大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

本实验的总体目标是分离并培养大鼠少突胶质细胞前体细胞，并定量分析实验因素对少突胶质细胞生成的影响。高效促进少突胶质细胞生成是多个研究领域中的治疗目标，包括脊髓损伤、新生儿缺氧以及脱髓鞘疾病（如横贯性脊髓炎和多发性硬化）。该技术的主要优势在于，它将大量少突胶质前体细胞（OPC）的分离方案与一种快速、可靠的检测方法相结合，可同时在多种实验条件下测定少突胶质细胞的生成情况。

开始此操作前，使用加热的玻璃珠灭菌器对所有解剖器械进行灭菌。然后，向一个50毫升的锥形管中加入15至20毫升的PBS。将锥形管置于冰上，并在解剖过程中用于盛放切碎的皮层组织。

接下来，向一个10厘米的培养皿中加入冷的PBS，用于在光学显微镜下进行解剖。处死幼鼠后，使用小剪刀沿耳后中线剪开皮肤，并将皮瓣向后剥离。

接下来，从脑干到眼睛沿中线切开颅骨。注意不要切得过深，以免破坏下方皮层的结构。随后，将小型手术剪插入枕骨大孔，在小脑下方做两个侧向切口。

在嗅球前方、两眼之间做额外切口。小心地将颅骨的每一半向后剥离。取出整个脑组织，放入盛有冷PBS的10厘米培养皿中。

在解剖显微镜下，使用精细的手术镊子去除嗅球和小脑。将脑组织翻转，使腹面朝上可见。然后，使用精细的直镊子进行钝性分离：将闭合的镊尖插入大脑皮层与下丘脑之间，深度约为脑组织厚度的三分之二。

将镊子放置到位后打开，然后对另一侧半球重复此操作。随后，将大脑皮层从下丘脑和中脑区域分离。通过握住中脑的后表面，并将其向脑的前部剥离，从而移除下丘脑、丘脑和中脑。

随后，切断前部连接。使用精细弯头解剖镊，取出海马并切断其与皮层的连接。然后，以向外对角线方向刮除深层皮层上的剩余纹状体组织。

清除大脑皮层腹面的血管和脑膜。接着将脑组织翻转，使背侧表面朝上可见。剥离位于嗅球处皮层表面的脑膜。

重复上述步骤，共处理三至四只大鼠幼崽。将所有分离出的皮层组织置于一个培养皿中，用灭菌的剃须刀片将其切碎，直至形成约一毫米见方的组织块。

然后用 PBS 冲洗培养皿以收集组织，再将其放回冰上。现在，使用连接至移液控制器的玻璃巴斯德移液管，通过反复吹打十到十五次，或直至组织块明显缩小且溶液变浑浊，对组织进行机械解离。接下来，将样品放回 37°C 的组织培养孵育箱中，持续旋转孵育 15 分钟。

随后，向每个样品中加入 10 毫升 PBS，并将匀浆液通过置于 50 毫升离心管上的 40 微米孔径滤膜进行过滤。然后，用额外的 1 至 2 毫升 PBS 冲洗滤膜。将所有匀浆样品汇集至一个 50 毫升的锥形离心管中，并获取总细胞数。

完成细胞计数后，将匀浆液等分至15毫升锥形管中，在300 ×g条件下离心10至12分钟。通过向每根LS柱中加入5毫升柱缓冲液进行预处理，并用15毫升锥形管收集流穿液。

当柱缓冲液完全流经上层腔室后，向每根柱中加入1000微升细胞悬液，依靠重力使细胞自然流下。接着，取下每根柱并将其放入15毫升锥形管中。加入5毫升柱缓冲液，并快速推动缓冲液通过柱体，以洗脱结合的细胞并将其从柱中释放出来。

接种细胞时，用OPC增殖培养基将细胞稀释至每毫升60,000个细胞。用移液器将500微升细胞悬液沿24孔板每个黑色、透明底孔的孔壁缓慢加入。通过水平摇动培养板并呈“8”字形运动，使细胞混匀。

在此步骤中，将一个200微升移液器吸头套在玻璃巴斯德移液管上，以确保在吸取过程中不会损伤孔板。然后，每次处理一个给药组，从培养孔中吸取培养基，以避免细胞干燥。接着，使用1毫升移液器沿孔壁缓慢加入500微升的处理主混合液。

将培养物孵育，并每隔两到三天用新鲜的处理培养基进行完全换液。在所需的处理期结束时，吸除培养基。沿孔壁缓慢加入 400 微升 PFA 以固定细胞。

在室温下孵育平板20分钟。20分钟后，吸除PFA，并缓慢加入500 µL无菌D-PBS以洗涤细胞。重复洗涤两次，最后一次洗涤液不要吸除。

现在，将培养板恢复至室温，吸去孔内液体，每孔加入250微升含5% NGS和0.1% Triton X-100的D-PBS。在室温下轻轻振荡孵育培养板1小时。通过将小鼠单克隆抗MBP抗体和兔多克隆抗Olig2抗体稀释于含5% NGS的D-PBS中，配制一抗孵育液。

然后，在4°C下孵育一抗，轻轻振荡孵育过夜，时间为16至18小时。在洗涤平板的同时，用含有5% NGS的D-PBS稀释anti mouse 680和anti rabbit 800抗体，配制二抗孵育液。接着，吸去最后一次洗涤液，每孔加入250 µL二抗孵育液。

将培养板避光，室温下轻轻振荡孵育一小时。随后，使用能够检测700纳米和800纳米荧光发射的成像系统扫描培养板。初始设置时，焦平面偏移设为三，MBP的灵敏度设为一点五，肌动蛋白设为五点零，olig2设为三点五。

根据需要调整灵敏度值，以避免信号过强。在此示意图中，DIFS 检测从新分离的 A2B5 阳性大鼠 OPC 开始，将其接种于 PLL 编码的培养容器中。这些细胞在含有 20 纳克/毫升 PDGFAA 的培养基中增殖三天，然后在第零天用实验因子处理，更换为不含 PDGF 的新鲜培养基。

在第二天完全更换培养基，在第四天使用4%多聚甲醛固定细胞。此处，在第零天和第四天，对代表性培养物进行Olig2和MBP的免疫细胞化学染色，并使用Dapi作为细胞核复染。

这些细胞在第0天和第4天均表现出少突胶质细胞谱系广谱标记物Olig2的组成型染色，而成熟少突胶质细胞标记物MBP的染色则仅在第4天时明显可见。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化、培养并分化A2B5阳性的大鼠少突胶质前体细胞（OPCs），以定量评估实验因素对少突胶质细胞生成的影响。

鉴定促进少突胶质发生的影响因素对于研究多发性硬化等脱髓鞘疾病具有重要意义。一旦掌握本文所述技术，将有助于识别这些因素，并最终开发出更有效的治疗方法。