靶向显微注射技术用于发育中的 非洲爪蟾 肾脏

本实验的总体目标是将显微注射靶向至正在发育的非洲爪蟾肾脏。该方法有助于解答发育生物学领域中的一些关键问题，例如肾脏是如何形成的，以及哪些基因在这一过程中起重要作用。该技术的主要优势在于能够最大程度地将显微注射的试剂递送至目标组织。

可视化该方法非常重要，因为确定用于靶向显微注射的正确卵裂球至关重要。开始此操作时，从一只雄性青蛙中分离出两侧睾丸，并置于盛有10毫升睾丸储存液的60毫米培养皿中。然后将睾丸在4摄氏度下保存。

接下来，从雌性青蛙中收集卵子至一个100毫米的培养皿中。倒掉培养皿中多余的水分。随后，在睾丸储存液中切下四分之一的睾丸组织。

将睾丸组织块转移至含有卵子的培养皿中。随后，将睾丸组织切成小块。向培养皿中加入含庆大霉素的MMR溶液，以浸没卵子。

轻轻晃动培养皿使其混合，然后在室温下静置约30分钟，以完成受精过程。受精后，胚胎的色素面应朝上。使用移液管吸出培养皿中的MMR溶液，并加入足量的脱胶液以覆盖胚胎。

随后，在接下来的几分钟内轻轻晃动培养皿，以溶解胚胎表面的胶状层。当胚胎在培养皿中央紧密聚集并相互接触时，表明胶状层已去除。用移液器吸出脱胶溶液。

接下来，用含庆大霉素的MMR溶液将去胶膜的胚胎小心地洗涤3至5次，操作时轻轻倒出MMR并加入新的MMR溶液。注意不要将培养皿中的MMR完全移除，以免损伤胚胎。随后，从培养皿中移除未受精的卵子或睾丸组织碎片。

为了错开发育时间，将同一次受精产生的半数胚胎置于保持在 14 摄氏度的培养皿中，另一半胚胎置于保持在 18 摄氏度的培养皿中。胚胎在 14 摄氏度下的发育速度将慢于 18 摄氏度下的发育速度，从而允许从同一批受精卵中进行多次注射操作。

配制含有0.01 ng/nL膜结合型红色荧光蛋白mRNA的注射溶液。在胚胎发育至4细胞或8细胞阶段时，将注射溶液置于冰上保存，直至使用。

然后，将一根七英寸的替换玻璃毛细管装入拉针仪中，使替换管的顶端与拉针仪外壳的顶端对齐。将加热参数二设为800，拉制参数设为650，按下拉制按钮进行拉针。随后，用一对 Dumont 镊子剪去拉制后针尖的尖端。

将微量移液器卡套套入针头后端。接着，将大孔O型圈套在卡套后方的针头尾部。然后，使用27号皮下注射针头向针内注入矿物油，注意避免将气泡带入针头中。

将针头套入显微注射器推杆上，使针头插入安装在推杆上的白色塑料垫片的大孔中。通过拧紧卡盘固定针头。接着，按住显微注射器控制盒上的“Empty”按钮，直至发出两声蜂鸣。

随后，将三微升注射溶液滴加到一片石蜡膜上。然后，将针尖插入石蜡膜上的注射溶液液滴中。按下并按住显微注射仪控制盒上的“Fill”按钮，将注射溶液吸入针尖内。

在进行显微注射之前，有必要了解非洲爪蟾胚胎的早期细胞分裂过程。单细胞胚胎具有深色素的动物极和白色、富含卵黄的植物极。在二细胞胚胎中，第一次卵裂通常发生在胚胎左侧与右侧之间。

这些细胞对前肾谱系的贡献相等。第二次卵裂将胚胎的背侧和腹侧分开，形成4细胞期胚胎。背侧细胞比腹侧细胞更小，色素更少。

若向4细胞期胚胎注射，应注射左侧腹侧卵裂球以靶向左侧肾脏。第三次卵裂将动物极与植物极两侧均等分割，形成8细胞期胚胎。

此时有四个动物极卵裂球和四个植物极卵裂球。若要靶向8细胞胚胎的左侧肾脏，需向左侧腹侧植物极卵裂球注射。随后，用含庆大霉素的5% Fycol MMR溶液填充底部铺有500微米聚酯网的60毫米培养皿。

用移液器小心地将20至30个8细胞期胚胎转移至培养皿中。使用毛细环操作胚胎，使待注射的卵裂球朝向注射针。若要靶向左侧肾，需排列胚胎，使8细胞期胚胎的左侧腹侧植物极卵裂球朝向注射针。

向培养皿中每个胚胎的选定卵裂球内注射10纳升注射液。然后，将注射后的胚胎转移至含有5% fycol的MMR加庆大霉素的培养板孔中。将注射后的胚胎在16摄氏度下孵育约一至两小时，以使注射的卵裂球恢复愈合。

随后，将显微注射后的胚胎转移至含有 MMR 加庆大霉素的新培养板孔中。将胚胎在 14 至 22 摄氏度条件下孵育，直至其发育至 38 至 40 期。在此步骤中，将 10 至 20 个 38 至 40 期的胚胎转移至玻璃小瓶中。

向小瓶中加入10 µL的5%苯佐卡因溶于100%乙醇的溶液。通过倒置小瓶混匀，静置10分钟以麻醉胚胎。接着，移除小瓶中的MMR溶液，并用MEMFA填充小瓶。

然后，将其置于三维摇床上，在室温下孵育1小时。1小时后，从离心管中移除MEMFA，并加入100%甲醇。随后，将离心管置于三维摇床上，在室温下继续孵育10分钟。

再重复此洗涤步骤一次，并将胚胎置于100%甲醇中，在-20摄氏度下保存过夜。此时胚胎已固定，可进行免疫染色。该示意图显示了在8细胞期的非洲爪蟾胚胎中，为靶向左侧前肾，应注射哪一个卵裂球，使用膜结合型红色荧光蛋白mRNA作为示踪剂。

注射到左侧腹侧植物极裂球后，示踪剂的定位显示为红色，而肾脏标记为绿色。该图像显示肾脏被3G8和4A6抗体染成绿色。此处为肾脏区域的放大视图，显示示踪剂的定位情况，而此处为合并图像，显示示踪剂与肾脏的共定位。

图中显示的是用 3G8 和 4A6 染色的第二个胚胎肾脏的共聚焦图像。这是红色示踪剂在肾脏及周围组织中的定位情况，而此图为合并图像，显示示踪剂 3G8 与 4A6 在肾脏中的共定位。在进行该操作之前，熟悉早期非洲爪蟾胚胎的形态特征非常重要。

这将使您能够通过已建立的非洲爪蟾褪色图谱准确定位显微注射。一旦掌握，该技术可进一步调整以靶向其他组织，例如神经管或心脏。