皮层肌动蛋白流通过结构照明显微镜数据的时空图像相关光谱量化性T细胞

本实验的总体目标是在通过全内反射、结构照明成像或草坪模拟采集后，通过图像相关光谱量化皮质肌动蛋白的动力学。这种方法可以帮助回答生物物理领域的关键问题，例如皮质肌动蛋白流在调节免疫突触的相互作用中的作用。该技术的主要优点是它将纳米级分辨率与生活方式兼容性相结合，与传统的实例显微镜技术相比，可以观察和分析更小尺度的过程。

演示这项技术的将是我实验室的博士生 George Ashdown。对于测试样品，将 5 微升直径为 100 纳米的亚衍射荧光微球储备液添加到新鲜未涂层的盖玻片的表面。然后用移液管吸头将微球溶液涂抹在盖玻片上并使其干燥。

将 200 微升安装介质添加到测试盖玻片中以准备开始成像，打开草坪 SIM 系统的舞台加热器的培养箱，并用蒸馏水填充水箱以完全覆盖加热元件的底部。让水平衡到 37 摄氏度。将加热环连接到物镜并将其设置为 37 摄氏度。

然后将 turf 4 88 兼容的分级块固定在显微镜的光路中，以确保接合正确的光路。将激光床上的通道模式切换到单个位置。对显微镜载物台上的光缆重复此作。

如果未执行这些步骤，则预期会在软件窗口中看到错误。设置模式后，将物镜降低到最低的 Z 平面，并在其上滴一滴油。将带有荧光微球的测试样品盖玻片放在显微镜载物台上。

然后在显微镜机身上选择完美的对焦系统或 PFS 功能。在 Z 平面上逐渐向上移动物镜，并在 PFS 按钮停止闪烁时停止，这表明控制软件已到达焦平面。切换到实时视图以在屏幕上对微球进行成像。

使用 PFS 微型纵器轮对焦点进行微调。观察均匀的照明，在 75 纳米气味波上方没有离焦荧光提交。最后，通过观察用于 T 细胞刺激的荧光微球样品的波动照明模式来确认结构照明是实现的 8 室。

用 200 微升抗 CD 3 和抗 CD 28 抗体混合物盖上衬片，并在 37 摄氏度下孵育盖衬片 2 小时。按照文本协议中的说明清洗盖玻片后，将其放在显微镜载物台上，然后找到草皮焦平面。接下来，轻轻地将 200 微升转染的 T 细胞移液到盖玻片上的一个孔中。

使用 epi 荧光追踪 GFP 肌动蛋白转染的细胞，当它们落在盖玻片上时。细胞稳定后，使用 N SimPad 切换到实时模式，并检查显示器上的细胞是否聚焦。要记录时间过程，请打开 ND 采集窗口并选择时间选项卡。

然后单击 add 并将间隔设置为 no delay。将持续时间设置为 10 分钟。最后，通过在 ND 采集窗口中选择 Run now 开始记录数据。

要重建图像，请首先打开包含正确分析模块的分析软件。单击应用程序，然后选择显示 End SIM 窗口。将照明调制、对比度和高分辨率噪声抑制设置为 1，并重建草坪 SIM 数据集，以从图像状态栏生成完整的 SIM 图像。

确认像素大小为 30 纳米，然后将数据导出为 TIF 文件以进行棒状分析。下载并解压棒 MATLAB 软件包后，打开脚本。然后定义 immobile removal 过滤器的文本协议中概述的输入参数。

在第 23 行中，将过滤参数设置为移动平均线，在第 24 行中，使用 21 作为移动平均参数以生成一个矢量图。将第 31 行中的时间子区域设置为最大帧数，在本例中为 63。然后在第 32 行中，将时间偏移设置为第 33 行到第 35 行中的 1。

输入输出文件的名称、输出矢量贴图的标题和输出目录路径。然后定义矢量映射图像的保存格式。在本例中为 png.

在 MATLAB 编辑器窗口中，打开脚本。运行一个通道 sticks 并通过运行脚本的第 1 行到第 23 行来加载图像系列。接下来运行 run one channel 的第 29 行到 35 行。

要开始棒状分析，请按照提示并选择一个多边形来定义感兴趣区域或 ROI（如果需要）。要显示矢量地图，请运行第 38 行到第 52 行。然后运行第 53 行到第 72 行以绘制速度大小直方图，此处显示的是表达 GFP 标记的 F 肌动蛋白的 OT T 细胞，该细胞是使用 turf sim 协议成像的。

文中讨论了将该细胞引入涂有抗 CD 3 和抗 CD 28 抗体的盖玻片上 5 分钟后，旨在刺激免疫突触的形成。对它进行了一个时间过程，以便可以可视化 f 肌动蛋白的分子流。随后使用该 sticks 程序对这些数据进行分析，可以量化 F 肌动蛋白分子流，如该矢量图所示，对应于左侧细胞的方框区域，它代表突触外围的一部分。

该图谱和 T 细胞子区域的进一步放大阐明了肌动蛋白流动的方向性和速度，这可以从向量长度和颜色代码确定速度数据也可以绘制在直方图中，以便进行统计分析。总的来说，这些结果表明，在免疫突触中，肌动蛋白 F 以对称的方式从外围流向细胞中心。观看此视频后，您应该对如何使用图像相关光谱获取数据中的 ts 并分析皮质肌动蛋白动力学有一个很好的了解。

虽然这种方法可用于深入了解 T 细胞迁移过程中的肌动蛋白流，但它也可用于被认为分子流很重要的其他系统，例如进行细胞迁移。