一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法

本实验的总体目标是建立健康且可长期培养的原代小鼠海马神经元超低密度培养体系，以方便进行免疫细胞化学标记以及神经元细胞自主性机制的研究。该研究有助于理解神经科学领域中的一些关键问题，例如蛋白质在神经形态学及发育功能中的特异性研究。该技术的主要优势在于，无需胶质细胞饲养层的支持，即可使神经元在盖玻片上以超低密度生长。

演示该实验操作的是我实验室的学生 Mariel Piechowicz。准备两块高密度和两块低密度的 24 孔板。使用 28 号针头在 24 孔板底部进行划痕，使产生的塑料碎屑可作为支撑，用于承载生长有低密度神经元的盖玻片。

将无菌的玻璃盖玻片转移至指定用于低密度培养的两个24孔板中。用300 µL以硼酸盐缓冲液稀释的0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸对所有四个板进行包被，并放回培养箱中过夜孵育包被。在组织采集前，准备两个盛有冰冷无菌HBSS的10 cm培养皿。

在显微镜下，用镊子夹住胚胎的颈部，于小脑水平下方正中线处进行第一刀切割。随后，在颅底左侧进行第二刀切割。接下来，在颅底右侧进行第三刀切割。

在颅骨前端保留一小部分颅骨骨组织和皮肤组织不进行切割，以便能够轻松地将整个脑组织翻转并取出。现在将脑组织转移至HBSS溶液中。检查脑组织，确保其完整，无明显缺损区域。

然后，重复上述操作，将剩余的胚胎脑组织收集到一个新的培养皿中，该培养皿内含有 20 毫升冷的 HBSS 缓冲液。将每个脑组织腹面朝上放置。用镊子夹住脑组织尾端固定，再用尖头镊子从头侧中点至尾侧颞区之间进行斜向剪切。

对另一侧半球重复此操作。随后，将带有完整海马体的两个半球与其余脑干组织分离。对所有脑组织重复上述操作，并将所有分离出的半球合并在一起。

然后，使用两把镊子去除脑膜。辨认发育中的海马体，其呈弯曲状结构，折叠于颞叶内，将其与邻近的皮层组织分离。收集并合并所有海马体组织。

在此步骤中，将所有分离的海马体转移至含有酶消化液的15毫升锥形管中。接着，将管子放入水浴中，在37摄氏度下孵育25分钟。25分钟后，小心移除酶溶液。

然后加入 5 毫升预热的洗涤液，使总体积达到 10 毫升。通过缓慢倒置离心管五次，轻柔地洗涤组织。移除洗涤液，再加入 10 毫升洗涤液进行一次额外洗涤。

随后，移除洗涤液，并再次加入三毫升新鲜的温洗涤液。用手剧烈振荡试管15次，以使消化后的神经元从组织中脱离。当细胞从组织中分离并进入洗涤液后，液体应变得浑浊。

然后，将细胞悬液收集到一个新的15毫升锥形管中，同时将剩余的组织留在原管中。接着，向组织中再加入2毫升洗涤液，用塑料移液管轻轻吹打15次，以充分分离残留的组织。将细胞悬液静置5分钟后，转移至另一个含有已收集解离细胞的15毫升锥形管中。

然后，使用血细胞计数板对神经元密度进行计数。计算获得每毫升含250,000个神经元所需的细胞悬液体积，并将其加入两个含有30毫升完全培养基的锥形管之一中，配制高密度神经元接种培养基。取1.2毫升该高密度神经元溶液加入另一份30毫升完全培养基中，使终浓度为每毫升10,000个神经元，并用此溶液接种低密度细胞爬片。

在此步骤中，将底部刻蚀的24孔板用于高密度神经元置于培养罩内。用真空泵吸除300微升预条件培养基，然后加入0.6毫升浓度为每毫升250,000个神经元的高密度细胞悬液。将另外两个载有盖玻片的24孔板置于培养罩内。

在将低密度细胞悬液以每毫升10,000个神经元的浓度接种到盖玻片上之前，先用真空法吸除300微升预处理培养基。随后，将全部四个24孔板放回培养箱，孵育2小时。之后，将带有贴壁神经元的低密度盖玻片翻转至高密度培养物上，并确保神经元相对接触。

随后，将这两块共培养的培养板放回培养箱。在体外培养第5天（DIV 5），通过每孔加入300 µL新鲜培养基对共培养物进行换液。在此首次换液后，每周向每孔加入300 µL不含阿糖胞苷的新鲜培养基。

若培养时间超过一个月，应自一个月时间点起每周更换一半新鲜培养基。形态学上，高密度与低密度神经元均应保持健康状态达三个月之久。此处采用免疫细胞化学染色标记以显示功能性谷氨酸能突触，其中NMDA受体亚基NR1与载脂蛋白E受体亚基GluR1通过双标染色进行标记。

功能型突触可轻松通过 ImageJ 进行鉴定和定量。低密度神经元还可利用针对树突蛋白标志物 MAP2 的抗体与轴突蛋白标志物 p-Tau 抗体联合标记。这种双重标记可清晰区分树突与轴突。尽管转染率在后期通常非常低，但低密度培养的神经元也可成功通过磷酸钙法转染 DNA 质粒。

该图说明，EGFP转染可揭示神经元形态，并使精细的树突棘结构可见。最后，作为概念验证，可在促进自突触形成的条件下培养超低密度神经元。这些在聚-D-赖氨酸包被的微岛表面培养的超低密度自突触神经元，通过本共培养方案可由高密度饲养层神经元支持存活超过两个月。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在细胞培养当天的两到三小时内完成。在进行该实验时，用多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）包被玻璃盖玻片和24孔板底部至关重要。对板底进行简单的蚀刻即可为低密度海马神经元在盖玻片上的生长提供足够的机械与营养支持。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在无胶质细胞饲养层的条件下培养超低密度的原代小鼠胚胎海马神经元。希望您能将此方法应用于自身的实验研究中。