裂殖酵母性生命周期的显微镜
March 9th, 2016
我们为裂殖酵母性生命周期的长期显微镜检查提供了一种可重复的基本方法。通过描述微小的调整，所提出的方案允许研究集中在生殖过程的不同步骤上。
该方法的总体目标是通过光学显微镜监测裂变酵母中的整个有性繁殖过程。该方法描述了裂殖酵母细胞的制备，用于性生命周期各个阶段的延时成像，例如交配伴侣选择、极化生长、细胞间融合、肌层沉积和孢子形成。该技术的主要优点是它提供了单细胞可视化，因此克服了细胞不同步进入性分化的问题。
这种方法非常简单，但视觉演示有助于展示如何平行安装多个应变以进行显微镜检查。与我的博士生 Omaya Dudin 一起演示该程序的是我实验室的博士后 Laura Merlini。该方案有几种变体，可以使用同源或异源菌株进行定制以研究性生命周期的各个阶段。
在本演示中，将使用同菌体 H90 菌株。在这些菌株中，交配类型转换发生在氮剥夺后的最后一次有丝分裂期间，导致两种交配类型的混合。晚上，在交配实验前两天，将固体培养基中新鲜划线的菌株接种到含有 3 毫升最小孢子形成培养基的培养管中，其中含有氮或 MSL 和 N.在 25 摄氏度下摇动孵育过夜。
第二天早上，如有必要，用 MSL 加 N 稀释细胞悬液，以确保全天呈指数增长。晚上，测量光密度，并在 100 毫升烧瓶中用 20 毫升 MSL 加 N 培养基稀释细胞至光密度为 025野生型细胞培养物第二天早上应达到约 8 的光密度 600。因此，如果处理生成时间较长的菌株，则应相应地调整稀释度。
将培养物在 30 摄氏度下摇动孵育过夜。第二天早上，测量光密度以验证每种培养物的光密度为 600 左右，约为 8。以 1000 x g 的离心力沉淀细胞 1 分钟，然后将其转移至 1.5 mL 试管中。
在 1 毫升不含氮或 MSL 负 N 的最小孢子形成培养基中洗涤细胞 3 次，最后一次洗涤后，将细胞重悬于 3 毫升 MSL 负 N 培养基中。测量光密度并将细胞稀释至光密度 600 为 1.5。要开始制备琼脂糖垫，首先将 MSL 减去 2% 的 N 琼脂糖的等速铵在 95 摄氏度的加热块中熔化 10 至 15 分钟。
同时，将之前以 1000 x g 制备的 100 μL 细胞悬液沉淀 1 分钟。去除上清液，将细胞重悬于残留的 2 至 4 μL 培养基中。当细胞在工作台上等待时，在两个垫片之间的载玻片上加入 200 μL 熔化的培养基。
轻轻地将另一张载玻片放在融化的琼脂上。琼脂糖凝固后，小心地去除垫片。要取下顶部载玻片，请轻轻旋转并将其向侧面拉动。
如果要同时对多个应变进行成像，则可以将焊盘细分为四个迷你焊盘。为此，请使用剃须刀片并将垫子从中间劈开，将部件拉到一边约 1 毫米，然后沿垂直方向重复。向琼脂糖垫中加入 1 μL 细胞，等待约 1 分钟。
用盖玻片盖住细胞，并用加热的 VELAP 密封盖玻片的整个外围。密封整个盖玻片以防止垫干燥非常重要。在成像之前，让垫子静置至少 30 分钟。
为了确保方案的成功和高交配效率，细胞应保持指数生长，直到氮气饥饿，并在没有过量液体的情况下封片，以便它们在琼脂糖垫上静止。然后按照方案文本中描述的程序在 25 摄氏度或室温下进行交配酵母细胞的活细胞成像。延时成像可以可视化在氮饥饿后 24 小时内经历 shmooing、融合和孢子形成的细胞。
在这个具有代表性的电影中，左下角插图中放大的两个单元格说明了这个过程。该方案还可用于监测交配细胞中荧光标记蛋白的动力学。在这里，一个表达 3GFP 标记的 myo52 的异门 H 菌株与一个表达 myo52 的异门 H+ 菌株交配，该菌株与红色荧光 tdTomato 蛋白以及胞质 GFP 融合。
胞质 GFP 允许监测融合的时间，通过其进入 H 细胞进行可视化。这些延时图像显示 myo52 最初形成于整个细胞皮层的动态区。然后在融合事件之前将 Myo52 信号稳定在单个焦点中。
看完这个视频后，您应该对如何准备细胞进行高效交配和裂变酵母交配过程的活细胞研究有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种可重复的方法，用于裂殖酵母的长期显微镜观察其性生命周期。该协议允许研究人员通过时间序列成像关注生殖过程的各个阶段。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 微生物学
- 生殖生物学
背景
- 裂殖酵母是研究有性生殖的模式生物。
- 理解性生命周期对于洞察细胞分化至关重要。
- 先前的方法无法在生殖过程中观察单个细胞。
- 该方法解决了性分化同步问题。
研究目的
- 监测裂殖酵母整个性生殖过程。
- 为研究人员提供一个简单而有效的协议。
- 展示将多个菌株安装于显微镜下的程序。
使用的方法
- 为时间序列成像准备裂殖酵母细胞。
- 观察交配伴侣选择、极性生长和细胞-细胞融合。
- 观察减数分裂和孢子形成阶段。
- 使用同源和异源菌株进行不同的研究。
主要结果
- 成功地在性生命周期中观察单个细胞。
- 通过显微镜展示各种生殖阶段。
- 协议调整允许对特定生命周期阶段进行定制研究。
- 与学生的合作增强了该方法的教育方面。
结论
- 该方法为研究裂殖酵母的繁殖提供了一个有价值的工具。
- 它克服了之前在观察性分化中的局限性。
- 未来的研究可以在这一协议基础上进一步探索酵母生物学的其他方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microscopy method enables detailed observation of dynamic cellular processes in a genetically tractable model system, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By visualizing mating, fusion, and sporulation at single-cell resolution, it provides quantitative phenotypic data that can inform target validation and assay development for conserved eukaryotic pathways. The approach enhances predictive confidence in probing fundamental biological mechanisms relevant to drug target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of conserved cellular mechanisms such as polarized growth and cell-cell fusion relevant to target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible system for phenotypic screening of genetic or chemical perturbations affecting mating efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved readouts of morphological transitions suitable for high-content imaging assays.
- Operational Value: Supports standardization through agarose pad chambers that ensure consistent environmental conditions across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of conserved regulators of meiosis and sporulation with potential relevance to gametogenesis and cellular differentiation pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of fluorescently tagged proteins to assess target engagement and dynamics in live cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic characterization of cellular behaviors informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of signaling pathways governing cell polarity and fusion through direct visualization.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs on cellular morphology and progression that enable comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides morphometric and fluorescence-based measurements that support statistical analysis of cellular responses.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through conservation of cell cycle and fusion machinery in higher eukaryotes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple stages of the sexual lifecycle and various genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cellular processes by enabling direct observation of asynchronous events in individual cells.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sample preparation and environmental control during time-lapse imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing phenotypic clarity on target modulation in a genetically accessible system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a disease-relevant cellular context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture techniques and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to temperature-controlled imaging systems and agarose pad preparation tools.
- Necessitates standardization across teams for consistent nitrogen deprivation timing and cell mounting procedures.
- Adaptation to non-yeast systems may require optimization of substrate compatibility and environmental conditions.
- Practical limitations include the need for careful sealing to prevent desiccation during extended imaging sessions.
