无饲养层条件下由人多能干细胞分化获得黑色素细胞

本方案的总体目标是将人类多能干细胞分化为完全色素化的成熟黑色素细胞。该方法有助于鉴定黑色素细胞发育过程中的关键因子。此外，本方案将使我们能够识别疾病发展过程中出现异常的因子，并可用于药物筛选及新药发现。

本方案的主要优势在于能够产生大量完全色素化的黑素细胞，而从患者体内分离黑素细胞通常只能获得相对较少的细胞。在分装并冷冻凝胶状蛋白后，将一毫升分装物解冻，并悬浮于19毫升DMEM f12培养基中。

然后将五毫升该混合物加入一个10厘米的组织培养皿中。制备多个此类培养皿后，于室温下孵育一小时。接下来，开始制备包被PO、层粘连蛋白和纤连蛋白的培养皿，首先将含有15微克/毫升PO的PBS加入培养皿中。

然后将培养板置于37摄氏度的湿化培养箱中孵育过夜。随后吸去溶液，并用1×PBS洗涤培养皿三次。继续包被步骤：加入10毫升含有1微克/毫升小鼠层粘连蛋白1和2微克/毫升纤连蛋白的PBS溶液。

然后，按照先前所述的方法孵育培养皿。首先，在10厘米培养皿中加入含0.1%明胶的PBS，并在室温下放置5分钟。

在包被此培养板的同时，将冻存的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）置于37摄氏度水浴中快速解冻。随后，吸除培养皿中的明胶，并在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中以每平方厘米约50,000个细胞的密度接种MEFs。在37摄氏度培养过夜后，吸除培养基，并用1×PBS洗涤制备好的MEF培养板。

向一个10厘米培养皿中加入10毫升预先准备好的含有人多能干细胞（简称hPSCs）的hESC培养基。以每皿500万个细胞的密度接种细胞后，在37°C、5%二氧化碳的条件下培养细胞。每天使用10毫升新鲜hESC培养基对细胞进行换液。

在开始分化之前，检查培养板上是否存在含有分化细胞、形态不规则边界或透明中心的克隆。在超净台内的体视显微镜下，用移液器机械性去除任何此类不规则的克隆。若需使用凝胶状蛋白（如Matrigel）进行包被，应先将蛋白分装为每份一毫升，然后冷冻保存，以避免反复冻融循环。

然后，用19毫升DMEM F12培养基解冻并重悬1毫升冻存的细胞悬液。将5毫升该混合液接种至10厘米培养皿中，在室温下孵育1小时。随后，在接种细胞前立即吸除凝胶状蛋白，并用DMEM F12培养基洗涤。在包被该培养皿的同时，选择一个hPSCs细胞密度约为80%融合度的培养皿。

吸除hESC培养基，然后用PBS洗涤细胞。移除PBS后，向培养板中加入3毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA。

继续水平剧烈震荡培养皿两分钟，直至在显微镜下观察到 MEFs 开始以单细胞形式脱落。在此期间，预期 hPSC 克隆仍附着在培养板上。一旦 MEFs 脱落，而 hPSC 克隆尚未脱离时，立即吸除胰蛋白酶。

然后，向培养板中加入含有10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐的10毫升hESC培养基。随后通过在细胞集落上方反复吹打使细胞脱离。接下来，转移至含有胶状蛋白的培养皿中，并吸除溶液。

用DMEM f12洗涤此培养皿，以去除任何团块。然后以1比2的比例将hPSCs接种到培养皿中。接着，向培养皿中加入含有10微摩尔Y-27632二盐酸盐的hESC培养基，补至10毫升。

将细胞在37摄氏度条件下孵育过夜。每天使用添加ROCK抑制剂的培养基喂养细胞。当hPSCs达到80%融合度时，开始启动神经分化，并将此时间点定义为第0天。

于第0天和第1天开始分化，使用含100纳摩尔LDN-193189（MP抑制剂）和10微摩尔SB 431542（activin与Nodal抑制剂）的10毫升KSR分化培养基喂养细胞。第2天继续更换为含有相同浓度的BNP、activin与Nodal抑制剂，并额外添加3微摩尔CHIR99021（Wnt激动剂）的培养基。随后在第3天，使用仅补充10微摩尔SB 431542和3微摩尔CHIR99021的KSR分化培养基喂养细胞。

将75% KSR分化培养基与25% N2分化培养基混合，并加入3 µM Wnt激动剂。在第4天和第5天，向细胞中加入15 mL该液体培养基。随后，在第6天和第7天，用15 mL培养基喂养细胞，该培养基由50% KSR分化培养基和50% N2分化培养基组成，并额外添加了3 µM CHIR99021、25 ng/mL BMP4和100 nM EDN3。

然后，在第8天和第9天，使用20毫升含第6天和第7天相同浓度因子的25%KSR分化培养基和75%N2分化培养基对细胞进行换液。在第10天，继续进行神经分化，使用含有3 µM CHIR99021、25 ng/mL BMP4和100 nM EDN3的20毫升N2分化培养基对细胞进行换液。在第11天，吸除之前包被有PO laminin 1和纤连蛋白的培养皿中的溶液。

然后将培养板置于超净工作台中敞口放置约10至15分钟，使其完全干燥。接着移除第11天细胞的培养基，并用PBS洗涤细胞。随后向培养皿中加入4毫升细胞解离溶液，于37摄氏度孵育25分钟。

孵育后，向培养皿中加入5毫升完全黑色素细胞培养基，通过手动反复吹打使细胞从培养板上脱落并重悬细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。使用台盼蓝染色法和血细胞计数板对细胞进行计数后，将细胞以每毫升2×10⁶个细胞的密度重悬于完全黑色素细胞培养基中。

将10微升细胞悬液滴加到已干燥的包被培养皿上。确保液滴之间相互靠近但不接触，边缘清晰且不扩散。为使细胞贴壁，将液滴在室温下静置10至20分钟。

随后，缓慢向培养皿中加入10毫升完全黑色素细胞培养基，注意不要扰动已贴壁的细胞。然后将培养皿放入培养箱中。每隔两到三天使用完全黑色素细胞培养基对细胞进行换液。

预计在第一周结束时观察到细胞簇中出现色素沉着。每周传代一次细胞，首先按前述方法用细胞解离液处理细胞。收集细胞并离心后，用普通神经基础培养基洗涤两次。

然后，将细胞以1:6的比例重新接种到含有PO、层粘连蛋白1和纤连蛋白包被的培养皿中，使用完全黑色素细胞培养基进行培养。约30天分化后，细胞将呈现深色素沉着，在高密度接种或传代时离心成团的情况下易于观察。

图中所示为转染 psox10 GFP 的人胚胎干细胞系在所述分化方案培养至第 11 天、细胞重铺板前的明场图像。在这些培养物中可见明显且界限清晰的细胞隆起结构。当检测这些培养物的 GFP 信号时，发现这些深色隆起区域富集了 sox10 阳性细胞。

由于 sox10 是一种由神经嵴干细胞上调并在黑色素母细胞中持续表达的转录因子，这些结果表明，到第11天，该分化方法富集了最终将发育为黑色素细胞的细胞。事实上，在培养第20天时，可观察到无色素、正在成熟以及完全成熟的色素化黑色素细胞。在第25天时，培养物中仍可见相同类型的细胞。

通过两种黑色素生成蛋白的染色，可确认这些制备样本中存在成熟且有色素的黑素细胞。TYRP2 是黑素母细胞和黑素细胞的标志物，而 TYRP1 仅在有色素的成熟黑素细胞中表达，是晚期阶段的黑素细胞标志物。一旦掌握，本方案可在 25 天内将人多能干细胞分化为完全色素化的成熟黑素细胞。

该方案通过首先经历神经嵴状态以及黑素母细胞阶段，进而实现正常的黑素细胞发育过程。