对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

本实验的总体目标是在斑马鱼胚胎中进行蛋白质的免疫定位，特别是那些被激活的蛋白质。该方法有助于回答发育生物学和细胞生物学领域中的关键问题，例如磷酸化蛋白质在整个胚胎中的定位与激活情况。该技术的主要优势在于，可通过免疫染色被钙离子激活的蛋白质，从而在整个胚胎水平上定位钙依赖性信号通路。

根据文本方案获得野生型或转基因胚胎后，向养殖用水中的胚胎加入0.003% PTU以抑制色素形成，并孵育至所需发育阶段。当胚胎达到正确阶段时，向培养皿中加入MESAB以麻醉鱼类。待鱼类完全麻醉后，尽可能移除养殖用水，然后加入新鲜的4% PFA和PBS，在室温下孵育三至四小时。

孵育后，去除PFA，加入100%甲醇进行替换。然后将胚胎置于-20°C条件下保存至少48小时。进行免疫染色时，将每种实验条件下不少于10个胚胎放入已标记的1.5毫升微量离心管中。

当胚胎沉降至管底后，移除并弃去甲醇，使用PBTx中浓度递减的乙醇进行逐步洗涤，以重新水化胚胎。移去最后一次PBTx洗涤液，加入0.5毫升含10%正常山羊血清（NGS）的PBTx溶液。然后在室温下轻轻振荡孵育至少一小时。

接下来，移除溶液，加入 0.2 至 0.5 毫升鼠抗乙酰化微管蛋白单克隆抗体（1:5 稀释液）、10% NGS 和 PBTx。将胚胎在室温下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，移除并弃去抗体溶液，用 0.5 毫升含 10% NGS 的 PBTx 溶液轻轻振荡洗涤三次，每次五分钟。

调暗室内灯光，在每份样品中加入500微升含10% NGS和PBTx的荧光标记二抗工作液（1:500稀释），于室温避光孵育，轻柔振荡四小时。孵育结束后，将胚胎洗涤三次。

进行共免疫染色时，加入1:20稀释的抗磷酸化CaMKII抗体。在避光条件下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，用2% NGS和PBTx洗涤胚胎三次后，加入1:5稀释的红色568荧光标记的山羊抗兔IgG抗体以及10% NGS和PBTx。

在室温避光条件下孵育四小时后，用PBTx或含50%甘油的PBS缓冲液洗涤胚胎三次，具体选择取决于成像方法。为进行成像，取一至五个胚胎置于载玻片上，于胚胎两侧各放置四个叠起的1号盖玻片碎片，以形成观察腔室。

盖上盖玻片。使用100倍油镜和透射光将单个胚胎调至焦点。关闭光源。

打开共聚焦显微镜并启动相应的激光器，启用远程对焦功能。启动共聚焦成像程序，在采集工具栏中选择合适的物镜。然后在XY基础工具栏中，点击1024按钮以设置图像尺寸。

在激光器和检测器栏中，单击红色的 488 和绿色的 568 框以打开每个通道的激光检测器，并将针孔设置为中等。然后，在增益栏中，调节每个通道的增益以实现可视化。接下来，在采集设置栏中，单击实时按钮以开始采集图像。

在视图设置栏中，取消勾选“强制整数缩放”框，以在实时窗口中居中显示。在采集设置栏的 Z 选项卡下，逐层扫描图像。选择要纳入图像的层数后，移动至 Z 平面中心的某个位置。

在 Z 选项卡下，单击红色的小参考框。这将使射频消融仪（RFA）在选定的中心点处归零。在标有步进尺寸的框中，选择切片层的厚度。

请注意文件大小框，并尽量将文件限制在1吉字节以内。要找到图像的最顶端，点击“顶部”旁边的圆圈，并逐层移动Z轴层面。然后点击“底部”旁边的圆圈，计算机会将图像返回至中心层面。

然后，在采集设置框中，再次点击“live”以停止激光采集。在此面板中，点击标记为“average”和“Z stack”的红色方框，这些方框将变为绿色。

在采集设置框中，点击“单次”以采集整组图像。在系统对两个通道及整个Z轴层叠进行扫描时，实时监控其进度。保存时，点击体积窗口，选择“另存为”，并为文件命名。

要对文件进行体渲染，在Z轴堆栈仍处于打开状态时，选择数据下拉菜单并点击体渲染。将渲染后的文件保存为.tif格式。该图显示了斑马鱼库普弗氏泡（Kuppfer's vesicle，简称KV）中P-CaMKII和乙酰化微管蛋白的免疫染色结果，其中乙酰化微管蛋白是纤毛的标准标记物。初级纤毛通过摆动产生环形液体流动，从而引起KV腔内纤毛细胞中钙离子水平升高，并在此处观察到CaMKII在特定位置被激活。

这些图像显示了受精后24至72小时（HPF）期间，P-CaMKII在围绕肾周管特定区域的纤毛细胞顶面的分布情况。在发育第1天，用PFA和甲醇固定的斑马鱼胚胎耳囊能够保持其结构完整性，并可在动纤毛的基部及其全长上检测到CaMKII染色信号。在72 HPF时，内耳组织使用Alexa 488标记的鬼笔环肽和Alexa 568标记的抗乙酰化微管蛋白抗体进行复染。

PFA-甲醇固定法可同时保存F-actin和微管蛋白。该30 HPF鱼体表达一种膜定位的GFP，若采用甲醇固定则会导致GFP信号丢失。与PFA联合甲醇固定相比，单独使用PFA固定导致P-CaMKII信号减弱。

然而，在此发育阶段，信号已足够强，无需甲醇即可检测。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两天内完成。进行此实验时，务必注意使用新鲜的胚胎和新鲜的游离剂。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在斑马鱼胚胎中定位磷酸化蛋白。