小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

本实验流程的总体目标是用辐射减毒的疟原虫寄生虫对小鼠进行免疫，以促进对小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞募集的分析。该方法有助于回答疟疾研究领域中的关键问题，例如：在针对活体减毒寄生虫的天然免疫反应中，哪些细胞发挥了作用。

在感染性血餐后18至25天，将感染的蚊子收集到预冷的15毫升离心管中，并置于冰上进行低温麻醉。接着，小心地将离心管倒置在冰上的培养皿中，使蚊子暴露于12千拉德剂量的γ射线或X射线辐照。随后，在冰上用15微升DPBS收集经辐照的蚊子唾液腺。

然后，轻轻压碎腺体以释放子孢子。将高浓度的寄生虫悬液以小体积注射至关重要，因此需要从感染程度较高的蚊子中收集足够数量的唾液腺，可通过观察到强烈的绿色荧光表达来判断感染情况。在通过装有35微米滤器并适配于1.5毫升微量离心管的滤器进行过滤前，需重新混悬寄生虫悬液。

使用显微镜计数板对分离的子孢子进行计数，并在冰上用冷的DPBS将虫体悬液调整至每微升含有8.3×10⁴个子孢子的浓度。在注射子孢子前，通过脚趾夹捏法确认实验动物已达到适当的麻醉深度，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。随后，迅速操作，在体视显微镜下用透明胶带轻轻固定耳廓腹侧，用一支配有35号针头的10微升注射器吸取0.6微升重悬的虫体悬液。

接下来，将针头斜面朝上，小心地插入耳背侧表皮下方，向注射部位注入 0.15 µL 孢子体。注射部位将出现特征性的丘疹。按照上述方法再在真皮内注射三次后，小心移除胶带，并持续观察小鼠直至其完全恢复。

在子孢子接种后的预定时间点，处死小鼠并立即开始操作。确保小鼠已呈现临床死亡体征。用70%乙醇对耳部及相应的颈部区域进行消毒。

接下来，使用无菌剪刀和镊子，在颈静脉-颈动脉区域做一切口。然后用两把镊子将切口撑开，暴露出呈灰色的引流淋巴结。小心地用镊子夹住并去除淋巴结正上方的结缔组织，并用另一把镊子从下方将其夹出。

将淋巴结转移至六孔组织培养板的一个孔中的70微米细胞筛上，孔内含有4.5毫升标准培养基，并添加胶原酶和DNase。接着，取下整个接种过的耳组织，用两把镊子夹住并分离耳组织为背侧和腹侧两部分。然后将耳组织的每一侧分别放入第二个六孔板的孔中，每孔加入含消化酶的培养基4.5毫升，注意确保每块组织完全浸没在培养基中。

为了从淋巴结中分离免疫细胞，将盛有淋巴组织的培养板在37摄氏度、5% CO2条件下轻柔振荡孵育15分钟。随后，向每孔中加入10 mM EDTA，并将培养板置于冰上。接着，针对每个淋巴结，使用一支新的5毫米注射器活塞末端，以环形运动方式将淋巴结在滤筛上按压，以解离组织。

当仅剩白色结缔组织时，用500 µL含FBS和EDTA的DPBS将滤网冲洗两次，并将洗涤液转移至15 mL锥形管中。随后，再用500 µL添加了补剂的DPBS洗涤孔板两次，并将洗涤液转移至置于冰上的试管中。为从耳部分离免疫细胞，将耳叶组织置于37°C、5% CO2条件下，进行轻柔振荡孵育。

20分钟后，将组织切成更小的片段以促进其消化，并将样品放回培养箱。40分钟后，用10毫摩尔EDTA终止消化反应，并将培养板置于冰上。使用剪去尖端的1毫升移液枪，将每个孔中的全部内容物转移至含有70微米细胞筛的新孔中。

使用一个5毫升注射器的推杆，以圆形运动方式解离耳组织碎片，操作方法如刚才所示。当仅剩白色结缔组织和毛发时，用含FBS和EDTA的DPBS冲洗滤网和孔板中的残余物，操作方法如刚才所示，并将冲洗液收集至置于冰上的50毫升离心管中。最后，用添加了补剂的DPBS洗涤孔板两次，并将洗涤液转移至放置在冰上的离心管中。

在本视频中，可以看到放射减毒子孢子在皮内注射后15分钟迁移至小鼠皮肤的情况。皮内注射子孢子24小时后，从小鼠皮肤和引流淋巴结中分离出全部细胞。如本图所示，与未免疫小鼠相比，皮肤和引流淋巴结中髓系细胞的频率显著增加。

一旦掌握，从蚊子辐照到子孢子注射的实验方案初始步骤可在四小时内完成。在进行此操作时，需注意从蚊子唾液腺中分离的子孢子会迅速丧失感染能力，因此必须尽快完成注射。

观看本视频后，您应能充分掌握如何从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞，以探究其对皮内注射减毒疟原虫活体寄生虫的免疫应答反应。