的简化方法超低密度，长期主要海马神经元文化
2016年3月5日
原代海马神经元的低密度培养通常需要神经胶质饲养层来提供神经营养因子并维持长寿。我们在这里描述了一种在高密度神经元饲养层存在下在玻璃盖玻片上培养超低密度神经元的简化方法，这有助于研究特定的神经元自主机制。
该程序的总体目标是以超低密度建立原代小鼠海马神经元的健康长期培养物，以促进免疫细胞化学标记和神经元细胞自主机制的研究。本研究可以帮助理解神经科学研究领域的一些关键问题，例如蛋白质在发育功能的神经形态学中的特异性研究。该技术的主要优点是它允许神经元在盖玻片上以超低密度生长，而无需神经胶质饲养层的支持。
演示该程序的是我实验室的学生 Mariel Piechowicz。准备两个高密度和两个低密度 24 孔板。使用 28 号针头蚀刻 24 孔板的底部，以便移位的塑料作为盖玻片的支撑，其上生长着低密度神经元。
将无菌玻璃盖玻片转移到两个专门用于低密度培养的 24 孔板中。用 300 微升 0.1 毫克/毫升的用硼酸盐缓冲液稀释的聚-D-赖氨酸包被所有四个板，然后将它们放回培养箱进行过夜孵育包被。在组织收集之前，准备两个 10 厘米的培养皿，里面装满了冰冷的无菌 HBSS。
在显微镜下，用镊子握住胚胎的脖子，然后在中线上进行第一次切割，低于小脑水平。随后，在颅底左侧切开。接下来，在颅底右侧再切一次。
在喙端留下一小部分颅骨和皮肤组织未切割，以便将整个大脑翻转到一边以便轻松提取。现在将大脑转移到 HBSS 溶液中。检查大脑以确保它完好无损，没有明显的截断区域。
然后，重复这些程序，将其余的胚胎大脑收集在含有 20 毫升冷 HBSS 缓冲液的新培养皿中。将每个大脑的腹侧朝上。在尾端用镊子按住大脑的同时，用锋利的镊子在中喙点和尾颞区之间对角线切割。
对另一个半球重复此作。之后，将海马体完整的两个半球与大脑的其他干组织分开。对所有大脑重复这些程序，并将所有解剖的半球汇集在一起。
然后，用两对镊子去除脑膜。将发育中的海马体识别为折叠在颞叶内的弯曲结构，并将其与相邻的皮质组织分开。收集并汇集所有海马组织。
在此过程中，将所有解剖的海马体转移到 15 毫升锥形管中的酶消化溶液中。接下来，将试管放入水浴中，在 37 摄氏度下孵育 25 分钟。25 分钟后，小心地去除酶溶液。
然后，加入 5 毫升温热洗涤培养基，使总体积达到 10 毫升。通过缓慢倒置试管五次来轻轻清洗组织。去除洗涤介质并再次加入 10 ml 洗涤介质，以进行另一次洗涤。
之后，去除洗涤介质并再次加入 3 毫升新鲜的温洗涤介质。用手用力摇动试管 15 次，以将消化的神经元从组织中移出。一旦细胞从组织中分离到洗涤培养基中，培养基就会变得浑浊。
然后，将细胞悬液收集在新的 15 mL 锥形管中，同时将剩余的组织留在管中。之后，向组织中再加入 2 毫升洗涤培养基，然后用塑料移液管研磨 15 次，轻轻分离剩余的组织。让细胞悬液静置 5 分钟，然后将其汇集到一个新的 15 mL 锥形管中，该管包含收集的摇晃细胞。
然后，用血细胞计数器计数神经元的密度。计算产生每毫升 250， 000 个神经元密度所需的细胞悬液体积，并将其添加到含有 30 毫升完全培养基的两个锥形管之一中，以产生高密度神经元铺板培养基。将 1.2 毫升这种高密度神经元溶液转移到另外 30 毫升完全培养基中，以产生每毫升 10， 000 个神经元的浓度，并使用该溶液接种低密度盖玻片。
在此过程中，将底部蚀刻的 24 孔板放置在培养罩中，用于高密度神经元。通过真空去除 300 微升预处理培养基，然后以每毫升 250， 000 个神经元的速度接种 0.6 毫升高密度细胞悬液。将另外两个带有盖玻片的 24 孔板放入培养罩中。
通过真空去除 300 微升预处理培养基，然后以每毫升 10， 000 个神经元的密度接种 0.6 毫升低密度细胞悬液在盖玻片上。然后，将所有四个 24 孔板放回培养箱中，孵育 2 小时。之后，将粘附神经元的低密度盖玻片翻转到高密度培养物中，并确保神经元彼此相对。
随后，将共培养的两个板放回培养箱中。通过在 DIV 5 添加 300 微升新鲜饲料培养基来喂养共培养物。初始补料后，每周向每个孔中加入 300 μL 不含阿拉伯胞嘧啶苷的新鲜补料培养基。
如果培养物保存超过一个月，则在一个月的时间点之后，每周用新鲜饲料培养基更换一半的培养基。从形态学上讲，高密度和低密度神经元在三个月内都应该看起来健康。在这里，免疫细胞化学标记用于揭示功能性谷氨酸能突触，其中 NMDA 受体亚基 NR1 和 ApoE 受体亚基 GluR1 用双染色标记。
并且功能性突触可以使用图像 J 很容易地识别和定量，低密度神经元也用针对树突状蛋白标志物 MAP2 的抗体与轴突蛋白标志物 p-Tau 联合标记。这种双重标记可以清楚地区分树突和轴突。使用磷酸钙方法也可以用 DNA 质粒成功转染低密度培养物，但在后期转染速率通常非常低。
该图表明 EGFP 转染可以揭示神经元形态，并使精细的树突状脊柱结构可见。最后，作为概念验证，超低密度神经元可以在促进 autapse 形成的条件下生长。这些生长在 Poly-D-赖氨酸包被的微岛上的超低密度自体神经元，可以通过这种共培养方案被高密度饲养神经元维持两个月以上。
一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在细胞培养当天的两到三个小时内完成。在尝试此过程时，用聚-D-赖氨酸涂覆玻璃盖玻片和 24 孔板底部至关重要。板底部的简单蚀刻足以为低密度海马神经元在盖玻片上生长提供机械和营养支持。
看完这个视频，你应该对如何在没有神经胶质饲养层的情况下培养超低密度的原代小鼠胚胎海马神经元有一个很好的了解。希望您可以将此方法用于自己的实验目的。
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概述
本文介绍了一种在玻璃盖片上以超低密度培养小鼠原代海马神经元的方法。该技术消除了对胶质喂养层的需求，允许研究神经元自主机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经元培养技术
背景
- 原代海马神经元通常需要胶质支持来生长。
- 超低密度培养可以增强对特定神经元功能的研究。
- 理解神经元机制对神经科学研究至关重要。
- 该方法旨在简化培养过程，同时保持神经元健康。
研究目的
- 建立原代海马神经元的长期培养。
- 便于免疫细胞化学标记。
- 研究神经元细胞自主机制。
使用的方法
- 准备高密度和低密度24孔板。
- 用28号针对板底部进行蚀刻。
- 使用盖片进行低密度神经元生长。
- 由实验室学生演示程序。
主要结果
- 成功建立了超低密度神经元培养。
- 神经元在没有胶质支持的情况下保持健康和长寿。
- 有效促进了神经元机制的研究。
- 为未来的研究应用提供了简化的方法。
结论
- 该方法允许研究神经元自主机制。
- 它简化了原代神经元的培养过程。
- 这种方法可以增强神经科学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing ultra-low density primary hippocampal neuron cultures without glial support enables mechanistic interrogation of cell-autonomous neuronal functions, reducing confounding variables in target validation. This approach supports predictive confidence in early discovery by isolating intrinsic neuronal phenotypes relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. Long-term culture stability (>3 months) facilitates sustained assay windows for lead compound screening and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal cell-autonomous mechanisms by eliminating glial feeder layer variability.
- Operational Value: Simplifies culture workflow by removing time-consuming glial preparation and maintenance steps.
- Predictive Value: Supports target de-risking through isolated study of protein function in neurite morphology and synaptic formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, serum-free, glial-free platform for quantifying synapse formation and dendritic spine morphology over extended periods.
- Operational Value: Etched well-bottom microspaces allow reproducible, low-density neuron seeding without physical spacers, enhancing assay standardization.
- Scalability: Compatible with standard 24-well plates and coverslips, enabling integration into existing imaging and transfection workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Ultra-low density autaptic neuron cultures model isolated neuronal circuit function, relevant to studying hyperexcitability in epilepsy and autism spectrum disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal observation of neuronal health and synaptic marker expression (e.g., NR1, GluR1, MAP2, p-Tau) to assess compound effects on neuronal integrity.
- Assay Continuity: Supports immunocytochemistry and transfection-based readouts for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early neuronal phenotype screening to mechanistic follow-up in lead optimization, particularly for CNS-targeted programs requiring neuronal health readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuronal-autonomous pathways by isolating intrinsic growth and synaptogenesis without glial interference.
- Screening: Enables reproducible, low-density plating for high-content imaging of dendritic complexity and spine density as phenotypic endpoints.
- Analytics: Facilitates quantitative immunocytochemistry and image-based analysis of synaptic puncta and axonal-dendritic compartmentalization.
- Translational Research: Autaptic neuron islands allow study of isolated synaptic function, modeling monosynaptic circuit disruptions in disease.
- Enterprise Reuse: Poly-D-lysine coated coverslips and etched plates represent a low-cost, reusable platform for long-term neuronal culture across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal studies by eliminating glial-derived trophic and signaling confounders.
- Operational Value: Eliminates need for glial feeder layer preparation, reducing culture setup time and technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in CNS target validation by providing cleaner phenotypic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuron-specific functional data rather than mixed glia-neuron responses.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique for hippocampal dissection and enzymatic dissociation of embryonic mouse tissue.
- Depends on precise Poly-D-lysine coating of glass coverslips and 24-well plate surfaces for neuron adhesion.
- Necessitates micro-etching of well plate bottoms with a 28-gauge needle to create supportive microspaces for coverslips.
- Relies on weekly feeding with fresh medium (without cytosine arabinoside after DIV5) to maintain culture health beyond one month.
- Limited transfection efficiency at later stages may require alternative methods (e.g., viral vectors) for genetic manipulation in mature neurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
24-well Plate Preparation for High and Low Density Neuron Culture
1:48
Brain Removal and Hippocampi Dissection of E16.5 - E17.5 Mouse Embryos
4:02
Enzymatic Digestion and Separation into Single Neurons
6:53
Plating of Neurons and Long Term Co-Culture
8:51
Results: Experimental Manipulations of Low Density Neurons Grown in Co-Culture
10:23
Conclusion
