Name: 大鼠少突胶质祖文化的制备和使用双红外荧光扫描Oligodendrogenesis的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 了解大鼠少突胶质祖细胞分离培养与双红外荧光扫描定量技术，用于评估少突胶质细胞生成效率。该方法为脊髓损伤及脱髓鞘疾病研究提供可靠的体外实验手段。

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资助机构：美国国立卫生研究院；资助编号：R37 NS041435。

涉及动物受试者的实验程序已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及约翰斯·霍普金斯医学院的批准。
1. 检测板、储备液和少突胶质前体细胞基础培养基的制备
注意：此处所述的大鼠 OPC 基础（Sato）培养基源自先前已发表的研究12,13。其他培养基配方也可能适用于本实验步骤。
<ol>
	<li>用无菌去离子水将多聚-L-赖氨酸（PLL）重悬至浓度为 10 µg/ml。将 400 μl 稀释后的 PLL 加入黑色侧壁、透明底的 24 孔组织培养板的每个孔中。</li>
	<li>在 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 2 小时，或在 4 °C 冰箱中过夜，以完成组织培养板的包被。</li>
	<li>在接种细胞前至少 20 分钟吸除包被后的孔中 PLL 溶液。将 24 孔板盖子部分打开，置于组织培养超净台中，使残留的 PLL 溶液自然干燥。接种少突胶质前体细胞（OPCs）前需确认各孔已完全干燥。若孔内存在液态 PLL，细胞将无法在塑料表面贴附。</li>
	<li>配制 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）储备液（1,000 倍）：将 100 mg N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）溶解于 20 ml 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制氢化可的松储备液（1,000 倍）：向 1 mg 氢化可的松中加入 1 ml 乙醇，轻轻旋转使其溶解。再加入 19 ml DMEM，混匀后分装，于 -20 °C 保存。已有研究表明，在基础培养基中添加氢化可的松可提高胶质细胞的存活率14。</li>
	<li>配制 d-生物素储备液（5,000 倍）：将 2.5 mg d-生物素溶解于 50 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中。加入 1–2 滴（每滴 5 µl）0.1 N NaOH 以助溶解。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制胰岛素储备液（100 倍）：将 25 mg 胰岛素溶解于 50 ml 组织培养级水中。加入 250 µl 1 N HCl，搅拌至溶液澄清。用 0.22 µm 滤器除菌，4 °C 保存，可稳定使用长达 6 周。</li>
	<li>配制 Sato 储备液（100 倍）：
	<ol>
		<li>配制孕酮储备液（25 µg/µl）：将 2.5 mg 孕酮溶解于 100 µl 乙醇中。</li>
		<li>配制亚硒酸钠储备液（400 ng/µl）：将 4 mg 亚硒酸钠溶解于 100 µl 0.1 N NaOH 中。加入 10 ml DMEM 并混匀。</li>
		<li>向 100 ml DMEM 中加入 1 g 人脱铁转铁蛋白、1 g 牛血清白蛋白和 160 mg 腐胺，搅拌至完全溶解。再加入 25 µl 孕酮储备液和 1,000 µl 亚硒酸钠储备液，混匀。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 OPC 基础培养基：每 100 ml DMEM（含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠），加入 100 µl NAC、100 µl 氢化可的松、20 µl d-生物素、1 ml 胰岛素、1 ml Sato 储备液、100 µl 微量元素 B、2 ml B-27 补充剂（50 倍）和 1 ml 青霉素/链霉素（100 倍）。用 0.22 µm 滤器除菌后，4 °C 保存。</li>
	<li>配制 PDGF-AA 储备液（1,000 倍）：将 250 μg PDGF-AA 溶解于含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 12.5 ml PBS 中，制成 20 μg/ml 溶液。分装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>配制 OPC 增殖培养基：在 OPC 基础培养基中添加 PDGF-AA 至终浓度为 20 ng/ml。</li>
	<li>配制 OPC 分化培养基：在 OPC 基础培养基中添加三碘甲腺原氨酸至终浓度为 45 nM。</li>
	<li>配制柱缓冲液：向 500 ml PBS 中加入 2.5 g BSA 和 2 ml 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），调节 pH 至 7.2。用 0.22 µm 滤器除菌后，4 °C 保存。</li>
</ol>
2. 大鼠脑组织解剖
注意：本方案中使用 P5-P7 大鼠幼鼠。每只大鼠幼鼠的大脑皮层可获得约 1.5-2.0 × 106 个 A2B5 阳性细胞。
<ol>
	<li>使用250 °C加热的玻璃珠灭菌器对所有解剖器械进行灭菌。</li>
	<li>向50 ml锥形管中加入15–20 ml PBS（不含Ca2+和Mg2+）。每3–4只新生大鼠脑皮层使用一个50 ml锥形管即可。将50 ml锥形管置于冰上。在解剖过程中，使用50 ml锥形管盛放切碎的皮层组织。</li>
	<li>向10 cm培养皿中加入冷PBS。该培养皿将用于在光学显微镜下进行解剖操作。</li>
	<li>使用大型手术剪将新生大鼠断头处死，并用70%乙醇喷洒头部。</li>
	<li>取出全脑
	<ol>
		<li>使用小剪刀沿中线及耳后剪开皮肤，并将皮肤瓣向后剥离。从脑干开始至眼睛结束，沿中线剪开颅骨。注意不要剪得过深，以保护下方皮层结构的完整性。</li>
		<li>将小手术剪插入枕骨大孔，在小脑下方做两个横向切口。在两眼之间、嗅球前方再做一额外切口。</li>
		<li>小心地将颅骨两侧向后剥离。取出全脑并置于盛有冷PBS的10 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下，用精细手术镊去除嗅球和小脑。</li>
	<li>将脑组织翻转，使腹面朝上，在光学显微镜下可见。</li>
	<li>使用精细直镊进行钝性分离：将闭合的镊尖插入皮层与下丘脑之间，深度约为脑厚度的2/3。镊子到位后，轻轻张开镊端。另一侧半球重复此操作。</li>
	<li>用镊子轻轻分离皮层与下丘脑及中脑区域。</li>
	<li>握住中脑的后表面，将其向前端方向剥离，从而移除下丘脑、丘脑和中脑，并切断其前方连接。</li>
	<li>用精细弯头解剖镊将海马向外剥离，然后用同一镊子切断其与皮层的连接。</li>
	<li>使用精细弯头解剖镊以向外对角线方向刮除残余的纹状体组织。</li>
	<li>清除皮层腹面残留的血管和脑膜。</li>
	<li>将脑组织翻转，使背面朝上。此时脑膜和血管应清晰可见。使用精细解剖镊从嗅球附着处开始，剥离覆盖在皮层表面的脑膜。</li>
	<li>对总共3–4只新生大鼠重复步骤2.4–2.14。</li>
	<li>将3–4只新生大鼠已解剖的皮层组织放入干燥培养皿中，用已灭菌的剃刀片切割，直至形成约1 mm × 1 mm大小的组织块。用一个50 ml锥形管中的PBS冲洗培养皿以收集组织，然后重新置于冰上。</li>
</ol>
3. 酶解与机械组织解离
注意：此步骤推荐使用基于木瓜蛋白酶的神经组织解离试剂盒。使用神经组织解离试剂盒（P）时，下文所述为适用于少突胶质前体细胞（OPC）分离的特殊操作步骤。
<ol>
	<li>通过将酶P用适当的缓冲液稀释，制备第一种解离酶。每个50 ml锥形管（1个样品）中的内容物将用总共1,950 µl的酶混合液重悬。将样品置于37 °C水浴中孵育10分钟。 
	     1个样品：1,900 µl缓冲液 + 50 µl木瓜蛋白酶</li>
	<li>将所有含有3-4个切碎的新生大鼠大脑皮层的50 ml锥形管在300 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并向每个样品管中加入1,950 µl酶溶液，通过倒置试管并轻轻振荡使沉淀重新分散。</li>
	<li>在37 °C组织培养孵育箱中孵育15分钟，同时持续旋转试管。</li>
	<li>在孵育的最后5分钟内，制备第二种酶混合液A。用适当的缓冲液稀释酶。每50 ml锥形样品管中将加入总共30 µl。 
	     1个样品：20 µl缓冲液 + 10 µl酶</li>
	<li>孵育完成后，向每根试管中加入30 µl第二种酶混合液，并倒置混匀。</li>
	<li>使用连接移液控制器的玻璃巴斯德吸管，通过吹打10-15次或直至组织块明显变小且溶液变浑浊，对组织进行机械解离。将样品放回37 °C组织培养孵育箱中继续孵育15分钟，并持续旋转。</li>
	<li>使用1 ml移液器对每个组织匀浆样品吹打10-15次。</li>
	<li>使用200 µl移液器对每个组织匀浆样品吹打15-20次。</li>
	<li>将所有样品放回37 °C组织培养孵育箱中孵育10分钟，并持续旋转。</li>
	<li>向每个样品中加入10 ml PBS（含Ca2+和Mg2+），并通过置于50 ml管上的40 µm孔径滤膜过滤匀浆液。用额外的1-2 ml PBS冲洗滤膜。</li>
	<li>将所有匀浆样品合并至一个50 ml锥形管中，并进行总细胞计数。</li>
	<li>完成细胞计数后，将匀浆液等量分装至15 ml锥形管中（每样品一管），在300 × g条件下离心10-12分钟。</li>
</ol>
4. 抗A2B5磁珠应用、柱层析纯化及包被
<ol>
	<li>计算柱缓冲液和抗A2B5微珠的用量。每1 × 106个细胞加入7 μl柱缓冲液。每1 × 106个细胞加入2 μl抗A2B5微珠。</li>
	<li>将所有样品混匀，用总共10 ml柱缓冲液重悬细胞，并在300 × g下离心10–12分钟。</li>
	<li>根据步骤4.1的计算结果，用适量柱缓冲液重悬细胞沉淀。如果沉淀体积较大且松散，仅加入约一半体积的柱缓冲液，以维持细胞重悬液中抗体的适当浓度。</li>
	<li>将细胞悬液在4 °C孵育10分钟。</li>
	<li>加入步骤4.1中计算好的抗A2B5微珠，轻轻颠倒混匀数次，在4 °C孵育30–60分钟。每10分钟轻轻颠倒混匀数次。延长孵育时间可能提高细胞得率，但也可能增加非特异性结合。</li>
	<li>加入5倍体积的柱缓冲液。若细胞重悬于1 ml体积中，则加入5 ml柱缓冲液；若细胞重悬于2 ml体积中，则加入10 ml柱缓冲液。</li>
	<li>在300 × g下离心10分钟。</li>
	<li>确定纯化所需的LS柱数量。一个LS柱适用于15–20 × 106个总细胞。</li>
	<li>每使用一个LS柱，用1,000 µl柱缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>通过加入5 ml柱缓冲液预平衡每个LS柱。用50 ml锥形管收集流出液。待柱缓冲液完全通过上层腔室后，向每个柱中加入1,000 µl细胞悬液，依靠重力使细胞流过柱体。 
	注意：若细胞密度过高，柱流速可能变慢。</li>
	<li>细胞悬液完全通过柱体后，立即缓慢向每个柱中加入3 ml柱缓冲液以洗涤未结合的细胞。若洗涤液流速较快（每30–45秒一滴），再用3 ml柱缓冲液额外洗涤两次。</li>
	<li>取下每个柱，置于15 ml锥形管上。加入5 ml柱缓冲液，并使用随柱附带的塑料推杆快速将缓冲液推过柱体。推压可使结合的细胞脱落并从柱中释放。</li>
	<li>通过第二轮LS柱进一步提高纯度。第二轮使用的柱数量为第一轮的三分之一。用5 ml柱缓冲液预平衡各柱，待柱缓冲液完全通过上层腔室。</li>
	<li>由于细胞悬液体积较大，需将1,000 µl细胞悬液均匀加至每个柱上，并待其完全通过上层腔室后，再补充下一批1,000 µl细胞悬液。</li>
	<li>待细胞悬液完全加至第二轮柱后，用3 ml柱缓冲液洗涤2–3次。</li>
	<li>取下每个柱，置于无菌15 ml锥形管上。加入5 ml柱缓冲液，并使用随柱附带的塑料推杆将缓冲液推过柱体。推压可使结合的细胞脱落并从柱中释放。</li>
	<li>将细胞悬液在300 × g下离心12–15分钟。沉淀应呈致密状。</li>
	<li>用5–10 ml预温的少突胶质前体细胞增殖培养基（OPC基础培养基添加PDGF-AA至20 ng/ml）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>接种细胞。用OPC增殖培养基将细胞稀释至60,000个细胞/ml。向每个黑色透明底24孔板的孔中沿孔壁加入500 µl细胞悬液，使每孔含30,000个细胞。通过水平“8”字形摇动培养板混匀细胞。若在48、96或384孔板中进行实验，则每孔分别加入15,000、7,500或1,500个细胞。具体数量可根据不同板的规格进行调整。</li>
	<li>另准备一块培养板用于第0天基线对照培养。当第0天开始诱导分化时，该对照板应按第5.7节所述用4%多聚甲醛固定。</li>
	<li>将细胞在37 °C的OPC增殖培养基中培养3天，期间不更换培养基。</li>
</ol>
5. 少突胶质前体细胞分化诱导及4%多聚甲醛固定
注意：在检测小分子对少突胶质发生的影响时，我们通常将药物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制1,000倍浓度的储存液，随后储存于-80 °C，并直接稀释至SATO培养基中，使DMSO终浓度为0.1%。使用该浓度的DMSO时，我们未观察到少突胶质前体细胞（OPC）的增殖或分化发生改变（数据未显示）。
<ol>
	<li>将 OPC 基础培养基预热至 37 °C，并将药物处理储备液解冻至室温。进行重复实验时，每个处理组在 1.5 ml 离心管中准备约 1.25 ml 培养基；对于三重复样品，使用 2 ml 容量的离心管以预留余量。</li>
	<li>通过将处理储备液直接稀释到 OPC 基础培养基中，制备用于重复孔的处理母液。短暂涡旋或轻轻混匀每种母液，以确保处理成分均匀分布。</li>
	<li>制备 45 nM 三碘甲腺原氨酸（T3）作为阳性对照，并使用相应的溶剂作为空白对照。将 10 mM T3 储备液在 1 ml OPC 基础培养基中按 1:1,000 比例稀释，然后进一步稀释至处理母液中，必要时降低 DMSO 的终浓度。</li>
	<li>逐个处理组吸除培养孔中的培养基，以避免细胞干燥。使用连接在玻璃巴斯德吸管末端的 200 µl 移液枪头，避免刮下孔壁上的黑色物质并混入培养物中。</li>
	<li>使用 1 ml 移液器沿孔壁缓慢加入 500 µl 处理母液。</li>
	<li>将培养物在所需时间范围内孵育，每 2–3 天用新鲜处理培养基完全更换一次培养液。我们通常在分化培养 4 天后观察到 30–40% 的 MBP+ 细胞比例。</li>
	<li>在所需处理期结束后，配制新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）或将冷冻储存的 PFA 解冻至室温。注意：PFA 极其有毒，必须在通风橱中配制。</li>
	<li>吸除培养基，沿孔壁缓慢加入 400 µl PFA 以固定细胞。在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>吸除 PFA，沿孔壁缓慢加入 500 µl 无菌 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）洗涤细胞。共重复洗涤两次，总计洗涤三次。最后一次洗涤液不要吸除。</li>
	<li>用封口膜包裹培养板，于 4 °C 保存以备后续处理，或直接进入下一步操作。培养板可在此条件下保存数周。</li>
</ol>
6. 髓鞘碱性蛋白的免疫细胞化学与定量分析
注意：在24孔板中进行液体操作时，建议操作迅速，以避免细胞干燥。此处推荐使用多通道真空吸液器和多通道移液器。
<ol>
	<li>将培养板恢复至室温，吸去孔内液体，每孔加入 250 μl 含 0.1% Triton X-100 和 5% 正常山羊血清（NGS）的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）。在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>通过将小鼠单克隆抗 MBP 抗体按 1:1,000 稀释、兔多克隆抗肌动蛋白（Actin）抗体按 1:200 稀释于含 5% NGS 的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）中，制备一抗孵育液。或者，在混合胶质细胞培养物中可使用 1:1,000 稀释的兔多克隆抗 Olig2 抗体进行少突胶质细胞特异性归一化。每孔需 250 µl，据此准备足量的一抗溶液。</li>
	<li>将一抗在 4 °C 下孵育过夜，时间为 16–18 小时，并保持轻柔振荡。</li>
	<li>吸去一抗孵育液，用 500 µl 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 D-PBS 在室温下轻轻振荡洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在洗涤过程中，将二抗（抗小鼠 680 和抗兔 800）按 1:500 稀释于含 5% NGS 的 D-PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）中制备二抗孵育液。配制该溶液时应尽量避免暴露于环境光线下。</li>
	<li>吸去最后一次洗涤液，每孔加入 250 µl 二抗孵育液。避光孵育，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>吸去二抗孵育液，用 500 µl 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 D-PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>使用能够检测 700 nm 和 800 nm 荧光发射的成像系统扫描培养板。初始设置建议：聚焦偏移设为 3，MBP 的灵敏度设为 1.5，Actin 设为 5.0，Olig2 设为 3.5。根据需要调整灵敏度，以避免信号过饱和。</li>
	<li>采用基于软件的半自动化方法定量少突胶质生成的程度。
	<ol>
		<li>使用软件将培养板分析模式设为 &#34;24 Well&#34;，并在扫描孔的外周对齐圆形区域。将归一化通道设为 &#34;800&#34;，导出 700 nm（MBP）和 800 nm（Olig2/Actin）通道的总荧光强度和相对荧光强度。</li>
		<li>将 700 nm 处的荧光强度除以 800 nm 处的强度，得到以相对荧光单位表示的归一化 MBP 表达量。计算重复测量值的平均值，并根据分析需要将表达量相对于 Day 0 +PDGF 对照组进行标准化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案介绍了一种快速、可靠的大鼠少突胶质前体细胞（OPCs）分离与定量方法 体外 少突胶质细胞生成对实验因素的响应。通过阳性筛选，可直接获得高产量的有活力且纯度高的少突胶质前体细胞用于实验。该方法将分离、培养和分化步骤简化至一周内完成，固定后的细胞可方便地在4 °C保存数周，且检测灵敏度无任何损失。
基于扫描仪的荧光检测方法的一个主要优势在于，与传统的基于相机的显微镜技术相比，数据采集和分析速度显著加快。尽管显微镜技术已成功应用于高通量筛选以鉴定少突胶质前体细胞（OPC）分化的诱导剂，但其数据采集本质上较慢，因为需要编程设定图像采集序列，耗时数小时的数据收集，分析数百至数千个图像文件，并依赖用户自定义算法来识别单个细胞体以进行归一化或分析18,19。此外，使用基于相机的显微系统无法从培养容器的整个表面获取数据。相反，必须从单个孔内的不同区域获取代表性图像，这可能导致位置偏差和假阳性结果。相比之下，本检测方法可检测给定孔内所有细胞的MBP表达情况，并且可同时扫描多块板。虽然该方法可适用于96孔板或384孔板格式，但在测试处理组较少的情况下...

哺乳动物中枢神经系统（CNS）中高效的神经传导依赖于少突胶质细胞对轴突的髓鞘化。在发育过程中，少突胶质细胞来源于一群少突胶质前体细胞（OPCs），这些前体细胞被认为从发育中的前脑和神经管的室管膜区迁移而来1迁移后，少突胶质前体细胞分化为成熟的、具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞，这些细胞不仅促进神经冲动的高效传导，还为轴突提供营养支持2成年中枢神经系统中存在大量少突胶质前体细胞（OPCs），这些细胞广泛分布于灰质和白质中，约占全部细胞的5-8%3脱髓鞘损伤发生后，少突胶质前体细胞（OPCs）会迁移至损伤部位，增殖并分化，以替代暴露轴突上丢失或受损的髓鞘。然而，在某些疾病或损伤情况下，该过程可能效率低下，甚至完全失败。4尽管慢性脱髓鞘被认为会加重疾病负担，但有效的少突胶质细胞生成和再髓鞘化可能缓解症状5因此，研究少突胶质前体细胞（OPCs）引起了人们的关注 体外 以确定实验因素对少突胶质发生的影响。
通过鉴定各阶段特异性细胞标志物，现已能够深入了解少突胶质细胞分化过程中的不同阶段。自我更新的早期祖细胞以其表达血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）、神经胶质抗原2（NG2）和A2B5为特征。6-8当少突胶质前体细胞（OPCs）启动其分化程序并退出细胞周期时，它们会下调这些标志物的表达，转而开始表达代表前髓鞘少突胶质细胞的蛋白，如环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNPase）和O4。最终，这些细胞进一步分化为更成熟的少突胶质细胞，其特征是表达髓鞘相关蛋白，包括髓鞘相关糖蛋白（MAG）、蛋白脂质蛋白（PLP）和髓鞘碱性蛋白（MBP）。MBP是一种细胞内周膜蛋白，也是髓鞘的主要组成成分。缺乏MBP的小鼠会出现严重表型，中枢神经系统髓鞘形成显著减少，导致震颤、惊厥和早亡。9,10MBP 在髓鞘形成中的这一重要作用使其被广泛用作少突胶质细胞分化的标志物 体外 和 体内11.
可通过多种不同方法实现对MBP的定量。RT-PCR和Western印迹分析可用于在不同处理条件下对MBP水平进行定量。免疫细胞化学是一种常见的定性方法，当采用基于相机的显微镜技术时，也可实现定量分析。尽管这些方法在少突胶质细胞分化研究中可靠且基础，但各自存在局限性，限制了其在药物筛选中的应用。首先，RT-PCR和Western印迹分析所需的原代OPC数量较多，限制了可同时检测的变量数目。虽然免疫细胞化学所需的细胞量显著较少，但如果以定量为目的，则每次实验需投入大量时间。必须采集大量图像并进行定量，才能支持实验分析。这些局限性在需要高通量评估的研究中成为重要的障碍。本文介绍一种方法，结合了免疫细胞化学和Western印迹技术的基本优势，用于髓鞘定量，同时显著减少了所需细胞数量和完成定量分析所需的时间。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;解剖材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 PBS</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>体视解剖显微镜</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;解离材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>解离用管式旋转仪</td></tr><tr><td>神经组织解离试剂盒（P型）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>酶解解离试剂盒</td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 PBS</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;A2B5 柱层析纯化&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A2B5 抗体偶联磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>磁珠结合的 A2B5 抗体</td></tr><tr><td>LS 层析柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>磁性分离柱</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 PBS</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>富马酸氯马斯汀盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>富马酸喹硫平半盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>16 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>脱辅基转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>微量元素 B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带盖 24 孔黑色 Visiplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>组织培养级</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫细胞化学与定量分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 MBP 抗体</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>兔多克隆抗肌动蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 Olig2 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 680RD 抗体</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗兔 800CW 抗体</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 标记山羊抗小鼠抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx 红外成像系统</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

高效的少突胶质细胞生成是包括脊髓损伤、新生儿缺氧以及多发性硬化症和横贯性脊髓炎等脱髓鞘疾病在内的多个研究领域的治疗目标。髓鞘形成不仅有助于中枢神经系统内神经冲动的快速传导，还能为 underlying 轴突提供营养支持。少突胶质前体细胞（OPCs）可被用于研究 体外 以帮助识别可能促进或抑制少突胶质细胞分化的因素。迄今为止，可用于评估该过程的许多方法要么需要大量细胞，从而限制了单次可同时研究的条件数量，要么依赖于耗时费力的定量方法。本文中，我们描述了一种用于分离大量高纯度少突胶质前体细胞（OPCs）的方案，以及一种快速、可靠的方法，可同时测定多种条件下少突胶质细胞生成情况。OPCs 从出生后第5至第7天（P5–P7）的新生大鼠大脑皮层中分离获得，并进行培养 体外 分化前三天。分化四天后，采用双红外荧光扫描分析法评估少突胶质细胞生成，以检测髓鞘蛋白的表达。

通过使用磁性柱分离系统进行阳性细胞筛选，分离出A2B5阳性的少突胶质前体细胞（OPCs）。在分离操作之前，需从出生后5至7天（P5-P7）的大鼠幼崽中取出全脑。当全脑成功从颅骨中分离后，使用精细的手术镊子去除嗅球和小脑（图1A）。为了分离大脑皮层组织，需通过精细解剖切除下丘脑、丘脑和中脑（图1B）。接下来，使用弯头手术镊子去除海马和纹状体（图1C-图1D）。该分离过程可有效去除脑膜细胞和成纤维细胞，但在去除脑膜和血管组织后，酶消化效果更佳（图1E）。最后，将组织切成1 mm × 1 mm大小的组织块，用于后续的组织解离步骤（图1F）。
一次成功的少突胶质前体细胞（OPC）分离应在最终离心步骤后获得致密的细胞沉淀（图2A...

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外 在实验因素作用下的反应。

高效的少突胶质细胞生成是包括脊髓损伤、新生儿缺氧以及脱髓鞘疾病等多个研究领域的治疗目标……

本实验的总体目标是分离并培养大鼠少突胶质细胞前体细胞，并定量分析实验因素对少突胶质细胞生成的影响。高效促进少突胶质细胞生成是多个研究领域中的治疗目标，包括脊髓损伤、新生儿缺氧以及脱髓鞘疾病（如横贯性脊髓炎和多发性硬化）。该技术的主要优势在于，它将大量少突胶质前体细胞（OPC）的分离方案与一种快速、可靠的检测方法相结合，可同时在多种实验条件下评估少突胶质细胞的生成情况。开始此操作前，使用加热的玻璃珠灭菌器对所有解剖器械进行灭菌。然后，向一个50毫升的锥形管中加入15至20毫升PBS。将锥形管置于冰上，并在解剖过程中用于盛放切碎的皮层组织。接下来，向一个10厘米的培养皿中加入冷的PBS，用于在显微镜下进行解剖。处死幼鼠后，用小剪刀沿耳后中线剪开皮肤，并将皮瓣向后剥离。接下来，从脑干到眼睛沿中线切开颅骨。注意不要切得过深，以免破坏下方皮层的结构。随后，将小型手术剪插入枕骨大孔，在小脑下方做两个侧向切口。在嗅球前方的眼睛之间做一个额外的切口。小心地将颅骨的每一半向后剥离。取出整个脑组织，放入盛有冷PBS的10厘米培养皿中。在解剖显微镜下，使用精细的手术镊子去除嗅球和小脑。将脑组织翻转，使腹面朝上可见。然后，使用精细的直镊子进行钝性分离：将闭合的镊尖插入大脑皮层与下丘脑之间，深度约为脑组织厚度的三分之二。将镊子就位后打开，然后对另一侧半球重复此操作。随后，将皮层从下丘脑和中脑区域分离。抓住中脑的后表面，将其向前脑方向剥离，以移除下丘脑、丘脑和中脑。随后，切断前部连接。使用精细弯头解剖镊，取出海马并切断其与皮层的连接。然后，以向外对角方向刮除下方皮层表面残留的纹状体。清除大脑皮层腹面的血管和脑膜。然后将脑组织翻转，使背侧表面朝上。剥离位于嗅球处皮层表面的脑膜。重复上述步骤，共处理三至四只大鼠幼崽。将所有分离出的皮层组织置于一个培养皿中，用灭菌的剃须刀片切割，直至形成约1 mm × 1 mm大小的组织块。然后用 PBS 冲洗培养皿以收集组织，再将其放回冰上。现在，使用连接移液控制器的玻璃巴斯德移液管，通过反复吹打 10 至 15 次或直至组织块变小且溶液变浑浊，对组织进行机械解离。接下来，将样品放回 37 摄氏度的组织培养孵育箱中，持续旋转孵育 15 分钟。随后，向每个样品中加入 10 毫升 PBS，并将匀浆液通过置于 50 毫升离心管上的 40 微米孔径滤器进行过滤。然后，用额外的 1 至 2 毫升 PBS 冲洗滤器。将所有匀浆样品汇集至一个 50 毫升离心管中，并获取总细胞数。完成细胞计数后，将匀浆液等分至15毫升锥形管中，在300 ×g条件下离心10至12分钟。通过向每根LS柱中加入5毫升柱缓冲液进行预处理，并用15毫升锥形管收集流穿液。当柱缓冲液完全流过上层室后，向每个柱中加入1000 µL细胞悬液，依靠重力使细胞自然流过。随后，取下每个柱并将其放入15 mL锥形管中。加入5 mL柱缓冲液，并快速推动活塞使缓冲液穿过柱子，以冲下结合的细胞并将其从柱中释放出来。接种细胞时，用 OPC 增殖培养基将细胞稀释至每毫升 60,000 个细胞。将 500 微升细胞悬液沿 24 孔板每个黑色、透明底的孔壁缓慢加入。通过水平摇动培养板，以“8”字形动作混匀细胞。在此步骤中，将一个200微升移液器吸头套在玻璃巴斯德移液管上，以确保在吸取过程中不会损伤孔板。然后，每次吸取一个处理组的培养孔中的培养基，以避免细胞干燥。接着，使用1毫升移液器沿孔壁缓慢加入500微升处理主混合液。培养细胞，并每两到三天用新鲜处理培养基进行完全换液。在所需处理期结束时，吸除培养基。沿孔壁缓慢加入400微升PFA以固定细胞。在室温下孵育培养板20分钟。20分钟后，吸除PFA，并缓慢加入500 µL无菌D-PBS以洗涤细胞。重复洗涤两次，最后一次洗涤液不要吸除。现在将培养板恢复至室温，吸去孔内液体，每孔加入250 µL含5% NGS和0.1% Triton X-100的D-PBS。在室温下轻轻振荡孵育1小时。通过在含5% NGS的D-PBS中稀释小鼠单克隆抗MBP抗体和兔多克隆抗Olig2抗体，配制一抗孵育液。然后，在4°C下孵育一抗，轻轻振荡孵育16至18小时。在洗涤板的同时，用含5% NGS的D-PBS稀释抗小鼠680和抗兔800二抗，配制二抗孵育液。接着，吸去最后一次洗涤液，每孔加入250 µL二抗孵育液。将培养板避光，室温下轻轻振荡孵育一小时。随后，使用能够检测700纳米和800纳米荧光发射的成像系统扫描培养板。初始设置时，焦平面偏移设为三，MBP的灵敏度设为一点五，肌动蛋白设为五点零，olig2设为三点五。根据需要调整灵敏度值，以避免信号过曝。在此示意图中，DIFS 检测始于将新分离的 A2B5 阳性大鼠 OPCs 接种于 PLL 编码的培养容器中。这些细胞在含有 20 纳克/毫升 PDGFAA 的培养基中增殖三天，随后在第零天更换为不含 PDGF 的新鲜培养基，并加入实验处理因素。在第二天完全更换培养基，并在第四天使用4%多聚甲醛固定细胞。此处对第0天和第4天的代表性培养物进行了寡突胶质细胞转录因子2（olig2）和髓鞘碱性蛋白（MBP）的免疫细胞化学染色，DAPI作为细胞核复染。这些培养物在第0天和第4天均呈现少突胶质细胞谱系广谱标记物Olig2的组成型染色，而成熟少突胶质细胞标记物MBP的染色则仅在第4天明显可见。观看本视频后，您应能够充分掌握如何纯化、培养并诱导A2B5阳性大鼠OPC分化，以定量评估实验因素对少突胶质细胞生成的影响。鉴定促进少突胶质细胞生成的因子对于研究多发性硬化等脱髓鞘疾病具有重要意义。一旦掌握本文所述技术，将有助于识别这些因子，并最终开发出更有效的治疗方法。

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

大鼠少突胶质祖文化的制备和使用双红外荧光扫描Oligodendrogenesis的量化

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。...

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

原代人胎儿脑来源的多能性前体细胞增殖 体外...

人胎儿脑来源的前体细胞衍生少突胶质细胞培养体系

本视频演示了从大鼠视网膜中分离视网膜神经节细胞（RGNs）并将其与嗅鞘施万细胞（OEG）共培养的实验步骤。该方法可用于研究神经损伤后OEG细胞的神经再生潜力。...

视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养

该视频展示了一种将少突胶质前体细胞（OPCs）分化为少突胶质细胞，并在与背根神经节（DRG）神经元共培养体系中诱导髓鞘形成的实验方案。OPCs通过编码调控髓鞘形成的信号蛋白的慢病毒载体进行转导。转导后的OPCs与DRG神经元共培养，以评估其向少突胶质细胞的分化情况以及信号蛋白诱导的髓鞘形成能力。...

少突胶质前体细胞体外转导诱导髓鞘化检测方法

来源： Schott, J. T., et al．大鼠少突胶质前体细胞培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质细胞生成．J. Vis. Exp. (2016)。...

双荧光成像法鉴定分化的少突胶质细胞

来源： Portela-Lomba, M., et. al. 轴突切断的大鼠视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型。J. Vis. Exp. (2020)。本视频展示了与永生化人嗅鞘胶质细胞共培养的轴突切断大鼠视网膜神经节细胞（RGNs）中轴突再生的成像与定量分析。RGNs...

轴切大鼠视网膜神经节细胞中轴突再生的成像与定量分析

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

本文展示了一种高效纯化少突胶质细胞并制备少突胶质细胞条件培养基的方法，该培养基可用于共培养实验。...

少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。...

从活体大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞的“脑乳法”

了解大鼠少突胶质祖细胞分离培养与双红外荧光扫描定量技术，用于评估少突胶质细胞生成效率。该方法为脊髓损伤及脱髓鞘疾病研究提供可靠的体外实验手段。

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

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