分析”中选择“设置测量”，并勾选面积和显示标签。

使用笔刷追踪工具设定阈值化的细胞区域，按 M 键进行测量。根据文本方案将采集的数据转移至电子表格中。体外培养两天时，将含有未转染神经元的玻璃底成像培养皿置于预热的加湿环境培养箱中。

使用配备六 DX 平场复消色差 1.4 NA DIC 物镜和高数值孔径聚光镜的显微镜，以获得最佳的图像质量和分辨率。接下来，通过透射光照明，调节焦平面，利用目镜观察寻找神经元。对于轴突分支的 DIC 成像，正确设置冷光源照明对图像优化至关重要，是获得可分析结果的关键。

然后，在视野中找到目标神经元，使用成像软件中的多区域采集功能定位并保存至少六个细胞的 XYZ 坐标。接着，加入终浓度为 250 纳克/毫升的 Netrin-1 或其他感兴趣的因子以刺激细胞，并启动多区域采集程序。每 20 秒在每个位置依次采集一次图像，持续 24 小时。

必要时暂停采集并重新对焦。在成像软件中，通过选择“应用程序”、“查看多维数据”来打开所需文件以审阅图像。识别在成像期间形成的稳定轴突分支。

使用轨迹区域工具测量从轴突基部到末端的稳定轴突分支。根据文本方案，用Netrin和肉毒杆菌毒素处理神经元后，进行固定并开展β-3微管蛋白和肌动蛋白的免疫荧光染色。使用倒置显微镜采集宽场落射荧光图像。

在 ImageJ 中打开图像堆栈，使用直线、分段直线和追踪工具手动分析分支，将轴突定义为从胞体延伸出的最长的神经突起。通过“分析”→“工具”→“ROI 管理器”，将轴突的轨迹保存为感兴趣区域。然后追踪并保存每一条轴突分支，分支定义为长度大于或等于 20 微米的神经突起。

分析时仅包含主分支。图中显示的是完成SDS抗性SNARE复合物检测后进行的Western blot结果，检测靶点为SNAP25、Syntaxin 1A和VAMP2。

此处展示了复合体中的SNARE蛋白以及可识别的单体。此处还展示了一个皮层神经元中随时间发生的VAMP2荧光介导的胞吐事件示例。放大插图标示了细胞体、一条轴突分支以及一个轴突生长锥，体现了该检测方法在空间上的应用价值。

圆圈标记了单个胞吐融合事件的爆发点，可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察到。该时间序列微分干涉差（DIC）成像实时展示了Netrin刺激下轴突分支的形成过程。这些位置表示分支位点处初始突起的出现位置。

这些代表从主轴突到分支末端测量长度至少为20微米的完全形成且稳定的分支。在本实验中，培养3天的皮层神经元分别用Netrin-1或肉毒杆菌毒素A处理：Netrin-1可促进分支形成，而肉毒杆菌毒素A可切割SNAP25（SNARE复合物的一个组分），从而阻断胞吐作用。结果表明，SNARE介导的胞吐作用是Netrin依赖性分支所必需的。

掌握之后，微分干涉差（DIC）成像可在一次过夜成像过程中完成。单个胞吐事件的全内反射荧光（TIRF）成像可在4至5小时内完成。SNARE复合物形成生化实验方案可在两小时内完成。

在进行这些操作时，重要的是要注意掌握节奏，切勿急于完成任何单一的步骤。每个实验步骤都需要专注与耐心，以获得最佳结果。完成本实验方案后，可进一步采用其他方法，如共转染标记的囊泡组分与标记的候选货物分子，以回答更多科学问题。

例如，胞吐囊泡的内含物是什么？该技术发展之后，为神经科学领域的研究人员探索任何解离神经元培养中的神经突发生、轴突分支以及形态发生过程中的其他阶段铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何观察并量化与神经元形态发生变化相对应的神经元胞吐囊泡融合事件在空间和时间上的特征。

请注意，操作肉毒杆菌毒素或高功率激光器可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取相应预防措施，例如穿戴适当的防护装备，并使用显微镜安全锁定装置。