Name: 在单核级LINE-1逆转录转座子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学习使用荧光原位杂交技术在单核水平可视化分析HepG2细胞系中LINE-1逆转录转座子的活性模式与速率。该方法可避免传统方法对转座事件的高估或低估，为基因组稳定性研究提供精确数据。

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本工作部分得到了美国国家环境卫生科学研究所（ES014443 和 ES017274）以及阿斯利康对 KSR 的资助。

注意：除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。有关单个试剂的制备详情，请参见试剂部分。
1. 标记L1探针
注意：探针可通过化学标记或PCR标记进行标记。
<ol>
	<li>化学标记
	<ol>
		<li>在 Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液中配制 0.7–1% 琼脂糖凝胶，微波加热至完全融化，冷却后加入溴化乙锭（0.5 µg/ml）。将凝胶倒入制胶槽，插入梳子，室温下静置使其完全凝固。</li>
		<li>根据制造商说明书，在 37 °C 下用 CY3 或 FITC 标记 SNeo 探针（1-2 µg），孵育 1 小时。 
		注意：SNeo 表示 S剪接 Neomycin基因在完成一个完整的逆转座循环后表达。探针大小约为1,000 bp。SNeo可通过PCR从任何载体或基因组DNA中扩增获得。有关链霉亲和素-CY3/FITC标记试剂的信息，请参见材料与试剂表。</li>
		<li>将标记的 SNeo 探针溶液与 1x DNA 上样缓冲液混合，加入每个加样孔中，在 75–100 伏电压下电泳 15–20 分钟。</li>
		<li>使用紫外（UV）成像仪观察探针条带。请注意，SNeo探针的大小可以调整，且也可加入锁核酸（LNA）。图2).</li>
		<li>用洁净的刀片从凝胶中切下标记的 SNeo 探针，使用 PCR 纯化试剂盒（PCR Clean-Up kit）按照制造商说明书从凝胶中溶解并纯化 SNeo 探针。 
		警告：用防护罩覆盖身体所有暴露部位（即， 实验人员在观察和切割凝胶时应穿戴实验服和防紫外线透明面罩。有关PCR产物凝胶纯化的材料与试剂信息，请参见材料与试剂表。</li>
		<li>用未标记的 SNeo 探针与 5 µl SNeo 标记探针一同在 0.7% 琼脂糖凝胶上重新电泳（见 1.1.1），以确认条带尺寸增大及信号强度降低图2).</li>
		<li>通过测量260 nm处的吸光度定量标记的SNeo探针的量，并将SNeo探针用无核酸酶水稀释至每份10 ng/µl2将分装样品储存在 -20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR标记（探针标记的替代方法）
	<ol>
		<li>将 SNeo 特异性引物（5'-ggatagcattgggagatatacct-3' 和 5'-attgaacaagatggattgcacgc-3'）与 PCR 试剂混合于同一管中：13.6 µl 无核酸酶水2O；0.1 µl dATP、dCTP、dGTP（10 nM）；0.05 µl dTTP（10 nM）；0.05 µl dUTP-生物素/dUTP-FITC/CY3（10 nM）；4 µl Go Tag 5x 缓冲液；0.4 µl Go Tag 聚合酶；1 µl SNeo 模板（10 ng）。有关PCR试剂的信息，请参见材料与试剂表。</li>
		<li>根据样本总数乘以各试剂的用量来调整试剂体积。</li>
		<li>使用以下PCR扩增程序扩增并标记SNeo探针：95 °C预变性2 min；35个循环（95 °C变性30 sec，62 °C退火30 sec，72 °C延伸60 sec）；72 °C终延伸2 min；4 °C长期保存。 
		注意：可调整退火温度或进行梯度 PCR，以确定其他探针的最佳退火温度。</li>
		<li>按照第1.1.1节方法制备0.7-1%凝胶，按第1.1.4节方法上样并观察探针条带。</li>
		<li>按照第1.1.5节的方法切割并纯化标记的SNeo探针。</li>
		<li>用未标记的 SNeo 探针重新跑 5 µl SNeo 标记的探针，以确认条带大小增加及信号强度降低（参见 图2).</li>
		<li>通过测量260 nm处的吸光度定量标记的SNeo探针的量，并将SNeo探针用无核酸酶水稀释至每份10 ng/µl2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备染色体铺片
<ol>
	<li>生成稳定表达空载体骨架（对照）或具有逆转座功能的克隆 L1 采用标准筛选方法。12,16 尽管使用了非附加体型报告基因来将研究结果与转录研究相关联，但也可使用附加体型载体。培养稳定表达对照或L1载体的细胞（1 x 106 每10 cm培养皿接种适量细胞（根据培养皿大小调整细胞数量），加入完全培养基。对于HepG2细胞，使用RPMI-1640培养基，含10% FBS和200 µg/ml潮霉素。将细胞培养至70%汇合度，培养条件为37 °C、5% CO₂。2. 
	注意：培养基的选择取决于细胞类型。由于此处使用的质粒携带潮霉素和新霉素的筛选盒，因此在潮霉素筛选后也可使用新霉素进行稳定克隆的筛选，但需优化新霉素的用量以确定每种细胞类型的耐受水平。</li>
	<li>向培养基中加入秋水仙胺（0.4 µg/ml），孵育90分钟，使细胞停滞于中期。若使用不同类型的细胞，需通过实验经验确定秋水仙胺的最佳浓度及处理时间（60、90和120分钟），以实现最佳的中期阻滞效果。</li>
	<li>用10 ml 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞2次，加入3–5 ml 0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，孵育5 min使细胞脱落。加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心细胞 2 分钟，吸除上清液，并用 DPBS 洗涤细胞。吸净 DPBS，残留 200 µl DPBS 用于重悬细胞。确保细胞充分混匀，所有团块均被分散。可通过轻弹管壁或轻柔吹打混匀并分散团块，避免涡旋振荡。</li>
	<li>加入5 ml低渗溶液（即， 75 mM KCl），在37 °C下以水平旋转15 ml离心管的方式逐滴加入，并于37 °C孵育20分钟。有关低渗溶液的获取和配制信息，请参见材料与试剂表。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 120 × g 离心 5 分钟，重复步骤 2.4 - 2.5 三次，每次洗涤后保留约 200 µl 低渗溶液用于重悬细胞。确保经过三次洗涤后，细胞沉淀明显呈白色且肿胀。</li>
	<li>将沉淀重悬于200 µl Carnoy固定液中，并用Carnoy固定液依次进行1:2、1:4、1:8、1:16的梯度稀释。从约1 cm高度将每种稀释液各取10 µl滴加至干燥洁净的载玻片上，立即用沸水产生的热蒸汽处理载玻片无液滴扩散的一面30秒。有关Carnoy固定液的配制方法，请参见材料与试剂表。</li>
	<li>在室温下干燥涂片，将涂片浸入含0.1 µg/ml Hoechst-33342的Coplin染色缸中染色15–20分钟，随后用DPBS洗涤3次。有关Hoechst-33342溶液的配制方法，请参见材料与试剂表。</li>
	<li>在荧光/相差显微镜下以40倍放大倍数观察展片。在优化展片制备后，展片 无需染色 用Hoechst-33342染色后，在相差显微镜下以10倍物镜观察铺展细胞，以确定铺展质量与细胞分离情况，具体方法见结果部分（参见 图3).</li>
	<li>使用钻石点标记笔在载玻片的另一侧选择并圈出良好的分散物即， 无扩散侧</li>
	<li>将涂布棒在 -20 °C 保存，最长可保存一个月。避免接触湿气。</li>
</ol>
3. 荧光原位杂交（FISH）
<ol>
	<li>稳定与脱水涂布 
	注意：若中期染色体铺片储存于 -20 °C，使用前需平衡至室温。有关试剂的获取与配制信息，请参见材料与试剂表。
	<ol>
		<li>在37 °C下，用200 µl RNase A孵育中期染色体铺展1小时。</li>
		<li>用2x-SSC缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟，随后用10 mM HCl溶液冲洗。</li>
		<li>在37 °C下用1%胃蛋白酶孵育涂片10分钟，用去离子水冲洗2O，并用2x-SSC缓冲液洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>用4%多聚甲醛孵育涂片10分钟，然后用2x SSC缓冲液洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>通过在乙醇系列（70%、80% 和 95% 乙醇）中孵育 2 分钟，使涂片脱水。</li>
		<li>空气干燥载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交传播随着 L1 -标记的逆转座子插入探针（即， SNeo 
	警告：对于直接标记的探针，需始终避光保存。有关试剂的获取与配制信息，请参见材料与试剂表。
	<ol>
		<li>向杂交缓冲液中加入30 ng SNeo，72 °C加热10分钟，室温冷却2分钟。</li>
		<li>向每个涂片中加入 30 µl SNeo 探针溶液，盖上盖玻片，并用橡胶胶水密封边缘。确保无气泡产生。</li>
		<li>将载玻片置于预热至72 °C的金属块上加热5分钟，逐渐降低温度至37 °C，随后在37 °C黑暗湿化孵育盒中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤与观察（或加入二抗） 
	警告：对于直接标记的探针，应始终避光保存。 
	注意：染色体制片的覆盖体积建议使用足以覆盖整个染色体铺展区域的量，具体试剂配制信息参见材料与试剂表。加盖盖玻片时会损失多余液体，因此需注意避免过量。
	<ol>
		<li>将载玻片浸入2x SSC缓冲液中以去除盖玻片。</li>
		<li>将载玻片浸入 2x-SSC 缓冲液中，在 45 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入洗涤缓冲液中，在 45 °C 下洗涤 5 分钟，重复两次。</li>
		<li>将载玻片浸入 0.1x SSC 缓冲液中，在 45 °C 下洗涤 10 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入 2x SSC 缓冲液中，在 45 °C 下洗涤 10 分钟。 
		注意：将装有推荐缓冲液的考普林瓶放入水浴中，调节温度至 45 °C。</li>
		<li>将载玻片冷却至室温，并在检测缓冲液中平衡载玻片。</li>
		<li>对于直接标记的探针，跳至步骤 3.4.10。</li>
		<li>对于间接标记探针，用封闭缓冲液封闭 20–30 分钟，然后在 DPBS 中洗涤 3 次。</li>
		<li>加入 50 µl 二抗，孵育例如，5 µg/ml 链霉亲和素-FITC 或 αCY3 封闭缓冲液）中孵育 1 小时。</li>
		<li>用2x SSC缓冲液洗涤载玻片，每次5分钟，重复两次。</li>
		<li>用 Hoechst-33342 溶液（0.1 µg/ml）复染 10 分钟。 
		注意：该染色用于染色体染色，以便与探针进行共定位。</li>
		<li>用DPBS洗涤3次，加入一滴封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘。</li>
		<li>分析 L1 使用荧光显微镜在40倍放大倍数下检测逆转座。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
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</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

全基因组测序、反向PCR和Southern印迹等方法已被用于研究L1逆转座。尽管这些方法在定位基因组中L1插入位点方面具有极高价值，但它们共同面临的一个复杂挑战是需要借助in-silico程序对序列进行重新组装。本文所述的荧光原位杂交（FISH）方法旨在补充这些技术，尤其适用于需要分析培养细胞中异位L1逆转座的研究。该方法可用于对逆转座事件进行定性和定量评估，并可应用于间期细胞核。该方法具有后续用于确定异位L1插入位点的in-silico序列比对方法的准确性16。由于同聚物的形成，重复序列的比对可能具有不确定性；此外，在引物扩增模板过程中，重复序列可能丢失，导致重复序列的代表性不足。FISH方法可克服这些问题，因为FISH探针能够与同聚物退火，且不太可能对完整的重复序列产生偏倚16。此外，与基于细胞培养的逆转座检测方法相比，FISH可在单个细胞核水平上确定逆转座频率。因此，该方法可避免对逆转座频率的低估或高估，因为单个细胞核中可能发生多次插入事件16。近期来自高通量...

人类长散布核元件-1（Long Interspersed Nuclear Element-1, LINE-1）Line-1 或 L1是一种通过以下方式在基因组内传播的自主移动元件 &#34;复制并粘贴&#34; 逆转座机制。一种典型的人类 L1 长约6 kb，包含一个作为启动子的5'非翻译区（5'UTR），以及两个开放阅读框（ORFs）： L1-ORF1 和 L1-ORF2以及带有polyA尾的3'非翻译区。 L1-ORF1蛋白包含三个不同的结构域：卷曲螺旋结构域、RNA识别基序和C端结构域，而 L1-ORF2蛋白含有内切酶、逆转录酶和富含半胱氨酸的结构域1,2,3,4,5. L1-ORF1 表现出核酸伴侣活性，而 L1-ORF2 提供酶活性，两种蛋白均为逆转座所必需1,2,6.
一个 L1 逆转座循环始于 RNA 聚合酶 II 从 L1 双顺反子 mRNA 的 5' 非翻译区（5'UTR）启动转录，随后转录产物移位至细胞质并进行翻译。在细胞质中，L1-ORF1 蛋白可表现出 cis-结合，即包装其自身的 RNA，或表现出 trans-结合，即包装其他 RNA（例如，SINE/SVA/假基因），从而与 L1-ORF2p 共同形成核糖核蛋白颗粒（RNP）7,8。RNP 进入细胞核后，L1-ORF2p 的核酸内切酶活性切割基因组 DNA（gDNA），暴露出一个 OH- 基团9，该基团随后被逆转录酶用作引物，从 RNA 的 3' 端起始逆转录合成 DNA。在逆转录过程中，DNA 的第二条链在原始切口位点下游 7–20 bp 处被再次切割，形成交错断裂，随后填补缺口，生成特征性的 L1 插入序列（例如，TTTTAA），称为靶位点重复序列（target site duplications, TSD）9,10。该过程被称为靶位引物逆转录（target prime reverse transcription, TPRT），导致完整或截短的 L1/其他 DNA 序列插入基因组，且插入序列两端均带有 TSD。此外，已有研究表明，在某些细胞类型中，L1 逆转座也可通过类似 TPRT 的非同源末端连接机制介导11。
本研究中使用的 L1 逆转座载体为非附加体型，包含由CMV-L1-5'UTR复合启动子驱动的带标签 L1-ORF1&amp;#38;2p（图1）12。该载体的早期版本已在利用酵母和人类细胞培养的研究中被描述过13,14,15。该载体两端分别含有两个不同的CMV启动子，位于3'端的启动子方向相反，可在剪接和整合后驱动新霉素抗性基因（neomycin）的表达。位于3'端的逆转座指示盒包含一个反向插入 L1-ORF 的新霉素基因，该基因因被β-珠蛋白内含子分割为两部分而失活，该内含子含有剪接供体（SD）和剪接受体（SA）位点（图1）。当整合至染色体后，L1 从共用启动子转录生成一条包含双顺反子mRNA和失活的新霉素mRNA的转录本。在RNA加工过程中，β-珠蛋白内含子从新霉素基因中被剪除，从而恢复新霉素基因的完整功能。该杂交mRNA以顺式（cis）方式被包装成核糖核蛋白复合物（RNP），并转运至细胞核，在核内通过逆转录转座机制（TPRT）整合到基因组中，形成全长或截短的插入序列。
本文描述了一种利用荧光原位杂交（FISH）的技术方法，该方法使用特异性靶向剪接新霉素基因（SNeo）的探针，在单细胞核水平上追踪L1逆转座子的转座模式及插入频率。通过具有逆转座活性和无逆转座活性的构建体，以及用于检测SNeo或新霉素基因与珠蛋白内含子连接处的探针，验证了该方法检测的效率与特异性16。该技术克服了基于细胞培养的逆转座检测方法中存在的一些局限性，例如多重插入、克隆抗性以及优势克隆扩增等问题。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;标记探针&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Go Tag DNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x无色缓冲液</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>单个dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>将dATP、dGTP、dCTP的浓度调整为2&amp;nbsp;mM，dTTP调整为1.5&amp;nbsp;mM，溶于无核酸酶水中。</td></tr><tr><td>dUTP-16-生物素（0.5&amp;nbsp;mM）</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC（0.5&amp;nbsp;mM）</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3（0.5&amp;nbsp;mM）</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH标记试剂盒</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH标记试剂盒</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>可使用任何PCR纯化试剂替代NucleoSpin PCR纯化试剂盒</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td>可使用任意热循环仪扩增标记产物。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;制备染色体铺展&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>秋水仙胺（Colcemid）</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15212-012</td><td>将秋水仙胺直接加入培养基中，终浓度为0.4&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>将1&amp;nbsp;M KCl溶液稀释至75&amp;nbsp;mM，配制低渗溶液</td></tr><tr><td>卡诺固定液（Carnoy Fixative Solution）</td><td></td><td></td><td>按3体积甲醇与1体积乙酸混合配制卡诺固定液。每次使用前新鲜配制。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>将Hoechst-33342溶于PBS中，终浓度为1&amp;nbsp;mg/ml。</td></tr><tr><td>钻石点标记笔</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>磨砂载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>R001100</td><td>为消化细胞，将细胞在胰蛋白酶中孵育5分钟，然后加入等体积完全培养基终止反应。</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶（Coplin Jars）</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td></td><td></td><td>可使用任意加热金属块，但推荐使用专为加热载玻片设计的加热块。</td></tr><tr><td>烧杯（600&amp;nbsp;ml）</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>在烧杯中加水至沸腾，利用热蒸汽使染色体破裂。</td></tr><tr><td>尼康显微镜</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>可使用任意显微镜观察染色体铺展质量。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;FISH实验试剂与材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl（N）</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>将Hoechst-33342溶于PBS中，终浓度为1&amp;nbsp;mg/ml。</td></tr><tr><td>橡胶胶水/细胞粘合密封剂&amp;nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>七个柯普林瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>避光湿盒</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>干燥数字加热金属块</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x 柠檬酸钠-氯化钠溶液（20x SSC）</td><td></td><td></td><td>将175 g NaCl和88.2&amp;nbsp;g柠檬酸三钠溶于800 ml分子级H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O中，搅拌并调节pH至7。待所有盐完全溶解后，定容至1 L，经0.22 &amp;micro;m滤膜过滤。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mg/ml RNase A</td><td></td><td></td><td>将20x SSC缓冲液稀释为2x SSC缓冲液，将RNase A溶于2x SSC缓冲液中，终浓度为1&amp;nbsp;mg/ml。每次使用前新鲜配制。</td></tr><tr><td>1% 胃蛋白酶</td><td></td><td></td><td>将胃蛋白酶（W/V）溶于10 mM HCl中，配制成终浓度为1%的溶液。每次使用前新鲜配制。</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（4% PFA）</td><td></td><td></td><td>在通风橱中称取4.0 g PFA，加入50 ml 1x PBS，搅拌并加热至60&amp;nbsp;&amp;deg;C，逐滴加入NaOH调节pH，直至PFA完全溶解且溶液澄清。定容至100&amp;nbsp;ml，经0.22 &amp;micro;m滤膜过滤，分装为5 ml每份，于-20&amp;nbsp;&amp;deg;C保存。后续使用时，于37 &amp;deg;C融化一份PFA，持续10-15分钟。根据多聚甲醛用量调整滤膜规格。</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>将100 ml甲酰胺（20%）与2.5 ml 20x SSC混合，用1.0 M HCl调节pH至7，并用分子级H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O定容至500 ml。</td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td>在2x SSC缓冲液中加入50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、0.1% SDS和300 ng/ml鲑鱼精DNA。甲酰胺的含量决定染色单体的聚焦程度；需进行梯度优化。</td></tr><tr><td>检测缓冲液</td><td></td><td></td><td>将20x SSC缓冲液稀释为4x，并加入0.2% Tween-20，配制成检测缓冲液。</td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td>在4x SSC缓冲液中加入5%牛血清白蛋白（BSA）和0.2% Tween-20。</td></tr><tr><td>脱水溶液</td><td></td><td></td><td>配制70%、80%和95%的乙醇溶液。</td></tr></tbody></table>

单细胞核水平下的line-1逆转座子插入分析

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

长散布核元件-1（Long interspersed nuclear element-1，Line-1 或 L1）约占人类基因组中DNA的17%。尽管其中大部分 L1由于5'端截短而失活，但仍有约80-100个此类元件保持逆转座活性，可通过RNA中间体在基因组中不同位置进行扩增。而较古老的 L1s 被认为靶向基因组中富含AT的区域，而更新、活性更强的染色体靶点 L1s 定义尚不明确。本文描述了荧光 原位 杂交（FISH）技术，可用于追踪模式 L1 插入与异位发生率 L1 单细胞核水平的整合. 在这些实验中，采用异硫氰酸荧光素/花青素-3（FITC/CY3）标记的新霉素探针来追踪 L1 逆转座 体外 在稳定表达外源基因的HepG2细胞中 L1该方法可避免因毒性导致的逆转座率估算误差，并能计入多个插入事件发生在同一细胞核中的情况。

示意图 L1 逆转录转座载体被展示于 图1. 该载体包含一个以反义方向排列的新霉素基因 L1 由珠蛋白内含子以正义方向插入而中断的ORF，并位于SD和SA位点之间。当稳定整合到染色体中时， L1 mRNA 由联合的 CMV 和 L1-5'UTR 启动子转录而来（图1）。在RNA加工过程中，珠蛋白内含子从新霉素基因中被剪切出去。Neo-L1 RNA 被包装、转运并整合到基因组中，形成全长或截短的插入序列。如所示， L1 通过使用针对剪接型新霉素（spliced neomycin）的特异性探针进行FISH，可追踪逆转座事件图1).
图2展示了新霉素探针的示意图，其中标记的探针由于激发波长的差异，尺寸较大且荧光较弱。请注意，CY3和FI...

本研究采用 FISH 技术，在稳定表达合成 LINE-1 的 HepG2 细胞系染色体铺展样本中，于单细胞核水平追踪 LINE-1 的逆转座活动。

单细胞核水平下的LINE-1逆转座子插入分析

长散布核元件-1（Line-1 或 L1）约占人类基因组 DNA 的 17%。尽管大多数 L1 序列已失去转座活性，但仍有少数保留了自主复制能力。

本实验的总体目标是利用荧光原位杂交（FISH）技术，在单细胞核水平上可视化并分析L-1逆转座的频率和模式。该方法的主要优势在于能够避免对逆转座频率和模式的过高或过低估计，当与其他方法结合使用时，可实现对单个细胞核中L-1逆转座事件的研究。今天的实验由实验室高级研究员Pasano Bojang博士进行。首先，根据文本方案，用TAE缓冲液配制0.7%至1%的琼脂糖凝胶，使用CY3或FITC标记SNeo探针，并按照生产商方案在37摄氏度下孵育1小时。将标记好的SNeo探针溶液与1X DNA上样缓冲液混合后，加入琼脂糖凝胶的加样孔中。然后在75至100伏电压下电泳15至20分钟。使用紫外成像仪观察探针条带。用洁净的刀片从凝胶中切下标记的 SNeo 探针。然后根据制造商的说明书，使用 PCR 纯化试剂盒溶解并纯化 SNeo 探针。纯化后，将5微升SNeo标记的探针与未标记的SNeo探针一同在0.7%琼脂糖凝胶上重新电泳，以确认其尺寸增加及信号强度的降低。为定量标记的SNeo探针含量，测定其在260纳米处的吸光度，并用无核酸酶水将SNeo探针稀释至每微升10纳克的分装 aliquot。将分装样品于-20摄氏度保存。在获得稳定表达具有逆转座活性的L-1或空载体骨架的克隆后，培养稳定表达对照载体或L-1载体的HepG2细胞。向培养基中加入终浓度为0.4微克/毫升的秋水仙胺，并孵育90分钟，使细胞停滞于有丝分裂中期。使用 10 毫升 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞两次。然后加入 0.25% 胰蛋白酶溶液，孵育 5 分钟。加入含 10% FBS 的培养基以灭活胰蛋白酶。接下来，将细胞转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以1,000 ×g离心2分钟。然后吸除细胞沉淀中的上清液，并用DPBS洗涤细胞。吸除上清液，仅保留200 µL DPBS，通过轻弹管底或轻柔吹打重悬细胞，确保细胞充分混匀且无团块。将试管水平旋转，逐滴加入5 mL预热的低渗溶液，于37摄氏度孵育20分钟。在120 ×g、4摄氏度条件下离心5分钟。随后除去上清液，仅保留200 µL低渗溶液。用固定液洗涤三次，每次洗涤后在细胞中保留约 200 微升固定液。三次洗涤后，检查沉淀是否明显呈白色且肿胀。然后用 200 微升卡诺伊固定液重悬沉淀，并用该固定液对重悬的细胞进行以下稀释。从约一厘米高处，将每种稀释液各取 10 微升滴加到干燥、洁净的载玻片上，立即用沸水产生的热蒸汽处理载玻片无涂布面 30 秒。室温下干燥涂片后，用含 DAPI 的封片剂染色，并加盖盖玻片。孵育结束后，用 DPBS 洗涤载玻片三次。使用基于荧光的对比显微镜在 40 倍放大倍数下观察铺展样品。在优化铺展制备后，无需对样品进行染色。要标记优质的铺展样品，可在载玻片的另一侧使用金刚石笔进行标记。为稳定和脱水中期染色体铺展，向样品中加入 200 微升 RNase A，在 37 摄氏度下孵育一小时。用 2X SSC 缓冲液将载玻片洗涤两次，每次五分钟，并用 10 毫摩尔 HCl 冲洗样品。然后向染色体铺展中加入 1% 胃蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。使用去离子水冲洗载玻片后，用 2X SSC 缓冲液洗涤样本两次，每次五分钟。然后向涂片中加入 4% 多聚甲醛，孵育 10 分钟，再进行两次额外的 2X SSC 缓冲液洗涤。SSC 洗涤完成后，将样本依次在下列乙醇系列中各孵育两分钟，以完成涂片的脱水处理。向杂交缓冲液中加入30纳克SNeo，72摄氏度加热10分钟，然后在室温下冷却2分钟。接着，将30微升SNeo探针移液至每个展片上，并用盖玻片覆盖样品。使用橡胶水泥密封边缘，确保不产生气泡。将载玻片置于72摄氏度的加热块上保持5分钟。随后逐渐将温度降至37摄氏度。在37摄氏度的湿化密闭 chamber 中避光孵育过夜。加入二抗时，首先将载玻片浸入2X SSC缓冲液中以去除盖玻片。随后将载玻片在45摄氏度的2X SSC缓冲液中浸泡5分钟进行洗涤，然后将样本转移至洗涤缓冲液中，在45摄氏度下洗涤两次，每次5分钟。接下来，将载玻片浸入45摄氏度的0.1X SSC缓冲液中孵育10分钟。然后在45摄氏度的2X SSC缓冲液中洗涤载玻片10分钟。将载玻片冷却至室温后，对于直接标记的探针，使用2X SSC缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。在室温下用检测缓冲液平衡载玻片10分钟。然后加入含DAPI的封片剂，对样本进行复染10分钟。放置盖玻片，并用指甲油密封边缘。最后，在40倍放大倍数下使用荧光显微镜分析L-1逆转座。如下图所示，通过制备不同稀释度的样本，并对每个染色体铺展的密度、分布以及与细胞核的距离进行评估，从而确定中期染色体铺展的密度。选择染色体分散均匀且密度较低的标本进行后续分析。这些图像代表了用 Hoechst 染料 DAPI 染色的染色体铺展样本，铺展质量根据染色体长度、铺展的圆整度以及染色体间距离进行评估。若细胞在低渗溶液中孵育时间过短，染色体铺展会变得紧密缠结，难以观察单个染色体。然而，低渗溶液中孵育时间过长会导致细胞核破裂、染色体散失和/或染色体丢失。秋水仙胺孵育时间延长可增加中期细胞的数量，但会导致染色体过度凝集。如图所示，秋水仙胺孵育90分钟、37摄氏度下低渗溶液处理20分钟，并使用热蒸汽使细胞破裂，是获得高质量染色体展片的最佳条件。在本实验中，使用靶向 SNeo 的探针对染色体铺展进行染色，以检测 L-1 逆转座。该探针同时用 FITC 和 CY3 标记，结果表明，在两种情况下，仅在表达野生型 L-1 的细胞中观察到 L-1 逆转座。一旦掌握该技术，尤其是当杂交时间控制在两到四小时且操作得当的情况下，整个实验可在六至八小时内完成。在进行该技术操作时，彻底清洗、优化杂交时间以及对dNTP探针进行化学标记以避免污染至关重要。为了回答诸如插入片段的染色体定位等附加问题，可进一步采用L-1测序和G显带等技术。观看本视频后，您将充分掌握如何标记L-1探针、制备染色体铺展样本，以及利用荧光原位杂交技术检测L-1逆转座的模式与速率。该技术为研究L-1逆转座的模式以及L-1插入位点铺平了道路。需要牢记的是，在使用有毒试剂、生物试剂以及紫外光时，采取佩戴手套和防护装备等预防措施至关重要。

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科研

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Biology

生物学

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