Name: 异位自体肾移植的猪模型:有步骤，分步协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学习猪异位自体肾移植手术技术，掌握HTK溶液灌注、血管吻合及输尿管吻合等关键步骤。该模型为器官保存和移植研究提供了可靠的实验方法。

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我们感谢意大利米兰的索林集团（Sorin Group）、瑞典哥德堡的XVIVO Perfusion公司（XVIVO Perfusion Inc.）以及德国美尔松根的贝朗公司（Braun AG）提供的支持。我们非常感谢约翰·戴维与辛妮·伊顿基金会（John David and Signy Eaton Foundation）的支持。

所有动物均得到人道护理，所有研究均按照加拿大动物护理委员会的政策和指南进行。所有操作均在经大学健康网络机构动物护理委员会批准的动物使用方案下进行。
注意：研究方案的示意图见图1。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig1.jpg" /> 
图1. 研究方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 动物
<ol>
	<li>本方案中使用雄性约克夏猪（30 kg）。</li>
</ol>
2. 肾脏移植物获取
<ol>
	<li>术前操作
	<ol>
		<li>将雄性约克夏猪安置于研究机构中至少一周以适应环境。使用第三代头孢菌素（如头孢噻呋）进行为期3天的肌肉注射，以降低感染猪链球菌（Streptococcus suis）和沙门氏菌（Salmonella）的潜在风险。在麻醉诱导前至少禁食6小时，以防误吸。</li>
		<li>通过肌肉注射给予氯胺酮（20 mg/kg）、阿托品（0.04 mg/kg）和咪达唑仑（0.3 mg/kg）以启动猪的麻醉。随后将动物从饲养区转移至手术室（OR）。</li>
		<li>将猪仰卧位放置于手术台上。让猪自主呼吸含5%异氟烷的氧气，流速为2 L/min。使用喉镜暴露声门，并喷洒2%利多卡因局部溶液，以防止插管引起的喉痉挛。使用6.5 mm气管导管插管后，用3–5 ml空气封闭气囊。 
		注：通过二氧化碳波形监测确认气管导管位置正确。</li>
		<li>将异氟烷浓度降低至2.5%。将呼吸机设置为呼吸频率14–16次/分钟，潮气量10–15 ml/kg体重。密切监测猪的生命体征。通过脉搏血氧仪记录心率和血氧饱和度。通过心率下降（低于150次/分钟）、血压下降（收缩压低于100 mmHg）以及无猪体运动（未使用肌松剂）来确认麻醉效果充分。</li>
		<li>在无菌条件下，采用Seldinger技术27将一根9.5 Fr单腔永久性导管插入颈内静脉。简要步骤如下：使用穿刺针穿刺静脉，引入导丝后，撤出穿刺针并置入可撕开型导引鞘，随后撤出导丝并置入血管导管。使用3-0丝线或不可吸收单丝线&#160;将导管固定于皮肤。
		<ol>
			<li>静脉给予甲硝唑500 mg、头孢唑林1 g和泮托拉唑20 mg。术中持续以每小时200 ml乳酸林格液加5%葡萄糖（D5W）及1 ml枸橼酸芬太尼进行静脉输注。在麻醉期间，对眼睛涂抹兽用眼科软膏以防止干燥。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>完成手术区域的无菌消毒和铺巾后，行25 cm长的正中切口。插入拉钩，用布巾覆盖大小肠并将其推向左侧，以充分暴露右侧肾脏。</li>
		<li>使用电凝设备游离输尿管及右侧肾脏周围粘连组织。</li>
		<li>使用电凝设备分离右肾静脉和肾动脉，直至其分别起源于下腔静脉和腹主动脉的根部完全游离。为避免动脉痉挛，可考虑给予30–65 mg罂粟碱。</li>
		<li>完成肾脏完全游离后，使用3-0丝线结扎并远端切断输尿管。准备一盆冰及无菌器官袋。</li>
		<li>首先使用血管夹在靠近腹主动脉处夹闭肾动脉，其次在靠近下腔静脉处夹闭肾静脉。随后切除肾脏移植物，并立即使用肾动脉插管插入肾动脉。用500 ml冰冻的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液冲洗血液。将肾脏置于冰上保存，直至移植使用。</li>
		<li>原位使用结扎线（2-0丝线）闭合残余肾动脉，使用连续缝合（Prolene，6-0）闭合肾静脉。</li>
		<li>检查游离区域有无出血后，使用连续缝合（单丝线，1号）关闭腹壁，使用3-0丝线&#160;或不可吸收单丝线&#160;缝合皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后操作
	<ol>
		<li>使用缝线（3-0丝线）将静脉导管皮下固定，并将其经皮下隧道引至猪背部，以防意外操作。将猪置于俯卧位后，使用3-0丝线将导管牢固缝合于皮肤。</li>
		<li>使猪脱离呼吸机，在拔管后让其在饲养区恢复。静脉输注乳酸林格液以扩容，并给予0.3 mg丁丙诺啡镇痛。在动物恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看护。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肾脏移植物移植
<ol>
	<li>术前操作
	<ol>
		<li>通过静脉注射丙泊酚（1-2 mg/kg 体重）麻醉猪，随后以 50-100 mg/hr 的速率持续输注丙泊酚。按照步骤 2.1.3 和 2.1.4 所述重新进行气管插管，并将异氟烷气体浓度设定为 3-4%。</li>
		<li>静脉给予头孢唑林 1 g 和泮托拉唑 20 mg。术中采用与 2.1.4 中所述相同的麻醉方案。</li>
		<li>完成无菌消毒后，在气管旁做一条 4 cm 的切口。分离组织以暴露颈动脉，用血管钳夹住动脉并绕丝线结扎（2-0）。采用 Seldinger 技术插入塑料导管，用于术中持续监测动脉压。也可采用无创血压测量技术。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>完成无菌消毒后，切开皮肤和筋膜缝线，重新打开腹腔，重新置入手术拉钩以暴露腹腔，并将肠管移至左侧，以便更好地接触肾下血管。</li>
		<li>将保存的肾脏移植物以端侧吻合法移植至肾下腔静脉和腹主动脉。因此，使用组织钳和电凝设备游离髂动脉分叉上方 5-8 cm 的腔静脉和腹主动脉。如可能，避免扰动淋巴管；若无法避免，则使用 5-0 Prolene 缝线结扎闭合。</li>
		<li>完成游离后，检查有无出血，并清除血管上的残留组织。确保能够使用 Satinsky 钳完全夹闭腔静脉和腹主动脉。</li>
		<li>接下来，切除对侧（左侧）肾脏。操作时将肠管移至右侧，游离输尿管、肾脏本身、肾静脉和肾动脉周围的粘连组织。结扎输尿管及血管后切除肾脏，并检查有无出血。</li>
		<li>将肠管重新移至左侧，以暴露肾下腹主动脉和腔静脉。静脉注射肝素（100 IU/kg 体重），并等待至少 2 分钟。</li>
		<li>静脉吻合：
		<ol>
			<li>使用 Satinsky 钳完全夹闭腔静脉，用 11 号刀片做一与肾静脉开口大小匹配的纵行切口。可使用 Pott 剪进一步延长切口。</li>
			<li>将肾脏包裹于含无菌冰的布巾中，取出后置于手术区域。使用两根双头 6-0 Prolene 缝线分别缝合头侧和尾侧角部作为定点缝线。</li>
			<li>对合肾脏，打结固定上角，然后使用 6-0 Prolene 缝线连续缝合，从后壁开始。完成约 2/3 后，使用另一端缝线完成前壁缝合。缝合完成后，依次打结固定头侧和尾侧角部缝线。</li>
			<li>在肾静脉上放置血管夹，然后松开 Satinsky 钳。检查吻合口有无出血。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>动脉吻合：
		<ol>
			<li>再次使用 Satinsky 钳完全夹闭腹主动脉。用 11 号刀片做一与肾动脉开口大小匹配的纵行切口，并使用 4.0 mm 圆形打孔器确保切口整齐。</li>
			<li>使用一根 6-0 Prolene 缝线进行动脉端侧吻合，从受体侧开始缝合。确保每一针均包含动脉内皮，以防发生夹层。同时，开始持续输注去甲肾上腺素（16 mg/250 ml）稀释于 500 ml 林格氏乳酸钠溶液中，滴速为 10 ml/hr，并根据需要调整剂量，维持收缩压高于 100 mmHg。</li>
			<li>在完成动脉吻合前，经动脉内注射维拉帕米，并将罂粟碱局部涂抹于血管外壁，以预防血管痉挛。</li>
			<li>在肾动脉上放置血管夹，然后松开 Satinsky 钳。检查吻合口有无出血。</li>
			<li>将肾脏从布巾中取出并移除冰块。先松开静脉侧血管夹，再松开动脉侧血管夹。再灌注后应立即开始尿液生成。</li>
			<li>使用布巾固定移植物于理想位置，以维持均匀的再灌注。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>输尿管吻合：
		<ol>
			<li>使用 Pott 剪将供体和受体输尿管纵向切开约 0.5 cm。</li>
			<li>使用两根 6.0 聚酯或聚对二氧环己酮（PDS）缝线进行输尿管侧侧吻合。先在两侧各做一个角部定点缝合，然后连续缝合后壁，再缝合前壁。</li>
			<li>检查无出血后，移除布巾，并用部分小肠包裹肾脏以固定其位置。使用两根单股 1 号缝线关闭腹壁。使用 3-0 丝线&#160;或非吸收性单股缝线&#160;缝合皮肤。</li>
			<li>在将猪置于俯卧位之前，持续调整去甲肾上腺素输注速度，维持收缩压高于 100 mmHg。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后操作
	<ol>
		<li>完成上述腹腔关闭后，使用加热垫和循环加热毯保持猪体温。拔除动脉导管，用 6-0 Prolene 缝线缝合动脉穿刺点，并关闭切口。</li>
		<li>将猪转为俯卧位，停止去甲肾上腺素输注，并逐步脱离呼吸机。让猪在其饲养环境中恢复，并密切监测其术后恢复情况。通过已植入的颈静脉导管每小时采集一次血气样本。输注林格氏乳酸钠溶液以补充血容量，并给予 0.3 mg 布托啡诺用于镇痛。</li>
		<li>拔管后需密切监测猪直至其能够自主饮水。在动物恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看护。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合群饲养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 术后随访
<ol>
	<li>每8小时静脉注射0.3 mg布托啡诺&#160;术后至少2天，或根据需要延长。&#160;手术期间常规给予单次预防性抗生素剂量。若出现感染迹象，静脉注射头孢唑林1 g，每日两次，同时静脉注射甲硝唑，每日一次，直至临床症状改善。在猪能够饮用足够水量之前，持续给予乳酸林格液。可使用1,000 IU肝素封管以预防导管内凝血。</li>
	<li>通过颈静脉导管采集静脉血样和尿样，以评估猪的临床状况和肾功能。</li>
	<li>安乐死时，通过静脉注射丙泊酚（5–10 ml）诱导猪的麻醉，并以5%异氟烷维持麻醉。按上述方法对猪进行气管插管。在再次剖腹探查并采集肾组织样本后，通过静脉注射40 mval氯化钾诱导心脏停搏。</li>
</ol>

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<li>Gallinat, A., Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+reconditioning+of+porcine+kidney+grafts+by+short-term+preimplantation+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hypothermic reconditioning of porcine kidney grafts by short-term preimplantation machine perfusion.</a> Transplantation. 93 (8), 787-793 (2012).</li>
<li>Snoeijs, M. G., Matthijsen, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+transplantation+of+ischemically+injured+kidneys+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Autologous transplantation of ischemically injured kidneys in pigs.</a> J Surg Res. 171 (2), 844-850 (2011).</li>
<li>Golriz, M., Fonouni, H., Nickkholgh, A., Hafezi, M., Garoussi, C., Mehrabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pig+kidney+transplantation%3A+an+up-to-date+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Pig kidney transplantation: an up-to-date guideline.</a> Eur Surg Res. 49 (3-4), 121-129 (2012).</li>
<li>Hosgood, S. A., Bagul, A., Yang, B., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+effects+of+warm+and+cold+ischemic+injury+in+an+experimental+model+of+nonheartbeating+donor+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The relative effects of warm and cold ischemic injury in an experimental model of nonheartbeating donor kidneys.</a> Transplantation. 85 (1), 88-92 (2008).</li>
<li>Hoyer, D. P., Gallinat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+concentration+during+hypothermic+machine+perfusion+on+porcine+kidneys+from+donation+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen concentration during hypothermic machine perfusion on porcine kidneys from donation after circulatory death.</a> Transplantation. 98 (9), 944-950 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于在手术操作、生理学、生物化学和免疫学方面具有相似性，猪肾移植模型为推动人类器官移植领域的发展提供了独特的机会14。
根据实验研究目的的不同，肾自体移植模型相较于同种异体移植模型具有多项优势。尽管已有多个研究团队报道了同种异体移植后良好的肾移植物功能28，但在猪模型中实施免疫抑制治疗具有挑战性，尤其是在肾移植中。术前可通过血液样本分析以确保猪白细胞抗原（SLA）相容性，但该方法成本高昂且不具实用性14。术后通常建议口服或静脉给予他克莫司和环孢素等免疫抑制剂（钙调磷酸酶抑制剂，CNI）28。然而，口服给药并不现实，因为猪通常拒绝吞服药物。此外，肠道梗阻可能影响免疫抑制药物的充分吸收，从而难以维持治疗所需的血药浓度。在活动性动物中持续静脉输注CNI在技术上要求较高。静脉推注给药则会导致血药峰值过高，引发毒性反应。因此，在评估新型器官保存技术的研究中，肾自体移植模型具有明显优势。如上文展示的同种异体移植肾移植物代表性结果所示，肌酐和尿素氮（BUN）的峰值延迟且升高，提示发生排斥反应，这一结果经组织学评估得以证实。
猪自体移植模型此前已被用于研究新的器官保存技术14,18,29。然而，在心跳状态下，自体移植猪术后血清肌酐和尿素氮（BUN）的报道值因实验体系不同而存在显著差异22,30。本文所介绍的心跳供体方案导致术后血清肌酐峰值较低，为2.8 mg/dl（± 0.7），BUN峰值为25.3 mg/dl（± 7.4）。这些结果与Hanto等28和Snoeijs等31报道的低峰值水平相当。
为了确保猪自体移植模型中肾移植术后获得成功的结果，我们已确定若干关键的技术因素，可最大限度地降低特定并发症的发生率。使用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液（HTK）可降低血管痉挛的风险，因其钾含量较威斯康星大学溶液（UW）更低。为进一步降低再灌注时发生血管痉挛的风险，可在肾动脉内注射维拉帕米，并在器官获取期间及再灌注后局部应用罂粟碱。此外，持续输注去甲肾上腺素并滴定剂量以维持收缩压高于100 mmHg，有助于实现均匀的再灌注。建议至少在猪处于俯卧位之前维持该血压水平。此外，移植肾的放置位置至关重要，以防止新吻合的血管发生扭曲。因此，在缝合移植肾的吻合口之前，切除对侧左肾有助于避免过度的机械操作。完成输尿管吻合后，将小肠包裹于移植肾周围，可在关闭腹壁后固定其位置。尽管因肠道扭曲所致的肠梗阻等并发症较为罕见，但仍可能引发严重后果，包括麻痹性肠梗阻、肠穿孔甚至死亡。总体而言，精确的外科技术、细致的麻醉管理以及术后密切监测，是确保良好临床结果和移植肾功能的重要因素。
动脉和静脉吻合可采用不同的技术进行。移植物的原位放置允许肾动脉和肾静脉进行端对端吻合。在异位移植的情况下，移植物可置于对侧肾窝以进行端对端吻合，或直接吻合至髂血管或远端主动脉。在此模型中，优先选择将移植物以端侧方式直接吻合至主动脉和下腔静脉的异位移植方式，因其可降低血栓形成和血管痉挛的风险32。当存在静脉早期分叉等解剖变异时，可能需要分别缝合两条独立的静脉吻合口。如果动脉或静脉相对较短，可将移植物旋转180°以延长血管长度。输尿管侧对侧吻合可在不引起狭窄或尿漏等并发症的情况下获得良好的实验效果。
总体而言，与其他动物模型相比，猪的肾移植模型具有多种优势。如上所述，猪与人类在某些方面存在相似性，这使得新技术能够相对较快地转化为临床应用。该移植技术在操作上比啮齿类动物模型更为简便。此外，通过放置静脉导管，可方便地采集外周血样并进行后续分析。尿液的收集有助于进一步评估肾脏损伤及功能状态。为采集尿液样本，可将经皮导管插入膀胱。为避免猪自行干扰导管，导管远端应经皮下隧道引至动物背部。另一种尿液采集方法是使用代谢笼，可实现长时间尿液收集，用于估算肌酐清除率及尿液中其他生物标志物的浓度。可进行超声检查、CT扫描和MRI成像。通过在器官获取前施加热缺血处理，可模拟循环死亡后捐献（donation after circulatory death）的实验方案。此外，若对猪进行去势以限制其攻击性行为，则相对更容易操作和管理。
缺点包括动物购买、饲养、手术及其他医疗设备和人力的高成本。这些因素导致在每个研究组中纳入大量动物不可行。此外，与啮齿类动物模型相比，文献中可供参考的猪的正常生物学数据较为有限。作为评估新开发技术（如新型保存方法）的替代方案，其他研究团队已描述了常温灌注 离体 将再灌注作为肾移植的替代方案 33,34该技术操作更简便且成本较低。然而，标准化的肾脏移植模型更接近临床实践，可实现更长的随访时间，因此能够对移植物进行更为真实的评估。
总之，异位肾自体移植的猪模型为研究改善肾移植效果的创新方法提供了一个具有重要临床意义的实验场景。特别是，本方案包含若干关键技术细节，有助于成功建立肾自体移植模型，并促进新发现快速转化为临床试验。

对于终末期肾病患者而言，肾移植是首选治疗方法，因为与透析相比，肾移植具有更低的发病率和死亡率1-3。尽管肾移植后患者的预后已取得显著改善，但移植物短缺仍是全球面临的严峻挑战。等待肾移植的患者人数远远超过可供移植的器官数量4-6。为了增加可用于移植的肾脏数量并缩短患者的等待时间，需要拓展更多的肾脏移植物来源。
通常，临床使用脑死亡后捐献（DBD）的标准化标准供体（SCD）和扩展标准供体（ECD）肾脏移植物，以及来自活体捐献者的肾脏（LDKT）。自20世纪90年代以来，为扩大供体来源，越来越多的肾脏移植物来自心脏死亡后捐献（DCD）的情况7,8。然而，DCD和ECD肾脏移植物在移植后的效果尚可，但相对较低，其预后受多种因素影响，如供体年龄、热缺血和冷缺血时间以及所采用的保存技术9-11。因此，仍需进一步研究以改善接受边缘性肾脏移植物患者的预后，并进一步扩大供体池。
猪的肾移植模型已得到充分建立，为研究改善边缘性肾移植物预后的创新方法提供了一个具有重要临床意义的场景。与单叶结构的啮齿类和犬类肾脏不同，猪和人类的肾脏均为多叶结构，在解剖学上尤其在动脉、静脉以及尿液收集系统方面具有高度相似性12,13。此外，猪和人类肾脏在缺血再灌注损伤（IRI）的病理生理学、生物化学及免疫学参数方面也表现出相似性14。因此，猪肾移植模型非常适合用于研究边缘性肾移植物的新型器官保存方法15-17，模拟人类缺血再灌注损伤18，探索免疫通路与同种移植物耐受机制19，开展外科手术培训20-22，测试新的药理学治疗方案23，应用新型医疗器械，以及研究异种移植中的新免疫机制24-26。
猪和人类的肾脏移植环境并不完全类似。本文重点介绍有助于成功建立肾脏自体移植模型的重要技术细节。该方案及视频中描述并演示了针对物种特点优化的术前和术后饲养管理、麻醉给药及严密监测，以及相匹配的外科手术技术。切除对侧原生肾脏可为评估移植肾功能提供条件。静脉和尿路导管的置入，以及代谢笼的使用，有助于进行更深入的功能评估。对于旨在研究移植物替代保存方法及缺血-再灌注损伤（IRI）机制的研究而言，自体移植模型优于同种异体移植模型，因其避免了排斥反应及相关免疫抑制药物使用所带来的并发症和混杂偏倚。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;麻醉设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉机，Optimax</td><td>Moduflex 麻醉设备</td><td>SN5180</td><td></td></tr><tr><td>输液泵 3,000</td><td>SIMS Graseby 有限公司</td><td>SN300050447</td><td></td></tr><tr><td>输液泵管路</td><td>Smith Medical ASD 公司</td><td>21-0442-25</td><td></td></tr><tr><td>静脉内永久性导管（9.5 Fr）</td><td>Cook Medical 公司</td><td>G01865</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸汽 19.1</td><td>Draeger Medical Canada Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mallinckrodt，气管插管，6.5 mm</td><td>Covidien Canada</td><td>86449</td><td></td></tr><tr><td>温度治疗垫</td><td>Gaymar Industries Inc</td><td>TP26E</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机，AV 800</td><td>DRE 医疗设备</td><td>40800AVV</td><td></td></tr><tr><td>温暖触感，患者加温系统</td><td>Nellcor/ Covidien 加拿大</td><td>5015300A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;外科手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腹部拉钩</td><td>Medite GmbH</td><td>07-0001-00</td><td></td></tr><tr><td>主动脉/静脉打孔器 4.0 mm，圆形</td><td>Scanlan International Inc.</td><td>1001-602</td><td></td></tr><tr><td>德贝基无创外周血管钳</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB463R</td><td></td></tr><tr><td>德贝基-贝克无创腔静脉钳</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB519R</td><td></td></tr><tr><td>德贝基无创微型动脉夹，直型</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB422R</td><td></td></tr><tr><td>德贝基无创微型动脉夹，弯型</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB423R</td><td></td></tr><tr><td>德贝基无创主动脉缩窄钳，斜角</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB453R</td><td></td></tr><tr><td>解剖刀片 #11</td><td>Feather Safety Razor Co.</td><td>089165B</td><td></td></tr><tr><td>连接器（1/4&quot;）与雄性鲁尔锁</td><td>索林集团有限公司</td><td>AB1452</td><td></td></tr><tr><td>肝素冲洗管路套装（冲洗管）</td><td>CardioMed Supplies Inc</td><td>17175</td><td></td></tr><tr><td>Maxon, 1</td><td>Covidien Canada</td><td>606173</td><td></td></tr><tr><td>Med-Rx 吸引连接管</td><td>Benlan Inc.</td><td>70-8120</td><td></td></tr><tr><td>器官袋</td><td>CardioMed Supplies Inc</td><td>2990</td><td></td></tr><tr><td>Potts &amp;ndash; 德马泰尔，剪刀</td><td>Aesculap 公司</td><td>BC648R</td><td></td></tr><tr><td>肾动脉插管，1.6&quot;</td><td>索灵集团有限公司</td><td>VC-11000</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk，2-0</td><td>Covidien Canada</td><td>S405</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk，3-0</td><td>Covidien Canada</td><td>S404</td><td></td></tr><tr><td>Satinsky，肝上腔静脉钳</td><td>Aesculap 公司</td><td>FB605R</td><td></td></tr><tr><td>吸液管尖</td><td>泰科医疗集团有限公司</td><td>8888501023</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II，6-0</td><td>Covidien Canada</td><td>VP733X</td><td></td></tr><tr><td>Valleylab，电刀笔</td><td>Covidien Canada</td><td>E2515H</td><td></td></tr><tr><td>瓦力宝，Force Tx</td><td>Valleylab 公司</td><td>216151480</td><td></td></tr><tr><td>瓦里安实验室，患者回路电极</td><td>Covidien Canada</td><td>E7507</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;药物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸阿托品 15 mg/30 ml</td><td>Rafter 8 产品</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/ml</td><td>RB Pharmaceuticals LDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>头孢噻呋 3 mg/ml</td><td>辉瑞加拿大公司</td><td>11103</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林 1 g</td><td>加拿大制药合作伙伴公司</td><td>2237138</td><td></td></tr><tr><td>枸橼酸芬太尼 0.25 mg/5 ml</td><td>Sandoz Canada Inc.</td><td>2240434</td><td></td></tr><tr><td>肝素 10,000 iU/10 ml</td><td>Sandoz Canada Inc.</td><td>10750</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）溶液</td><td>Methapharm</td><td>CU001LBG</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 99.9%，250 ml</td><td>加拿大制药合作伙伴公司</td><td>2231929</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮&amp;nbsp; 5,000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>612316</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液&amp;rsquo;5%葡萄糖溶液 1 L</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1064</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液&amp;rsquo;1 L</td><td>百特公司</td><td>JB2324</td><td></td></tr><tr><td>甲硝唑 500 mg/100 ml</td><td>百特公司</td><td>870420</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑 50 mg/10 ml</td><td>加拿大制药合作伙伴公司</td><td>2242905</td><td></td></tr><tr><td>去甲肾上腺素 16 mg/250 ml 葡萄糖 5%</td><td>百特公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>泮托拉唑 40 mg</td><td>Sandoz Canada Inc.</td><td>2306727</td><td></td></tr><tr><td>罂粟碱 65 mg/2 ml</td><td>Sandoz Canada Inc.</td><td>9881</td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚 1,000 mg/100 ml</td><td>Pharmascience Inc.</td><td>2244379</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水，1 L</td><td>百特公司</td><td>60208</td><td></td></tr><tr><td>Solu-Medrol 500 mg</td><td>辉瑞加拿大公司</td><td>2367963</td><td></td></tr><tr><td>维拉帕米</td><td>Sandoz Canada Inc.</td><td>2166739</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine 气管内用 10 mg/50 ml</td><td>阿斯利康</td><td>2003767</td><td></td></tr></tbody></table>

猪模型中的异位自体肾移植：逐步操作方案

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

对于终末期肾病患者而言，肾移植是首选治疗方法。与透析相比，肾移植可提供更长的预期寿命和更高的生活质量。尽管近几十年来肾移植受者的预后已取得显著改善，但可供移植器官的日益短缺已成为全球范围内的严重问题。为了扩大供体来源，目前临床已接受使用来自扩大标准供体（ECD）或循环死亡后捐献（DCD）的边缘性肾移植物进行移植。为进一步改善这些边缘性移植物的术后效果，研究应聚焦于新的治疗策略，如替代性器官保存技术、免疫调节、基因转导以及干细胞应用。
在动物模型中进行实验研究是新技术应用于临床实践前的最后一步。猪肾移植是研究人类移植的良好模型，可用于探索新的方法。猪模型的主要优势在于其解剖结构和生理特征与人体高度相似，有助于将新发现快速转化为临床试验。本文提供了一种自体移植模型的外科手术分步操作方案，并强调了确保实验成功的关键因素。充分的术前和术后饲养管理、细致的麻醉监护以及稳定的手术技术可带来良好的术后结果。切除对侧原生肾脏可为评估移植后移植物功能提供条件。通过放置静脉和尿路导管，结合代谢笼的使用，可进一步实现更详细的评估。对于需要长期随访或研究不同移植物保存技术的实验，自体移植模型优于同种异体移植模型，因其避免了排斥反应和免疫抑制药物带来的混杂偏倚。

以下展示了肾自体移植实验的结果（n = 4）。在初次获取移植物后，猪只在饲养区域恢复。与此同时，肾脏移植物在冰上保存，平均时间为7小时35分钟（±18分钟）。在重新诱导麻醉并再次进行剖腹手术后，切除对侧肾脏，并按照所述方法将冷保存的移植物异位移植。脱离呼吸机后，猪只从手术中恢复，并随访10天（见图1）。术后第1至第4天每日采集血样，第6至第10天每两天采集一次，用于进行血气分析；为评估肾功能，检测血清肌酐和血液尿素氮（BUN）水平。作为对照，本文还展示了一例同种异体移植肾脏的结果。该猪只接受免疫抑制治疗，包括环孢素100 mg口服和皮质醇250 mg静脉注射，每日两次。手术技术与自体移植方案相同，未施加任何热缺血时间。
所有猪在随访期间均处于良好的临床状态。血清肌酐和尿素氮（BUN）水平在术后第1天达到最高值（肌酐 2.8 ± 0.7 mg/dl，BUN 25.3 ± 7 mg/dl），随后逐渐下降，至术后第10天接近初始基线水平（肌酐 1.7 ± 0.4 mg/dl，BUN 10.7 ± 4 mg/dl）。同种异体移植肾在经历初期良好的移植物功能后，其肌酐和BUN水平高于自体移植组，最可能的原因是发生了排斥反应（图2 和 图3）。酸碱平衡（图4）和电解质水平（图5）在未进行干预的情况下保持稳定。组织学检查显示，自体移植肾的肾小管间质结构得以保留（图6），而同种异体移植肾则出现弥漫性间质炎症、小管炎和肾小球炎（图7）。
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig2.jpg" /> 
图2. 血清肌酐值。 术前基线及术后10天的血清肌酐值（均值±标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig3.jpg" /> 
图3. 血清BUN值。手术前基线及术后10天的血清BUN值（均值±标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig4.jpg" /> 
图4. 酸碱稳态。 术前基线及术后10天的酸碱稳态（均值±标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig5.jpg" /> 
图5. 电解质水平。 术前基线及术后10天的电解质水平（均值±标准差）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig6.jpg" /> 
图6. 组织学（H&amp;#38;E染色），100倍放大。 自体移植肾术后10天显示正常的肾小管间质结构。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" src="/files/ftp_upload/53765/53765fig7.jpg" /> 
图7. 组织学（H&amp;#38;E染色），100倍放大。 同种异体移植肾术后10天，可见广泛的间质性炎症、小管炎和肾小球炎，符合排斥反应的特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53765/53765fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

猪的器官移植模型为研究器官保存机制提供了重要平台。本文描述了一种异位猪自体肾移植模型，可用于探索改善边缘性肾移植物移植效果的新方法。

肾移植是终末期肾病患者的首选治疗方法。它能够提供更长的预期寿命和更高的生活质量……

本手术操作的总体目标是在猪模型中可靠地完成异位肾自体移植，以获得良好的肾脏移植物功能。本视频及配套文稿有助于解答在猪模型中如何实施异位肾自体移植的关键问题。本视频的主要优势在于，它展示了所有关键操作步骤，并强调了猪模型与临床模型之间的差异，以确保移植后具备充分的肾脏移植物功能。将猪麻醉并在手术台上安置后，使用喉镜暴露声带。用2%利多卡因溶液喷洒声带，以防止插管引起的痉挛。然后使用6.5毫米的气管导管为猪插管，并用3至5毫升空气封闭气囊。调节蒸发器，并在继续操作前确认已达到深度麻醉。确认麻醉成功后，使用塞尔丁格技术将9.5 French单腔导管插入颈静脉。该技术包括穿刺静脉、引入导丝、用可剥离导入器替换针头，再将导丝替换为导管。接下来，使用3-0丝线缝合固定导管。在整个手术过程中，利用该导管注入抗生素和镇痛药的混合溶液。同时，将兽用眼膏涂抹于猪的眼睛上，以防止角膜干燥。在对手术区域进行无菌消毒并覆盖后，作一条长25厘米的正中切口，并插入拉钩。用纱布覆盖大肠和小肠，并将其推向左侧，以充分暴露右侧肾脏。现在使用电灼器游离输尿管及右侧肾脏本身周围的粘连组织。接下来，使用电凝设备解剖右侧肾静脉和肾动脉，直至其从下腔静脉和主动脉的起始处完全游离。为避免动脉痉挛，可给予30至65毫克罂粟碱。完成肾脏的解剖后，用3-0丝线结扎输尿管，并在远端切断输尿管。此时，准备一 bowl 冰和一个无菌器官袋。为采集肾脏，使用血管钳。首先，在靠近主动脉处夹闭肾动脉。第二步，靠近下腔静脉处夹闭肾静脉。接着切除肾脏移植物并置于冰上。现在，立即使用肾动脉插管插管肾动脉。使用 500 毫升冰冻 HTK 溶液冲洗血液，并将肾脏置于冰上保存直至移植。原位用 2-0 丝线结扎残余肾动脉，用 6-0 连续普理灵缝线关闭肾静脉。处理任何出血后，关闭腹腔和皮肤。接下来，使用3-0丝线将静脉导管皮下固定，并将其穿隧道至猪背部，以防止意外移动。将猪置于俯卧位后，将导管牢固缝合至皮肤。在对猪进行麻醉并对手术部位进行无菌消毒后，于气管旁做一4厘米切口，分离组织以暴露颈动脉。将Overholt止血钳绕过动脉，放置一根2-0丝线缝线。然后采用Seldinger技术插入塑料导管，以在手术过程中持续监测动脉压力。随后，按前述方法重新打开腹腔。现在将保存的肾脏移植物以端侧吻合的方式移植至下腔静脉和腹主动脉。具体操作为：使用镊子和电凝设备，在髂动脉分叉上方游离5至8厘米的下腔静脉和腹主动脉。注意尽量避开淋巴管。根据需要使用5-0 Prolene缝线关闭。检查有无出血，并清除血管上残留的任何组织。目的是暴露足够的血管以放置Satinsky钳。接下来，切除对侧肾脏。首先，将肠管移至右侧。然后，从周围组织中分离输尿管、肾脏本身、肾静脉和肾动脉。然后结扎输尿管和血管。现在切除肾脏并检查有无出血。接着重新放置肠管以暴露肾下主动脉和下腔静脉。注射肝素，等待至少两分钟。取肾移植物，用包裹无菌冰的布包裹。开始进行静脉吻合。使用 Satinsky 钳完全夹闭下腔静脉。然后用 11 号刀片做一个切口，切口大小与肾静脉开口相同。可根据需要使用剪刀扩大切口。使用两根双臂6-0 Prolene缝线分别缝合头侧和尾侧角。现在将猪的肾脏从冰上取出，并放置于手术区域。对移植物进行头侧和尾侧角的缝合。接下来，将近肾端进行近似处理。结扎上角，并使用6-0 Prolene线从后壁开始连续缝合。缝至2/3处时，利用结扎线的另一端完成前壁的缝合。缝合颅侧缝线后，再缝合尾侧角的缝线。现在将止血钳置于肾静脉上，打开Satinsky钳，检查静脉吻合口是否有出血。将Satinsky钳放置于主动脉上。然后做一个与肾动脉开口相匹配的切口，使用11号刀片。接着用4毫米圆形打孔器清理开口。接下来，使用一根6-0 Prolene缝线，从受体侧开始进行吻合。每一针都必须包含动脉内皮，以防止发生夹层。同时，开始以500毫升乳酸林格液稀释10毫升去甲肾上腺素的持续输注。滴定以维持收缩压高于100毫米汞柱。在完成动脉吻合前，可经动脉内给予维拉帕米。吻合完成后，在肾动脉上放置血管夹，打开Satinsky钳并检查有无出血。现在进一步展开肾脏并移除冰屑。先打开静脉动脉夹，随后打开动脉动脉夹。调整肾脏位置，以维持均匀的再灌注。务必局部使用罂粟碱以防止血管痉挛。再灌注后，尿液生成应立即开始。现在进行输尿管吻合术。首先使用剪刀在移植肾输尿管上做长约0.5厘米的纵向切口。对受体输尿管进行同样的操作。然后使用两根6-0 PDS缝线行输尿管端侧吻合。在两侧分别进行角部缝合，然后连续缝合前壁。接着翻转吻合口以暴露后壁，并继续缝合。吻合完成后，检查有无出血。现在用两根单丝缝线缝合腹壁，随后用3-0丝线连续缝合皮肤。通过精确调整去甲肾上腺素的输注速度，持续维持猪的收缩压在100毫米汞柱以上。这是该操作的关键步骤。持续监测收缩压，直至将猪置于俯卧位。共进行了四次肾脏自体移植。在初次移植物获取过程中，移植物在冰上保存了7.5小时。在将猪脱离呼吸机后，它们从手术中恢复，并进行了10天的随访。通过血液样本测定了血清肌酐和血尿素氮水平。检测值显示自体移植移植物结果良好。同种异体移植移植物的血清肌酐和尿素氮水平升高，提示移植物排斥反应。酸碱平衡和电解质水平在未加干预的情况下也保持稳定。组织学检查显示，自体移植肾的肾小管间质结构得以保留，而同种异体移植肾则表现出弥漫性间质炎症、小管炎和肾小球炎。观看本视频后，您应充分了解如何在猪模型中进行异位肾自体移植。为确保肾移植后良好的移植物功能，本视频展示了与临床人体手术相比在手术技术上的关键差异。

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