在不含金属纳米颗粒的情况下将细胞色素 c 封装于二氧化硅气凝胶纳米结构中并保持其气相生物活性

本实验的总体目标是将细胞色素c包埋于硅酸盐溶胶-凝胶中，通过超临界处理这些凝胶以形成生物气凝胶，并利用这些生物气凝胶通过气相反应快速识别一氧化氮。该方法有助于回答生物传感与生物分析领域中的一些关键问题，例如：在高度多孔的气凝胶中包埋时，细胞色素c保持活性所需的条件是什么？

该技术的重要意义在于，它提供了一种简单的方法，用于将蛋白质包封在基质中，而蛋白质在此类基质中以往很少能成功包封。尽管该方法可为细胞色素c的研究提供见解，但也可能推动其他蛋白质在气凝胶中包封的工艺发展，对未来生物分析装置具有潜在意义。配制细胞色素c浓度在0.7至毫摩尔范围内的溶液。

除了文中所述的稀释后的0.105毫摩尔细胞色素c溶液外，还需标记一个一次性50毫升聚丙烯烧杯，记为烧杯A。将该烧杯置于分析天平的托盘上，使用玻璃巴斯德移液管向烧杯中加入1.88克四甲氧基硅烷。归零天平。

然后将2.88克甲醇用移液器加入标记为A杯的烧杯中，用封口膜覆盖A杯。接着，将一个磁力搅拌子加入一个一次性50毫升聚丙烯烧杯（标记为B杯）中，并将B杯置于分析天平的托盘上。使用玻璃移液器加入0.75克水和3.00克甲醇，然后用封口膜覆盖B杯。

在通风橱内的搅拌器上开始搅拌B烧杯中的内容物。然后，使用注射器将5 µL 28.0%至30.0%的氢氧化铵溶液穿过封口膜插入混合液中，同时持续搅拌。此步骤完成后，立即向B烧杯中加入A烧杯的全部内容物。用封口膜覆盖后继续搅拌混合物20分钟。

在混合二氧化硅溶胶混合物的同时，准备8至9个聚丙烯闪烁小瓶及相应的瓶盖。在小瓶瓶口端覆盖一层塑料薄膜，以形成供凝胶生成的平整表面，然后将瓶盖盖在上面。

确保保鲜膜在盖子内部保持完整。将小瓶管口朝下、开口端朝上整齐排列在实验台面上，然后剪取若干块封口膜，用于覆盖每个小瓶。

完成溶胶混合后，将3毫升溶胶混合物加入洁净的一次性50毫升聚丙烯烧杯中。使用玻璃巴斯德移液管，沿烧杯壁将500微升0.105毫摩尔稀释的细胞色素c溶液缓慢滴加到3毫升溶胶混合物中，整个过程持续约一分钟。在加入细胞色素c时，需轻轻旋转混合液，以避免形成较大的红色团块。

用移液器将0.5毫升制备好的细胞色素c二氧化硅溶胶加入每个已准备好的模具中。同时，将0.5毫升剩余的纯二氧化硅溶胶加入一至两个模具中，作为超临界干燥过程中的对照样品。用Parafilm封住模具开口面，放入冰箱过夜，或至少12小时，以形成溶胶-凝胶。

将模具从冰箱中取出。取一个含有细胞色素c溶胶的模具，移除其顶部的封口膜，同时移除底部的盖子和塑料包裹膜。从清洗瓶中加入适量乙醇至模具中，然后使用注射器推杆的圆形端部小心地将凝胶从模具中推出，放入一个洁净的20毫升玻璃闪烁小瓶中，小瓶内预先加入约5毫升乙醇。

重复此凝胶去除步骤，直至所有细胞色素 c 凝胶均加入一个离心管中，所有硅胶均加入另一个单独的离心管中。然后用乙醇将离心管加满至管口。盖紧管盖，于 2 至 8 摄氏度条件下保存。

每天每隔四小时，将凝胶从冰箱中取出，倾去乙醇，并更换新鲜乙醇。在额外的三天内，将湿凝胶浸入丙酮中，每天倾去并更换新鲜丙酮三次。

通过将连接的循环器温度设置为8摄氏度，使临界点干燥仪冷却至10摄氏度。当仪器温度达到10摄氏度后，按照文本方案中所述方法对仪器进行漏气检测。确认仪器无泄漏后，小心地将闪烁小瓶中的湿凝胶连同大部分丙酮倒入转移舟的三个长段中。

如有需要，可添加更多丙酮，以确保在将装置内的小船密封前，所有凝胶均完全浸没于丙酮中。打开装置的充气阀，通入二氧化碳。通过装置观察窗观察到二氧化碳沉降至装置底部时，打开排水阀，排出丙酮5分钟。

在装置完全充满二氧化碳之前，丙酮渗漏至底部的现象就会发生。因此，在排液过程中应保持充注阀开启，以使装置持续充气，随后关闭排液阀。

保持填充阀略微开启。最初流出的混合物中含有水，因为丙酮并非无水丙酮。排水管可能出现冻结、堵塞及压力积聚。

如果检测到堵塞，请关闭排水阀，直至堵塞物融化。五分钟后，打开排水阀继续排水五分钟，并调节进水阀至适当开启程度，以确保在整段排水期间装置始终充满液体。五分钟后，关闭排水阀，同时保持进水阀微开。

然后，在五分钟后再重复此排液步骤一次。排液步骤完成后，关闭填充阀，并排出液态二氧化碳，使液面在装置窗口中刚好保持在样品舟金属触点上方可见的位置。接下来，将装置连接的循环器温度设定为 40 摄氏度，以确保液态二氧化碳升至其临界温度和临界压力以上。

大约15分钟后，通过装置窗口观察液体向超临界流体的转变过程，此时舟状容器叉部上方的液体弯月面将消失。在至少15分钟的平衡时间后，略微打开排气阀，开始释放超临界流体。在接下来约45分钟内，持续逐步增大排气阀的开度，使释放的流体发出稳定但非常轻微的嘶嘶声，同时观察压力表缓慢降至零。

当仪器压力降至零后，打开仪器门。取出舟形坩埚，并使用镊子将新干燥的气凝胶放入洁净的玻璃闪烁小瓶中。

细胞色素c二氧化硅气凝胶现已制备完成，可根据文中所述表征方法用于检测一氧化氮气体的存在。图中展示了封装了15微摩尔细胞色素c的气凝胶，其缓冲液分别为4.4毫摩尔、40毫摩尔和70毫摩尔的磷酸钾缓冲液，并与一枚十分硬币进行尺寸对比。此处显示的是在不同条件下，缓冲液中的细胞色素c与封装在气凝胶中的细胞色素c的代表性光谱对比。

细胞色素c在409纳米处的Soret峰在气凝胶内基本保持不变，当生物气凝胶暴露于气相一氧化氮时，则产生特征性的红移。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成二氧化硅溶胶-凝胶，将细胞色素c包埋到这些溶胶-凝胶中，并将这些复合溶胶-凝胶干燥转化为气凝胶。有关生物气凝胶的表征及其用于检测气相一氧化氮的更多信息，请参见文本方案。