从土壤中根系的三维X射线计算机断层扫描数据中提取根系参数：体积与表面积分析

本实验的总体目标是从土壤中的X射线计算机断层扫描数据中提取植物根系的定量信息。这种研究活体植物根系结构的方法有助于回答生物学领域的一些关键问题，例如植物如何响应干旱、微生物活动等环境变化。该技术的主要优势在于其非侵入性，因此能够让我们在植物的自然生长环境——土壤中对其进行研究。

该方法的可视化演示具有重要价值，因为该过程涉及多个步骤，包括断层成像、数据重建和分析，若无视觉辅助，这些步骤可能难以理解。首先，将一盆植物放置在X射线断层扫描仪的样品操纵器上，调整至所需目标放大倍数的距离。对于直径为两英寸的容器中的植物，将样品与光源的距离设置为约三英寸。

在仪器控制软件中，将X射线功率设置为85千伏和190微安。然后，将曝光时间设置为1秒，以获得更优的信噪比。将投影数量设置为3,142，每个投影的帧数设置为4，以确保良好的数据统计性。

使用刚刚设置的扫描参数，选择“明暗校正”选项卡，然后点击“新建”并为明暗校正文件命名，最后点击“确认”以应用新的条件。

接下来，点击“创建”，然后点击“确定”以使用两张参考图像。接着点击“生成”。当警告弹窗出现时，在点击“确定”前，需先将样品从光束路径中物理移除。此时，阴影校正将开始运行。

现在，点击“采集”选项卡。为数据文件命名，然后选择X射线滤光片为“无”。确保勾选“最小化环形伪影”复选框，以便在采集投影图像时，样品能够以角度步进方式旋转。

最后，单击“Acquire”按钮开始扫描。采集原始数据后，将其载入重建程序中。通过单击“Blink”按钮比较第一幅和最后一幅图像，以确保样品在数据采集过程中未发生移动，且扫描参数未发生变化。

通过选择“旋转中心”选项卡，并使用“高精度”自动寻找旋转中心及双切片选择法来计算旋转中心（COR）。然后点击“开始”以运行计算。找到旋转中心后，点击“体积”选项卡以选择待重建的样品。

使用缩略图编辑体积选择窗口，然后单击“Start”以执行重建，生成包含三维数据的体积文件。为准备可用于RooTrak处理的图像堆栈，请通过点击“File”、“Import”、“Raw”，然后选择体积文件，将该体积文件导入ImageJ。

为了优化根系与土壤之间的图像对比度，请点击“图像”选项卡，然后选择“调整亮度/对比度”并点击“自动”。当目标区域在图像中清晰可见时，即认为设置已优化。通过点击“另存为”并选择“图像序列”，将图像以 JPEG、BMP 或 PNG 格式保存为图像堆栈。

为了在RooTrak中处理并分割根系，请选择“工具”选项卡并选择追踪器。然后双击对话框中的白色输入区域以加载图像堆栈。图像加载完成后，选择“追踪器”选项卡，并通过在体数据的顶部切片视图中每个相关根区段内部单击若干点，在根内设置种子点。

将追踪器参数平滑度设为 0.3，相似度设为 0.8。点击“输出目录”下方的字段以选择一个文件夹，然后点击“选择文件夹”并点击“开始”。

随后将运行追踪功能，该功能会从顶部图像切片开始，一直追踪到最底部的切片。打开并查看体数据后，根据可用的数据体积选择切片数量。

在此示例中，追踪在200个切片处停止，相当于6.2毫米的深度，此时根系边界变得模糊不清。要在ImageJ中进行体积和表面积分析，需通过选择“Process”（处理）、“Binary”（二值化），然后选择“Make Binary”（转换为二值图像），将RooTrak生成的图像堆栈转换为二值图像格式。使用开源ImageJ插件BoneJ，通过选择“Plugins”（插件）、“BoneJ”，然后选择“Isosurface”（等值面）来生成三角网格。

在打开的选项窗口中，将“重采样”和“阈值”分别设置为 6 和 120。然后，勾选“显示表面”，并点击“确定”按钮。在打开的 3D 查看器中，点击“文件”选项卡。

然后点击“导出表面”并保存为STL二进制格式。最后，打开IMESHJ，通过点击“选择STL文件”加载STL文件，并输入体素尺寸（单位：微米）。

单击“输入体素大小”，输入 31 微米，然后连续单击“确定”两次。单击“计算表面积”以获得样品总根系表面积（单位为平方毫米）。然后，单击“计算体积”以获得样品总根系体积（单位为立方毫米）。

样本包含原生草种草原落芒草（Sporobolus heterolepis）的两个茎秆及其周围的原始土壤，如图所示。重建数据生成的体素尺寸约为31立方微米。在生成图像序列并增强根系与土壤之间的对比度后，重建数据显示根系和部分土壤成分的X射线衰减系数非常接近，导致图像中灰度对比度极低甚至无法分辨。

该图显示了在体数据顶层切片中可见的相关根部区域内选择的一个代表性种子点。使用本视频中描述的RooTrak参数，RooTrak成功分割了约200层体数据切片，相当于6.2毫米的深度。本动画还演示了根部的分割过程。

此处使用 ImageJ 基于 RooTrak 生成的数据对三维体积构建三角网格等值面。采用默认设置可在相对较短的时间内生成精细的等值面。最后，通过 IMESHJ 计算得到表面积为 351.87 平方毫米，体积为 47.27 立方毫米。

一旦掌握，若操作得当，该流程可在五小时内完成。在尝试该技术时，重要的是牢记遵守所有安全规程。还需注意，只有当根系与土壤之间存在足够的X射线对比度时，才可能实现根系分割。

通过该方法，其他具有分支结构的样本（如树叶、动物和人类的肺等）也可进行成像和分析，以回答更多科学问题，例如活体组织如何生长，或其如何耐受特定环境条件。该技术建立后，为植物科学领域的研究人员探索模式植物（如短柄草）的抗旱性等特性提供了新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用断层扫描技术对植物样本进行成像，如何可视化其根系结构，并从土壤中原位X射线计算机断层扫描数据中提取根系的定量信息。

请注意，使用X射线仪器可能存在危险，在实施该技术时应遵循相应的安全操作规程。