转录组分析 体内 利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎

本视频的总体目标是提供一种优化的技术流程，利用七日龄牛胚胎的少量总RNA，结合定制的双色牛基因芯片进行分析。该方法有助于解答有关高产奶牛胚胎丢失的关键问题，以及胚胎着床前发育过程中胚胎质量与基因表达之间的关系。该技术的优势在于，我们能够利用单个胚胎中提取的皮克水平的总RNA来研究基因表达。

该方法可揭示影响体内发育的牛着床前胚胎存活的因素，同时有助于改进体外胚胎生产等生殖技术。开始实验前，从基于柱式的微量RNA提取试剂盒中，准备装有速冻牛胚胎的微量离心管。

向离心管中加入10 µL裂解缓冲液，将胚胎在42 °C孵育30分钟。然后在800 ×g条件下离心2分钟。用移液器将250 µL平衡缓冲液加入纯化柱的滤膜中，在室温下孵育5分钟。将收集管在16,000 ×g条件下离心1分钟，完成对纯化柱的预处理。

向裂解缓冲液与胚胎的混合物中加入 10 µL 70% 乙醇，充分混匀。然后将混合物加载至纯化柱中。先以 100 × g 离心 2 分钟，再以 16,000 × g 离心 30 秒。

向柱中加入 100 微升第一种洗涤缓冲液，以 8,000 × g 离心 1 分钟。使用 DNase 试剂盒，将 5 微升储存液与 35 微升缓冲液混合，通过轻轻颠倒封闭的管子进行混匀。然后，将 DNase 混合液加样至纯化柱膜上，在室温下孵育 15 分钟。

向柱中加入40 µL第一种洗涤缓冲液，8,000 ×g离心15秒。然后加入100 µL第二种洗涤缓冲液，离心1分钟。再向柱中加入一份第二种洗涤缓冲液，16,000 ×g离心2分钟。将纯化柱转移至另一微量离心管中，并在柱膜上加载11 µL洗脱缓冲液。

室温孵育柱子一分钟。在1,000 ×g条件下离心柱子一分钟，然后在16,000 ×g条件下再离心一分钟。检测洗脱RNA的质量和数量，随后将样品储存在负80摄氏度。使用扩增试剂盒扩增100皮克高质量RNA。

使用基于荧光的定量方法评估扩增后aRNA的片段大小范围，然后通过分光光度法测定aRNA的浓度。使用标准试剂盒，为荧光标记准备两微克的扩增aRNA。

在暗室中设置臭氧箱，并等待臭氧浓度降至0.001 ppm。在光源上覆盖暗室滤光片。然后将样品放入臭氧箱中，各加入2 µL的氰基五染料和标记缓冲液。

在避光条件下，向样品中加入无RNase的水，使总体积达到20微升。轻轻混匀样品，然后将离心管放入热循环仪中，在85摄氏度孵育15分钟。将样品在冰上冷却1分钟，随后离心收集样品。

使用RNA提取试剂盒纯化标记并扩增的aRNA。采用适当类型的分光光度计测定标记后扩增aRNA的浓度。制备另一份用Cy3染料标记的扩增aRNA样品。

将aRNA样本在负80摄氏度下保存最多三天。取825纳克Cy3标记和5-标记的aRNA各一份，加入封闭缓冲液和片段化缓冲液。

将混合物在60摄氏度孵育15分钟，然后在冰上冷却1分钟。加入55微升杂交缓冲液，充分混匀，避免引入气泡。将混合物在11,300 × g离心1分钟。

将100微升样品加入阵列玻片上，并将玻片密封于杂交室中。在65摄氏度下以每分钟10转的速度旋转杂交17小时。配制臭氧清除型稳定干燥溶液。

清洗芯片，注意尽量减少与臭氧的接触，然后将其浸入稳定与干燥溶液中30秒。确保芯片表面干燥且无灰尘。将芯片存放在避光处。

打开微阵列扫描仪，并等待其准备就绪。然后将带有条形码的芯片左侧放入扫描仪中。进行斑点分析，并将数据保存为 GPR 文件。

在统计分析软件中对数据进行标准化和分析。计算阳性斑点筛选阈值，并查看杂交信号与背景信号的图谱。先在芯片内进行Loess标准化，然后在芯片间进行分位数标准化。

将标准化后的数据导出至电子表格文件。利用微阵列数据仓库中所有阳性信号生成所选独特基因的ID列表。将该ID列表上传至蛋白质分类与分析数据库，选择物种为bos taurus，并执行默认的统计富集分析。

经过两轮扩增后，片段大小非常接近且质量良好。采用该方法成功扩增应至少获得一千倍的aRNA增加量。高质量的微阵列图像在两个通道上均具有高信号点强度和低背景强度。

如果背景强度过高，信号分辨率将会降低。约有46%的点高于背景，从中分离出在胚泡中表达的6,765种独特的RNA转录本。统计学富集分析表明，排名前10的基因本体术语代表了活跃的细胞分裂过程。

该技术的建立使动物繁殖领域的研究人员能够探索胚胎基因表达，并评估各种因素对发育中胚胎的影响。该技术也已在其他重要物种（如猪）中得到发展。在完成该操作步骤后，可采用定量 PCR 等其他方法对微阵列结果进行验证。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从胚胎中提取 RNA，以及如何扩增和标记 RNA 以进行双色微阵列分析。