转录组分析]活体生产牛胚胎植入前胚胎采用双色微阵列平台

本视频的总体目标是提供一种优化的技术程序，使用来自第 7 天的牛胚胎的少量总 RNA，使用双色定制牛阵列。这种方法可以帮助回答有关高产奶牛胚胎丢失的关键问题，以及有关胚胎质量相对于植入前发育中的胚胎基因表达的问题。这项技术的优点是，我们可以使用从单个胚胎中提取的皮克级总 RNA 来研究基因表达。

这种方法可以深入了解影响体内产生的牛植入前胚胎存活的因素。这也有助于改进生殖技术，例如体外胚胎生产。要开始该程序，请使用基于柱的 pico scale RNA 提取试剂盒在微量离心管中制备快照冷冻牛胚胎。

向试管中加入 10 微升裂解缓冲液，并在 42 摄氏度下孵育胚胎 30 分钟。然后，将试管以 800 次离心 2 分钟，将 250 μL 调节缓冲液移入纯化柱滤膜中，并在室温下孵育柱 5 分钟。将收集管以 16， 000 倍 G 离心 1 分钟，以完成色谱柱的预处理。

将 10 微升 70% 乙醇加入裂解缓冲液和胚胎的混合物中，并充分混合。然后，将混合物加载到纯化柱上。将色谱柱以 100 倍 G 离心 2 分钟，然后以 16， 000 倍 G 离心 30 秒。

向色谱柱中加入 100 μL 第一洗涤缓冲液，并以 8， 000 倍 G 离心 1 分钟。使用 DNase 试剂盒，将 5 μL 储备液与 35 μL 缓冲液混合，然后轻轻倒置封闭的试管进行混合。然后，将 DNase 混合物上样到纯化柱膜上，并在室温下孵育 15 分钟。

向色谱柱中加入 40 μL 第一种洗涤缓冲液，并以 8， 000 倍 G 离心 15 秒。然后，加入 100 微升第二种洗涤缓冲液，离心一分钟。向柱中加入第二洗涤缓冲液的另一部分，并以 16， 000 次 G 离心 2 分钟，将纯化柱转移到另一个微量离心管中，并将 11 微升洗脱缓冲液加载到柱膜上。

在室温下孵育色谱柱 1 分钟。将色谱柱以 1， 000 倍 G 离心 1 分钟，然后在 16， 000 倍 G 下再离心一分钟，检查洗脱 RNA 的质量和数量，然后将样品储存在负 80 摄氏度下。使用扩增试剂盒扩增 100 pg 的高质量 RNA。

通过基于荧光的定量评估扩增的 aRNA 的大小范围。然后，通过分光光度法测定 aRNA 的浓度。用标准试剂盒制备两微克扩增的 aRNA，用于荧光标记。

在暗室中设置臭氧箱，并等待臭氧水平降低到百万分之 0.001。将暗室滤镜放在灯上。然后，将样品放入臭氧盒中，加入花青五染料和标记缓冲液各 2 微升。

在安全光照下将样品置于安全光照下，加入不含 RNase 的水，使总体积达到 20 μL。轻轻混合样品，然后将试管在 85 摄氏度的热循环仪中孵育 15 分钟。将样品在冰上冷却 1 分钟，然后离心样品。

用 RNA 提取试剂盒清理标记和扩增的 aRNA。使用适当类型的光谱仪，确定标记、扩增的 aRNA 的浓度。准备第二个用花青素三染料标记的扩增 aRNA 样品。

将 aRNA 样品在零下 80 摄氏度下储存长达三天。混合 Cy3 和 5 标记的 aRNA 各 825 ng。除此之外，还有阻塞缓冲区和碎片缓冲区。

将混合物在 60 摄氏度下孵育 15 分钟，然后在冰上冷却 1 分钟。加入 55 μL 杂交缓冲液，充分混合，不引入气泡。将混合物以 11， 300 倍 G 离心 1 分钟。

将 100 μL 样品加载到阵列载玻片上，并将载玻片密封在杂交室中。在 65 °C 下杂交样品 17 小时，同时以每分钟旋转 10 次的速度旋转。制备臭氧清除稳定和干燥溶液。

清洗阵列，采取预防措施以尽量减少与臭氧的接触，然后将它们浸入稳定和干燥溶液中 30 秒。确保阵列表面干燥且无灰尘。将数组存放在黑暗的地方。

打开微阵列扫描仪，然后等待它准备好进行扫描。然后，加载左侧条形码的数组。执行点分析，并将数据另存为 GPR 文件。

在统计分析软件中，对数据进行归一化和分析。计算正点选择阈值，并查看杂交信号和背景信号的曲线。在数组内执行 Loess 归一化，然后在数组之间执行分位数归一化。

将规范化数据导出到电子表格文件。使用微阵列芯片数据存储库中的所有阳性信号创建选定独特基因的 ID 列表。将 ID 列表上传到蛋白质分类和分析数据库，选择 bos taurus 作为生物体，并执行默认的统计过高表示测试。

经过两轮扩增后，片段大小非常相似，质量也很好。通过这种方法成功扩增应产生至少增加 1000 倍的 aRNA。高质量的微阵列图像在两个通道上都具有高光斑强度和低背景强度。

如果背景强度太高，信号分辨率会很差。大约 46% 的斑点高于背景，从中分离出 6， 765 个在囊胚中表达的独特 RNA 转录本。统计过度代表测试表明，前 10 个基因本体术语代表活跃的细胞分裂过程。

这项技术的发展使动物生殖领域的研究人员能够探索胚胎基因表达并评估各种因素如何影响发育中的胚胎。这项技术也已在其他重要物种中得到发展，例如猪。在此程序之后，可以使用其他方法（如定量 PCR）来验证微阵列结果。

观看此视频后，您应该对如何从胚胎中提取 RNA 以及如何扩增和标记 RNA 以进行双色微阵列分析有很好的了解。