Name: 转录组分析 活体生产牛胚胎植入前胚胎采用双色微阵列平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解使用双色定制牛微阵列平台对第七天牛胚胎进行转录组分析的方法。该技术利用皮克级总RNA实现基因表达定量检测，为研究胚胎质量与植入前存活因素提供重要工具。

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本研究由阿尔伯塔省畜牧与肉类署、阿尔伯塔创新—生物解决方案、阿尔伯塔牛奶协会以及阿尔伯塔农业与林业部畜牧研究处资助支持。

本研究的动物实验部分在加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学代谢研究组进行，所有动物实验程序均经艾伯塔大学动物护理与使用委员会批准（方案编号 # AUP00000131），动物饲养和护理均遵循加拿大动物护理委员会（1993年）的指导原则。
1. 胚胎制备、总RNA提取及DNase处理
<ol>
	<li>有关动物实验方案和胚胎收集，请参见我们之前的发表文献17, 18.</li>
	<li>将来自每头牛的相似发育阶段的胚胎在液氮中汇集并快速冷冻，随后于 -80 °C 保存直至进行 RNA 提取。</li>
	<li>提取总RNA 通过 一种基于层析柱的RNA提取试剂盒，可从小至皮克级的样品中提取RNA（试剂盒信息见材料清单）。 
	注意：推荐试剂盒包含：预处理缓冲液、提取缓冲液、70% 乙醇、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗脱缓冲液、RNA 纯化柱（含收集管）以及微量离心管。</li>
	<li>向含有胚胎的离心管中加入10 µL提取缓冲液，于42 °C孵育30分钟。以800 x g离心2分钟，使细胞提取物收集至微量离心管中。</li>
	<li>用移液器将250 µL洗脱缓冲液加入纯化柱滤膜上。在室温下用洗脱缓冲液孵育RNA纯化柱5分钟。将纯化柱放入收集管中，在16,000 x g离心1分钟。</li>
	<li>将10 µL 70%乙醇加入RNA提取缓冲液与胚胎的混合物中，通过移液操作上下吹打充分混匀。将混合液转移至预处理的纯化柱中。</li>
	<li>为结合RNA，先将纯化柱在100 × g条件下离心2分钟，随后立即在16,000 × g条件下离心30秒，以去除流穿液。</li>
	<li>将100 µL洗涤缓冲液1加入纯化柱中，8,000 x g离心1分钟。 
	注意：如果在RNA提取后进行逆转录或扩增反应，建议进行DNase处理。</li>
	<li>在步骤1.8之后立即消化基因组DNA。 
	注意：推荐的DNase试剂盒见材料列表。推荐试剂盒包含：DNase I 储存液和缓冲液。</li>
	<li>将5 µL DNase I 储存液与35 µL缓冲液混合，配制DNase孵育混合液。轻轻颠倒混匀。</li>
	<li>将40 µL DNase孵育混合液直接用移液器加入纯化柱膜中，在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将40 µL洗脱缓冲液1加入纯化柱膜中，然后在8,000 × g离心15秒。</li>
	<li>用移液器将100 µL洗脱缓冲液2加入纯化柱中，于8,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>向纯化柱中再加入100 µL 洗涤缓冲液2，于16,000 × g离心2分钟。</li>
	<li>将纯化柱转移至新的0.5 mL微量离心管中。用移液器将11 µL洗脱缓冲液直接加到纯化柱的膜上。为确保洗脱缓冲液充分被膜吸收，在加入洗脱缓冲液时，轻轻将移液器吸头接触膜表面。</li>
	<li>室温孵育柱子1分钟。先在1,000 × g离心1分钟，使洗脱缓冲液充分分布于柱中，然后在16,000 × g离心1分钟以洗脱RNA。</li>
	<li>根据制造商说明书使用生物分析仪评估RNA的质量和数量19.</li>
	<li>将RNA样品于-80 °C保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 用于微阵列分析的RNA扩增与标记
注意：对于首次进行RNA扩增和标记操作的用户，建议在实际aRNA样本中加入5 ng的外源性RNA（spike-in RNA），以监测RNA扩增和杂交过程的质量控制。该外源性RNA混合物包含十种 体外 以预定比例合成并进行多聚腺苷酸化的转录本。当操作正确执行时，标记的转录本仅特异性地与芯片上的互补对照探针杂交，杂交信号可被扫描用于追踪质量控制，且几乎不产生自身杂交或交叉杂交。关于芯片扫描后数据的外源性对照信号强度及标准化处理的更多详细信息，请参见先前发表的文献。20, 21以下步骤提供给常规微阵列使用者。
<ol>
	<li>准备100 pg高质量RNA样品（RNA完整性数值（RIN）至少&#62; 7.0），总体积为10 - 11 µL。</li>
	<li>使用能够处理皮克级样品（低至100 pg）的扩增试剂盒对RNA样品进行扩增。 
	注意：推荐的扩增试剂盒信息见材料列表，操作严格按照制造商说明书进行，不做任何修改。</li>
	<li>采用基于荧光的定量方法评估扩增后aRNA的片段大小分布情况。</li>
	<li>使用分光光度计（基于260 nm和280 nm处的吸光度）测定扩增后aRNA的浓度。</li>
	<li>将扩增后的aRNA储存于-80 °C，直至准备进行标记。</li>
	<li>根据ULS aRNA标记试剂盒用户指南，使用2 µg扩增RNA进行荧光标记。 
	注意：由于Cyanine 547和Cyanine 647染料对光降解敏感，且Cyanine 647染料易受臭氧降解，因此标记过程需在尽可能避光和无臭氧的环境中进行。</li>
	<li>开启臭氧清除箱（图1A），直至臭氧浓度降至0.001 ppm。</li>
	<li>在臭氧清除箱内（图1B），在安全光源下加入2 µL Cyanine 547或Cyanine 647染料、2 µL标记缓冲液，并用无RNase水调整终体积至20 µL。在光源上加装暗室滤光片。</li>
	<li>轻轻混匀后，将反应管置于热循环仪中，在85 °C孵育15分钟。随后将样品置于冰上至少1分钟。短暂离心收集管内液体，然后使用RNA提取试剂盒进行纯化（跳过与DNase处理相关的步骤1.9至1.11），以去除未结合的Cy染料，获得标记后的扩增RNA。</li>
	<li>使用分光光度计测定标记后扩增RNA的浓度，并将标记的aRNA在-80 °C保存，最多不超过3天，之后尽快使用。</li>
</ol>
3. 微阵列杂交与洗涤
注意：以下重要步骤根据双色微阵列基因表达分析方案（版本 6.5，2010 年 5 月）进行了相应调整。
<ol>
	<li>取等量的825 ng Cyanine 547和Cyanine 647标记的aRNA，加入25倍体积的片段化缓冲液和10倍体积的封闭缓冲液，混匀。</li>
	<li>在60 °C下加热15分钟，然后在冰上冷却1分钟。</li>
	<li>加入等体积的2倍杂交缓冲液，充分混匀。</li>
	<li>以13,000 rpm离心，混合物即可用于杂交。</li>
	<li>取100 µL上述混合液加载至芯片载玻片上，并将载玻片密封于杂交 chamber 内。</li>
	<li>将组装好的杂交 chamber 放入杂交炉中，在65 °C、10 rpm旋转条件下孵育17小时。</li>
	<li>根据实验方案对芯片进行洗涤，并进行臭氧保护处理：将芯片浸入稳定与干燥溶液中30秒。</li>
	<li>将芯片从溶液中取出，确保芯片表面干燥且无灰尘颗粒。</li>
</ol>
4. 扫描微阵列玻片
<ol>
	<li>将芯片置于暗处，并开启扫描仪，待其准备就绪（等待 15 分钟）。</li>
	<li>将芯片条形码从左侧放入扫描仪，开始扫描。根据软件用户指南进行斑点分析，并将数据保存为（gpr）文件格式。</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>下载 FlexArray 软件 http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php，点击 “导入原始数据”，并将 gpr 文件加载到 FlexArray 中。</li>
	<li>如有需要，按照说明进行归一化和统计分析。注意：本研究中阳性信号点筛选阈值的计算方法参见先前文献22。</li>
	<li>在 FlexArray 的图谱查看器中，从下拉菜单选择手动模式，以查看所有杂交信号点及背景信号。注意：微阵列杂交后内参对照的信号图示可参见先前研究8。</li>
	<li>根据 FlexArray 下拉菜单中的选项，依次选择采用 Loess 方法进行芯片内归一化，然后采用分位数法进行芯片间归一化。</li>
	<li>将 FlexArray 中所有归一化后的数据导出为 Excel 文件，以供后续使用。</li>
</ol>
6. 生物信息学分析
此前已有文献描述了来自牛胚胎特异性转录本（Bovine Embryo-specific Transcripts，BESTv1）微阵列的探针序列原始注释8。在本研究中，通过EmbryoGENE实验室信息管理系统（LIMS）ELMA（http://elma.embryo-gene.ca）获得了20,403个唯一的基因符号（GS）（<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">补充文件1</a>）。从中筛选出6,765个唯一基因的列表（<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">补充文件2</a>），这些基因对应于牛第7天胚胎基因表达谱在微阵列标准化处理（步骤5.5）后所得的所有阳性信号。阳性信号阈值是根据先前发表的研究16中A值的信号强度计算得出的。
<ol>
	<li>使用PANTHER（通过进化关系进行蛋白质分析）分类系统23, 24进行功能分析时，请打开以下链接（http://www.pantherdb.org/about.jsp）。</li>
	<li>上传包含6,765个胚胎特异性GS的列表，利用统计过表达检验方法识别胚胎发育过程中特定的生物学过程，并使用软件默认的参考基因列表Bos taurus（数据库中所有基因）25。 
	注意：这可通过二项检验，识别出在GO术语中统计上显著过表达或低表达的发育相关过程。</li>
	<li>将P值阈值设为&#60; 0.05（软件默认设置）。数据可下载并导出为Excel文件，以便进一步筛选16。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用第7天牛胚胎进行微阵列分析时，首要问题是难以获得足量的高质量RNA用于基因表达研究。传统的苯酚/氯仿RNA提取结合乙醇沉淀法不推荐用于第7天胚胎，因其产率较低，且残留的苯酚可能抑制RNA扩增反应。相比之下，采用标准的柱式法更适宜用于分离总RNA，然后用最小体积的洗脱缓冲液洗脱RNA以提高其浓度。在本研究中，每个胚胎平均获得780 pg的总RNA，与其他采用相同方法26以及相同RNA提取试剂盒27，28的报道结果相当。在RNA提取过程中，建议在使用前充分混匀以溶解沉淀物，或对提取缓冲液管进行温育，以重新溶解缓冲液后再使用。此外，提取步骤中的孵育时间对RNA得率也至关重要。在42 °C孵育时间少于完整的30分钟会降低RNA得率。
柱上DNase消化是总RNA纯化过程中去除基因组DNA污染的必要步骤。DNase酶对涡旋和离心非常敏感，因此DNase与缓冲液应通过轻柔颠倒混匀。
<p class="jove_con...

高产奶牛早期胚胎丢失是奶业面临的主要挑战之一1,2。由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的一个理想模型3,4。然而，仍需开展更多研究以深入理解参与牛早期胚胎发育的相关基因。
自1995年首个微阵列技术问世以来的二十年5，更先进的探针制备技术的发展降低了不同微阵列平台内部及平台之间的芯片打印误差和变异性6微阵列技术的改进使其在临床研究中得到广泛应用7 以及最近在早期胚胎质量评估中的应用8.
微阵列技术需要大量起始材料，这是其最初未能进入早期胚胎发育等多个研究领域的主要原因。近年来，RNA扩增方法已得到改进，能够从亚纳克级起始RNA材料线性扩增出微克水平的RNA。9市面上有多种商用RNA扩增试剂盒；然而，目前更为主流且技术较为成熟的试剂盒均基于核糖单引物等温扩增（Ribo-Single Primer Isothermal Amplification）技术。10 由T7启动子驱动的11 方法。最常用的反义RNA扩增采用 体外 使用在5'端连接T7启动子的寡核苷酸dT引物进行转录12该技术可在用于芯片杂交的线性扩增后，保持大多数具有代表性的反义转录本13该方法已适用于扩增从牛胚胎中提取的皮克水平的总RNA8.
通用连接系统（ULS）是一种直接将DNA或扩增的RNA通过铂连接的荧光染料（Cyanine 547或Cyanine 647）进行标记的方法，该过程在鸟嘌呤的N7位点形成配位键14。该方法已被应用于胚胎研究中，以生成比通过酶法产生的氨基烯丙基修饰aRNA更稳定且无需额外修饰的扩增aRNA15。在微阵列实验中，已采用通用连接系统进行单荧光染料和双荧光染料标记。一项大规模微阵列比较研究显示，单色和双色阵列平台之间的数据质量具有良好的相关性6。
近年来，T7 启动子驱动的反义 RNA 扩增技术和 ULS 标记方法的发展为生成足量且高质量的标记 aRNA 材料用于微阵列杂交提供了更可靠的实验方案8,16。因此，本研究提供了一套实验流程，以第 7 天的牛胚胎为例，展示从 RNA 提取到数据分析的双色微阵列实验中所涉及的一些关键步骤。

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒（50次）</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS 试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 筛查胶带</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS 荧光标记试剂盒</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>定制基因表达微阵列</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 基因表达洗涤缓冲液 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 基因表达洗涤缓冲液 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM 杂交缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x 片段化缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE 封闭剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>稳定与干燥溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>采用 Agilent SureHyb 技术的垫片载玻片</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>每包20片垫片载玻片，每片可承载4个微阵列</td></tr><tr><td>双色RNA外参试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B 微阵列扫描仪</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>无臭氧箱</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL 文件</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

转录组分析 体内 利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

早期胚胎丢失是导致牛只不育的重要因素。此外，由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的有趣模型。尽管已知遗传因素会影响早期胚胎发育，但鉴定这些因素一直面临严峻挑战。微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本水平进行定量检测和基因表达谱分析。在设计微阵列实验时，一个关键决策是选择单色还是双色方法。双色设计可增加技术重复，降低变异度，提高检测的灵敏度和准确性，并支持环状设计，从而定义共同的参考样本。尽管微阵列是一种强大的生物学工具，但其应用中存在一些潜在缺陷，可能削弱其效能。因此，在本技术论文中，我们展示了一种优化的实验流程，包括RNA提取、扩增、标记、将标记后的扩增RNA杂交至芯片、芯片扫描以及采用双色分析策略进行数据分析。

第7天牛胚胎的总RNA和扩增aRNA的代表性结果如图所示 图3 并在……中进行了总结 表1.
RNA提取后可对其完整性和图谱进行评估。RNA质量评估可通过生物分析仪完成（图3A），仅RIN值高于7.0的样品可用于扩增（表1）。
扩增后应评估扩增RNA的质量和数量。扩增RNA的谱型相似性及适当的片段大小范围是质量控制的主要因素（图3B）。经过两轮扩增后，扩增的RNA片段大小非常相似，范围在200至800 bp之间（图3B），所有片段大小相近的aRNA均被选用于后续的荧光标记。此外，原始总RNA的成功扩增将使aRNA产量至少增加一千倍以...

微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本进行定量检测和基因表达谱分析。因此，本实验方案提供了一种优化的技术流程，采用定制的双色牛微阵列，利用第7天的牛胚胎，以证明使用极少量总RNA的可行性。

早期胚胎丢失是导致牛只不育的重要原因。此外，牛也成为研究人类着床前胚胎发育的有趣模型……

本视频的总体目标是提供一种优化的技术流程，利用七日龄牛胚胎的少量总RNA，结合定制的双色牛基因芯片进行分析。该方法有助于解答有关高产奶牛胚胎丢失的关键问题，以及胚胎着床前发育过程中胚胎质量与基因表达之间的关系。该技术的优势在于，我们能够利用单个胚胎中提取的皮克水平的总RNA来研究基因表达。该方法可揭示影响体内发育的牛着床前胚胎存活的因素，同时有助于改进体外胚胎生产等生殖技术。开始实验前，从基于柱式的微量RNA提取试剂盒中，准备装有速冻牛胚胎的微量离心管。向离心管中加入10 µL裂解缓冲液，将胚胎在42 °C孵育30分钟。然后在800 ×g条件下离心2分钟。用移液器将250 µL平衡缓冲液加入纯化柱的滤膜中，在室温下孵育5分钟。将收集管在16,000 ×g条件下离心1分钟，完成对纯化柱的预处理。向裂解缓冲液与胚胎的混合物中加入 10 µL 70% 乙醇，充分混匀。然后将混合物加载至纯化柱中。先以 100 × g 离心 2 分钟，再以 16,000 × g 离心 30 秒。向柱中加入 100 微升第一种洗涤缓冲液，以 8,000 × g 离心 1 分钟。使用 DNase 试剂盒，将 5 微升储存液与 35 微升缓冲液混合，通过轻轻颠倒封闭的管子进行混匀。然后，将 DNase 混合液加样至纯化柱膜上，在室温下孵育 15 分钟。向柱中加入40 µL第一种洗涤缓冲液，8,000 ×g离心15秒。然后加入100 µL第二种洗涤缓冲液，离心1分钟。再向柱中加入一份第二种洗涤缓冲液，16,000 ×g离心2分钟。将纯化柱转移至另一微量离心管中，并在柱膜上加载11 µL洗脱缓冲液。室温孵育柱子一分钟。在1,000 ×g条件下离心柱子一分钟，然后在16,000 ×g条件下再离心一分钟。检测洗脱RNA的质量和数量，随后将样品储存在负80摄氏度。使用扩增试剂盒扩增100皮克高质量RNA。使用基于荧光的定量方法评估扩增后aRNA的片段大小范围，然后通过分光光度法测定aRNA的浓度。使用标准试剂盒，为荧光标记准备两微克的扩增aRNA。在暗室中设置臭氧箱，并等待臭氧浓度降至0.001 ppm。在光源上覆盖暗室滤光片。然后将样品放入臭氧箱中，各加入2 µL的氰基五染料和标记缓冲液。在避光条件下，向样品中加入无RNase的水，使总体积达到20微升。轻轻混匀样品，然后将离心管放入热循环仪中，在85摄氏度孵育15分钟。将样品在冰上冷却1分钟，随后离心收集样品。使用RNA提取试剂盒纯化标记并扩增的aRNA。采用适当类型的分光光度计测定标记后扩增aRNA的浓度。制备另一份用Cy3染料标记的扩增aRNA样品。将aRNA样本在负80摄氏度下保存最多三天。取825纳克Cy3标记和5-标记的aRNA各一份，加入封闭缓冲液和片段化缓冲液。将混合物在60摄氏度孵育15分钟，然后在冰上冷却1分钟。加入55微升杂交

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

转录组分析]活体生产牛胚胎植入前胚胎采用双色微阵列平台

采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C.

使用微阵列和实时 PCR 确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位...

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

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活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

我们报道了一种信使RNA（mRNA）电穿孔方法，该方法可在鹌鹑胚胎模型系统中快速高效地表达多种蛋白质。该方法可用于对细胞进行荧光标记，并在电穿孔后短时间内通过延时显微镜记录其在体内的运动过程。...

利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。...

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外...

利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

了解使用双色定制牛微阵列平台对第七天牛胚胎进行转录组分析的方法。该技术利用皮克级总RNA实现基因表达定量检测，为研究胚胎质量与植入前存活因素提供重要工具。

转录组分析体内利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎

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