对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色
2016年2月19日
本文描述了在整只斑马鱼胚胎中对磷酸化表位进行免疫染色的技术，并进一步在小至初级纤毛的细胞结构中进行双色荧光共聚焦定位。这些固定和成像技术可用于确定特定蛋白质出现或激活的位置及其动力学特征。
本实验的总体目标是在斑马鱼胚胎中进行激活蛋白的免疫定位。该方法有助于解答发育生物学和细胞生物学领域中的关键问题，例如磷酸化蛋白在整个胚胎中的定位与激活情况。该技术的主要优势在于，可通过免疫染色钙离子激活的蛋白，实现对整个胚胎中钙依赖性信号通路的定位分析。
根据文本方案获得野生型或转基因胚胎后，向养殖用水中的胚胎加入0.003%PTU以抑制色素形成，并孵育至所需发育阶段。当胚胎达到正确阶段时，向培养皿中加入MESAB以麻醉鱼类。待鱼类完全麻醉后，尽可能移除养殖用水，然后加入新鲜的4%PFA和PBS，在室温下孵育三至四小时。
孵育结束后，去除PFA，加入100%甲醇进行替换。然后将胚胎置于-20°C条件下保存至少48小时。进行免疫染色时，将每种实验条件下不少于10个胚胎放入已标记的1.5毫升微量离心管中。
当胚胎沉降至管底后，移除并弃去甲醇，使用PBTx中浓度递减的乙醇进行逐步洗涤，以重新水化胚胎。除去最后一次PBTx洗涤液，加入0.5毫升含10%正常山羊血清（NGS）的PBTx溶液。然后在室温下轻轻振荡孵育至少一小时。
接着，移除溶液，加入0.2至0.5毫升1:5稀释的小鼠抗乙酰化微管蛋白单克隆抗体溶液，其中含有10%NGS和PBTx。将胚胎在室温下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，移除并弃去抗体溶液，用0.5毫升含2%NGS和PBTx的溶液轻轻振荡洗涤三次，每次五分钟。
调暗室内灯光，在每份样品中加入500 µL含10% NGS和PBTx的荧光标记二抗工作液（1:500稀释），轻轻混匀。室温避光孵育4小时，同时轻柔振荡。孵育结束后，将胚胎洗涤3次。
进行共免疫染色时，加入1:20稀释的抗磷酸化CaMKII抗体。在避光条件下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，用2% NGS和PBTx洗涤胚胎三次后，加入1:5稀释的红色568荧光标记的山羊抗兔IgG抗体以及10% NGS和PBTx。
在室温下避光孵育四小时后，用PBTx或含50%甘油的PBS洗涤胚胎三次，并根据成像方法选择保存液。为进行成像而封片时，取1至5个胚胎置于载玻片上，用四个叠放的1号盖玻片碎片置于胚胎两侧，以形成容纳空间。
然后盖上盖玻片。使用100倍油镜和透射光将单个胚胎调至焦点，随后关闭光源。
打开共聚焦显微镜，启动相应的激光器并启用远程对焦功能。运行共聚焦成像程序，在采集工具栏中选择合适的物镜。然后，在XY基础工具栏中，点击1024按钮以设置图像尺寸。
在激光器和检测器栏中，单击红色的 488 和绿色的 568 框以打开每个通道的激光检测器，并将针孔设置为中等。然后，在增益栏中，调节每个通道的增益以实现可视化。接下来，在采集设置栏中，单击实时按钮以开始采集图像。
在视图设置栏中，取消勾选“强制整数缩放”框，以使实时窗口居中。在采集设置栏的 Z 选项卡下，逐层扫描图像。选择要纳入图像的层数后，移动到 Z 平面中心的某个位置。
在 Z 选项卡下，单击红色的小参考框。这将使射频消融仪（RFA）在选定的中心点处归零。在标有“步进尺寸”的框中，选择切片层的厚度。
请注意文件大小框，并尽量将文件限制在1吉字节以内。要找到图像的最顶层，点击“顶部”旁边的圆圈，并逐层移动Z轴层面。然后点击“底部”旁边的圆圈，计算机会将图像返回至中心层面。
然后，在采集设置框中，再次点击“live”以停止激光采集。在此面板中，点击标记为“average”和“Z stack”的红色方框，这些方框将变为绿色。
在采集设置框中，点击“单次”以采集整组图像。在系统对两个通道及整个Z轴层叠进行扫描时，实时监控其进度。保存时，点击体积窗口，选择“另存为”，并为文件命名。
为了对文件进行体渲染，在Z轴堆栈仍处于打开状态时，选择数据下拉菜单并点击体渲染。将渲染后的文件保存为.tif格式文件。该图显示了斑马鱼库普弗囊泡（Kuppfer's vesicle，简称KV）中P-CaMKII和乙酰化微管蛋白的免疫染色结果，其中乙酰化微管蛋白是纤毛的标准标记物。初级纤毛通过摆动产生环形液体流动，从而引起KV内衬纤毛细胞中钙离子水平升高，并在此处显示的特定位置激活CaMKII。
这些图像显示了受精后24至72小时（HPF）期间，P-CaMKII在围绕肾周管特定区域的纤毛细胞顶面的分布情况。在发育第1天，用PFA和甲醇固定的斑马鱼胚胎耳囊能够保持其结构完整性，并可在动纤毛的基部及全长上检测到CaMKII染色信号。在72 HPF时，内耳组织使用Alexa 488标记的鬼笔环肽和Alexa 568标记的抗乙酰化微管蛋白抗体进行复染。
PFA-甲醇固定法可同时保存F-肌动蛋白和微管蛋白。该尾鳍30 HPF的斑马鱼表达一种膜定位的GFP，而甲醇固定会导致该信号丢失。与PFA联合甲醇固定相比，仅使用PFA固定导致P-CaMKII信号减弱。
然而，在此发育阶段，信号已足够强，无需甲醇即可检测到。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两天内完成。进行此操作时，重要的是要记住使用新鲜的胚胎和新鲜的游离剂。
观看本视频后，您应能充分理解如何在斑马鱼胚胎中定位磷酸化蛋白。
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概述
本文介绍了在整只斑马鱼胚胎中进行磷酸化表位免疫染色以及双色荧光共聚焦定位的技术。这些方法可用于确定特定蛋白质在细胞结构（如初级纤毛）中的定位与动力学特征。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 斑马鱼胚胎中蛋白质的免疫定位。
- 理解磷酸化蛋白的激活机制。
- 钙依赖性信号通路的定位。
- 研究完整胚胎对发育过程认知的重要性。
研究目的
- 对斑马鱼胚胎中活化的蛋白质进行免疫定位。
- 研究发育生物学和细胞生物学中的关键问题。
- 确定整个胚胎中蛋白质活化的动力学过程。
使用方法
- 使用野生型或转基因斑马鱼胚胎。
- 使用0.003% PTU抑制色素形成。
- 将胚胎孵育至所需发育阶段。
- 使用4% PFA和PBS进行免疫染色以定位蛋白质。
主要结果
- 钙依赖性信号蛋白的成功定位。
- 细胞结构中磷酸化蛋白的可视化。
- 发育过程中蛋白激活的明确动力学特征。
- 对完整胚胎中蛋白动态的深入理解。
结论
- 这些技术可用于蛋白质定位和激活的详细研究。
- 斑马鱼胚胎中的免疫染色适用于发育生物学研究。
- 这些方法可为细胞信号传导机制提供见解。
常见问题
行业重要性概述
对整只斑马鱼胚胎进行磷酸化表位免疫染色，可直接可视化纤毛器官中信号动态，有助于验证发育通路中的靶点。该方法通过将翻译后修饰与脊椎动物模型中的表型结果关联，提供机制层面的风险降低。通过定位活化蛋白（如磷酸化CaMKII）在Kupffer’s Vesicle、肾脏和内耳等结构中的分布，该技术增强了早期发现阶段的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定位纤毛细胞中的磷酸化蛋白，验证治疗假设。
- 操作价值：通过与乙酰化微管蛋白（纤毛标志物）共定位，确认靶点结合。
- 预测价值：通过可视化KV中钙依赖性信号通路的激活，支持通路机制的阐明。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：在斑马鱼中建立经过验证的生物系统，用于后续化合物筛选。
- 定量输出：可对特定解剖区域内的磷酸化表位进行荧光强度测量。
- 可扩展性：支持多胚胎并行处理，可在不同实验条件下实现可重复的信号检测。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过评估Kupffer囊泡和内耳中依赖纤毛的信号传导，与纤毛病模型相一致。
- 转化连续性：将胚胎期的信号机制与出生后的功能结果相联系。
- 基于风险调整的推进：根据发育组织中靶点调控情况，为继续或终止研究提供决策依据。
流程与工作流整合
该方法通过提供脊椎动物组织中空间分辨的激活数据，适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的整个发现过程。
- 发现生物学：通过直接可视化胚胎结构中磷酸化蛋白的定位，支持假设验证。
- 筛选：通过对整体胚胎中标记纤毛器官进行标准化免疫染色，实现检测就绪。
- 分析：在克氏泡（KV）、肾脏和内耳中生成定量荧光读数，用于不同条件间的比较。
- 转化研究：将胚胎纤毛信号通路与纤毛病及肾脏疾病的临床前模型相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于跨发育阶段和遗传模型的磷酸化表位图谱绘制。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将磷酸化事件与纤毛定位关联，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化的固定和抗体孵育步骤，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过在体内验证信号通路的激活，提高靶点选择的可信度。
- 项目组合影响：基于胚胎信号传导数据，实现对靶点的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备斑马鱼胚胎学和免疫荧光技术方面的专业知识。
- 依赖于具备激光调谐功能的共聚焦显微镜基础设施，以实现双通道检测。
- 需要在不同实验室之间标准化抗体稀释比例和孵育时间。
- 需考虑不同遗传背景和发育阶段的适应性调整。
- 表位的保存对固定方法敏感，限制了该方法的应用；例如单独使用多聚甲醛（PFA）会减弱磷酸化CaMKII信号。
