Name: 治疗SCA1小鼠水溶性化合物，以非特异性升压线粒体功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 了解水溶性线粒体激活剂治疗脊髓小脑共济失调1型小鼠的方法，通过行为学实验和神经病理学检测评估琥珀酸对运动协调功能的改善效果，为神经退行性疾病治疗提供新策略。

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我们感谢明尼苏达大学的 Harry Orr 博士慷慨赠送转基因小鼠。我们还要感谢以下斯基德莫尔学院的校友，他们参与了前期实验工作：Monica Villegas、Porter Hall、Mitchell Spring、Nicholas Toker、Jenny Zhang、Chloe Larson 和 Cheyanne Slocum。此外，我们感谢斯基德莫尔学院为这些方法的开发提供资金支持。

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如果按照所述方法进行操作，能够检测并缓解小脑神经退行性疾病小鼠模型中由氧化磷酸化介导的线粒体功能障碍。结合生化与行为学检测方法，可多角度评估线粒体功能障碍对小脑神经退行性疾病病理过程的贡献程度。通过给予琥珀酸处理小鼠以刺激代谢并增强线粒体功能，我们能够观察到小脑行为缺陷和小脑退行性病变的改善。
本文所述方法可用于测试多种水溶性、代谢靶向化合物，以评估其治疗小脑神经退行性疾病的潜力。琥珀酸在水中的溶解度为0.75 mg/mL，因此可通过饮水给药，无需制备添加药物的饲料颗粒。其他水溶性化合物也可轻松替换入本方案中。若使用非水溶性的代谢靶向化合物，本方法可便捷地调整为通过添加药物的饲料颗粒进行给药11，12。在测试新化合物时，必须在开始治疗前通过高效液相色谱分析（HPLC）或其他合适的检测方法，验证药物是否能够进入小脑组织。
选择这一系列病理学评估方法是因为它们在检测小脑神经退行性病变方面具有已报道的有效性。足迹实验...

线粒体是三磷酸腺苷（ATP）的主要生成场所，ATP 是细胞能量代谢所必需的辅酶，其中大部分线粒体 ATP 通过电子传递链介导的氧化磷酸化（OXPHOS）产生。由于大脑具有较高的代谢需求，并依赖氧化磷酸化为神经活动供能，因此极易受到线粒体功能障碍的影响。因此，在衰老过程中会触发线粒体功能障碍 1，并参与多种神经退行性疾病的发病机制2,3,4。因此，线粒体成为治疗神经退行性疾病的重要潜在靶点。
在本实验方案中，我们采用脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）作为研究线粒体功能障碍及开发靶向线粒体治疗策略的神经退行性疾病模型。SCA1由ataxin-1基因产物中的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列异常扩增突变引起，该突变导致小脑浦肯野神经元及其他脑区神经元进行性退化。本研究所用的转基因小鼠品系（称为SCA1小鼠）在浦肯野细胞特异性启动子的调控下表达突变型polyQ ataxin-1转基因，从而可特异性分析SCA1中浦肯野细胞的病理成分5。SCA1小鼠会出现渐进性浦肯野细胞退化，并发展出共济失调步态6。
线粒体复合物功能障碍及线粒体靶向治疗效果可通过一系列分子与行为检测方法进行评估。线粒体复合物功能障碍的检测指标包括 离体 通过呼吸测定法检测小脑组织在电子传递链底物和抑制剂存在下氧消耗的变化 7呼吸测定实验此前已应用于透化组织、线粒体分离物及完整组织。 7,8,9它们能够直接评估线粒体功能，而不同于透射电子显微镜或免疫荧光染色等形态学数据采集方法。使用完整组织而非分离的线粒体，可避免在线粒体分离过程中可能发生的对健康线粒体的偏倚性选择 7当按照所示方案进行调整时，呼吸测定法是检测小脑神经退行性疾病状态下线粒体功能障碍的一种有效方法。
可以使用非特异性的代谢激活剂来推断神经退行性疾病转基因小鼠模型中的线粒体功能障碍，并有助于开发新的治疗方法。槲皮素、辅酶Q10和肌酸均已被证明可在神经退行性疾病患者及动物模型中改善疾病病理 10,11,12,13,14,15,16。本文中，我们提出一种新型代谢激活剂——琥珀酸，用于促进代谢并增强神经退行性疾病中的线粒体功能。为确保该激活剂能够穿过血脑屏障，我们采用高效液相色谱法（HPLC）检测经处理小鼠神经组织中的药物递送情况 17。
为了评估琥珀酸等代谢靶向性水溶性化合物的治疗效果，可采用一系列行为学范式和免疫病理学研究方法。由于小脑神经退行性疾病存在运动协调功能障碍，常使用足迹跑道实验、横梁实验和加速旋转杆实验来检测行为病理学的改善情况6, 18, 19。这些行为学指标可结合小脑细胞结构的免疫病理学评估进行补充，包括测定小脑皮层分子层厚度（定义为浦肯野细胞树突树的长度）以及在特定小脑叶段内浦肯野细胞胞体数量6, 20, 21。本文介绍了多种用于检测和治疗线粒体功能障碍的神经病理学及行为学方法，结合代谢靶向性水溶性化合物的应用。
我们使用 离体 通过分析SCA1转基因小鼠的线粒体呼吸功能来评估其线粒体功能障碍。此外，我们发现水溶性线粒体增强剂琥珀酸可改善疾病症状和病理变化，进一步表明线粒体功能障碍在SCA1疾病进展中起重要作用。

<table><tbody><tr><td>二磷酸腺苷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>钾-乳酸盐山梨酸盐</td><td>生物糖</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;-四甲基-&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-苯二胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ 抗体（抗 ataxin-1）</td><td></td><td></td><td>塞尔瓦迪奥， &lt;i&gt;等&lt;/i&gt; 1995，PMID：7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗兔二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin 抗体（山羊）</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>对照转基因小鼠</td><td>Harry Orr，博士</td><td>A02</td><td>伯赖特, &lt;i&gt;等&lt;/i&gt; 1997，PMID：9217978</td></tr><tr><td>SCA1 小鼠</td><td>Harry Orr，博士</td><td>B05</td><td>伯赖特, &lt;i&gt;等&lt;/i&gt; 1997，PMID：9217978</td></tr><tr><td>野生型小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L 切片机</td><td>ERMA</td><td></td><td>滑动式切片机</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油-明胶载玻片</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 氧电极控制单元</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯纸</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion 转棒仪</td><td>PPP&amp;amp;G</td><td></td><td>联系通讯作者以获取信息</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 高效液相色谱仪</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>细胞计数插件（用于 ImageJ）</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>3P&amp;amp;G Rota-Rod v3.3.3（转棒软件）</td><td>PPP&amp;amp;G</td><td></td><td>联系通讯作者以获取信息</td></tr><tr><td>Phidget21.dll（旋转杆软件所需）</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

使用水溶性化合物非特异性增强线粒体功能治疗 sca1 小鼠

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

线粒体功能障碍在衰老过程及神经退行性疾病中起着重要作用，其中包括多种遗传性脊髓小脑共济失调及其他以小脑进行性退化为特征的运动障碍疾病。本实验方案旨在评估脊髓小脑共济失调1型（SCA1）中的线粒体功能障碍，并通过水溶性化合物琥珀酸靶向调节代谢呼吸，评估其在延缓疾病进展方面的药理学疗效。该方法适用于其他小脑疾病，并可推广应用于多种水溶性治疗手段。
离体（ex vivo）线粒体呼吸分析用于检测和量化与疾病相关的线粒体功能改变。结合遗传学证据（未发表数据）以及脊髓小脑共济失调1型（SCA1）小鼠模型中线粒体功能障碍的蛋白质组学证据，我们通过将水溶性代谢增强剂琥珀酸直接溶解于小鼠饲养笼的饮用水中，评估其治疗效果。可通过高效液相色谱法（HPLC）推断该药物穿越血脑屏障的能力。随后可采用多种行为学范式检测这些化合物的疗效，包括加速转棒实验、平衡木实验和步态足迹分析。小脑的细胞构筑完整性可通过免疫荧光检测方法进行评估，该方法可标记浦肯野细胞的细胞核、树突及胞体。这些方法是评估小脑神经退行性疾病中线粒体功能障碍及水溶性化合物治疗效果的可靠技术。

通过使用琥珀酸对小鼠小脑线粒体进行药理学靶向干预，我们能够在脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）小鼠模型中预防线粒体功能障碍。将琥珀酸脱氢酶的经典电子供体——琥珀酸溶解于SCA1小鼠的笼内饮用水中，持续给药一个月；行为学评估从给药第二周开始，治疗结束后进行神经病理学评估（图1A）。琥珀酸治疗22可改善SCA1小鼠在足印实验、横梁实验和加速转棒实验中的表现。所观察到的行为学改善表明小鼠的运动协调能力和运动学习能力增强（图1B-D）。
行为学表现的改善与小脑组织的保存同时出现图2）。与未经治疗的 SCA1 小鼠相比，琥珀酸处理显著保留了 SCA1 小鼠小脑原裂区域浦肯野细胞的胞体，并增加了分子层厚度（提示浦肯野细胞树突分支延伸）。浦肯...

我们提出了一种生化与行为学实验方案，用于评估靶向线粒体的水溶性化合物在治疗脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）及其他小脑神经退行性疾病中的有效性。

使用水溶性化合物非特异性增强线粒体功能治疗 SCA1 小鼠

线粒体功能障碍在衰老过程及神经退行性疾病（包括多种遗传性脊髓小脑共济失调）中发挥重要作用……

本实验的总体目标是观察并量化水溶性线粒体激活剂对脊髓小脑性共济失调1型小鼠小脑行为及组织的治疗效果。该方法有助于回答脊髓小脑性共济失调研究领域中的关键问题，例如：线粒体功能缺陷是否参与疾病病理过程？疾病进程是否可通过水溶性线粒体激活剂得到抑制？该技术的主要优势在于，琥珀酸是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、价格低廉且水溶性的化合物，可通过饮水方式直接递送至大脑。该技术的意义可能延伸至其他神经退行性疾病的治疗，因为线粒体氧化磷酸化复合物的功能缺陷存在于多种神经退行性疾病中，包括阿尔茨海默病和亨廷顿病。通常，初次接触该方法的研究人员在行为范式的初始设置方面会遇到困难，可能需要进行调整才能获得一致的结果。对该方法进行可视化演示具有重要意义，因为仅通过书面方法描述可能难以准确重现行为步骤，而借助视频记录则易于复制。开始此操作时，将跑道设置为略微向上倾斜，朝向装有垫料和奖励食物的家盒方向。然后在跑道上铺一张白纸。让小鼠在家盒中适应五分钟。接着选取一只实验动物，分别用蓝色和红色无毒水性颜料涂抹其左侧和右侧后足。随后将该动物置于跑道起点，使其自由行走至终点盒。当动物进入终点盒后，关闭闸门，使其在终点盒内停留一分钟，然后再将其放回相应的饲养笼中。然后用30%乙醇清洁跑道和家盒，并为下一次试验更换垫料、奖励食物和跑道纸。同时，在实验结束后收集跑道纸并检查试验结果。成功的足迹试验定义为：受试动物在不转身或不停止的情况下朝向目标箱行走，且留下至少五个连续的足迹。现在根据横杆规格，使用六种不同的横杆安装横杆装置。在横杆的一端设置一个遮暗的起始箱，并放置奖励食物。为了训练受试对象在横杆上行走，先使用3号横杆组装装置。轻轻地将受试动物放置在与起始箱相对的横梁末端，使其沿横梁行走。每只受试动物最多可进行三次、每次两分钟的尝试，以完成一次成功的运行。定义为在两分钟内穿过横梁并进入起始箱。在横梁训练的第四天，安装横梁一的装置，并设置起始箱。将摄像机放置在装置前方，确保能够清晰地录制整个横梁装置。让小鼠在横梁上行走，对每次试验进行录像，并记录每只小鼠在每根横梁上的成功通过次数。在此步骤中，试验开始前先让受试小鼠在其所在通道的蓄水区适应 10 分钟。在适应期期间，准备旋转杆装置，用30%乙醇清洁装置的每个通道。接着，打开旋转杆软件。将起始速度设为4 RPM，加速度时间设为5分钟，最终速度设为40 RPM，以实现从4 RPM到40 RPM在5分钟内的恒定加速。适应期结束后，将各受试对象放入旋转棒上对应的通道中，此时旋转棒以每分钟4转的速度旋转。待所有受试对象均进入各自通道后，开始第一次试验。使用仪器配套软件记录其跌落潜伏期。可使用一个备用计时器作为备份。每次试验结束后，让每位受试者在其对应的位置储水槽中休息10分钟，再进行下一次试验，以防止疲劳。在此步骤中，将滑动式切片机的温度控制箱管路从载物台连接至水槽水龙头。使用温度控制箱将切片机载物台冷却至28摄氏度。然后将切片厚度调节旋钮设为50微米。接着在载物台上滴加一枚硬币大小的OTC包埋剂。在OCT包埋剂冻结之前，使用镊子将半球形组织放置，使其正中矢状切面朝下接触OCT包埋剂层。迅速而轻柔地调整组织方向，使半球的外侧尖端朝向刀片，位置高于切片台。逐层操作，先在组织周围添加额外的OTC，待其完全冻结后再添加下一层。然后在组织上方覆盖一层薄薄的OTC并冷冻。随后，以切片刀上均匀分布的相同重量进行组织切片。使用精细的艺术家画笔收集切片，并将其放入含有1倍磷酸盐缓冲液（XPBS）的适当标记好的孔板中。在连续切片之间，如有必要，将切片厚度重置为50微米。切片后，将孔板中每孔的 PBS 替换为尿素溶液，并将孔板置于冰上。准备就绪后，将孔板转移至预热至沸点的加热块中，使切片在尿素溶液中煮沸，以暴露表位，便于免疫标记。每次煮沸步骤之间，将含有组织切片的玻片置于冰上冷却。煮沸后，用1×PBS溶液洗涤切片三次，每次更换溶液，并振荡孵育10分钟。随后在室温下用驴血清溶液封闭切片，轻度振荡孵育一小时。现在可以对切片进行染色。标记完成后，将切片用封片剂封固于2%明胶包被的载玻片上，以减少光漂白。加盖盖玻片，并在4°C下过夜干燥。随后用指甲油封固盖玻片，并在4°C下保存。使用扫描共聚焦显微镜，在明场光下定位小脑的初级裂。氨基酸测定中最关键的步骤是准确定位初级裂两侧的第5和第6A模块中的小脑组织。分析染色模式和不一致的小叶结构将确保结果的变异性。使用10倍物镜，依次扫描并激发DAPI、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594通道。分别采用405纳米二极管激光器、488纳米氩离子气体激光器和559纳米二极管激光器，并结合DM 488559纳米双色镜分光器。然后分别使用 SDM 490 和 SDM 560 二向色镜以及 BA 575-675 带通滤光片分离并收集发射光。将琥珀酸溶解于 SCA1 小鼠的居家笼具饮用水中，从17周龄开始持续给药四周。SCA1 小鼠从五周龄开始出现共济失调表型。在治疗期间进行行为学评估，具体如下：第17周进行足迹分析实验，第18周进行平衡木实验，第19周进行加速转棒实验。在20周龄时处死小鼠，并采集小脑组织用于氨基酸病理学检测、HPLC检测和呼吸功能检测。以下是足迹实验的代表性数据，显示经溶剂处理的野生型小鼠步态、经溶剂处理的SCA1小鼠步态以及经琥珀酸处理的SCA1小鼠步态。此处的横梁行走分析数据显示，经琥珀酸处理后SCA1小鼠在横梁行走测试中的表现得到改善。琥珀酸处理显著改善了脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）小鼠在加速转棒实验中的表现，表现为跌落潜伏期延长。在实施该操作时，重要的是要记住在多次试验中对每个受试动物 consistently 应用该技术。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如线粒体呼吸功能检测，以回答更多问题，例如：给予琥珀酸后，通过各氧化磷酸化复合物的呼吸功能是否得到改善？观看本视频后，您应能充分理解如何开展行为学与神经病理学检测，以评估小脑功能行为及细胞结构的改善情况。

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