Name: 从培养儿童原发性鼻腔上皮细胞和重新编程为诱导多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学习从儿童鼻腔无创采集上皮细胞并进行培养，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的技术。该方法为哮喘等呼吸道疾病研究提供可靠的细胞来源，有助于深入理解疾病机制并开发新治疗策略。

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作者谨此致谢辛辛那提儿童医院的多能干细胞中心和共聚焦成像核心设施。本研究由以下项目资助：R21AI119236（HJ）、R21AI101375（HJ）、NIH/NCATS 8UL1TR000077-04（HJ）、U19 AI070412（HJ）和 2U19AI70235（GKKH）。

以下方案遵循各机构人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 鼻腔黏膜取样
注意：应从无呼吸道病毒感染症状的受试者处获取样本。
<ol>
	<li>在受试者到访前，准备一个15 ml的锥形管，并加入2 ml BEGM（支气管上皮细胞生长培养基）以及20 µl无菌的青霉素/链霉素/两性霉素B（P/S/F）（0.01%）。</li>
	<li>在采集样本前立即打开细胞刷，确保细胞刷保持无菌状态，且除鼻腔表面外，不得接触任何其他表面。</li>
	<li>要求受试者保持静坐，头部向后仰起朝向天花板。对于较小或较为躁动的儿童，可让其坐在自己的手上和/或平躺，以避免挥打导致细胞刷移位。</li>
	<li>将细胞刷对准鼻腔后部通道变窄的位置（看起来像一个小黑孔）。将刷子轻轻滑入，并在从鼻孔中取出时旋转手腕。</li>
	<li>将细胞刷放入锥形管中，并完全浸入BEGM培养基内。剪去多余的刷柄部分，并盖紧管盖。切勿涡旋震荡。 
	注意：若受试者愿意，可采用相同方法在另一侧鼻孔采集第二根细胞刷样本。双侧鼻孔取样将显著提高采样成功的可能性。在同一鼻孔重复取样可能导致出血，且不太可能改善样本质量。</li>
	<li>运输过程中，应尽可能将样本保持在接近37 °C的环境中，可使用盛有温水的烧杯进行保温。</li>
</ol>
2. 细胞计数与细胞离心涂片
<ol>
	<li>将刷子在 BEGM 中轻轻振荡，取 10 µl 样品，用血细胞计数板进行细胞计数。加入 10 µl 活/死染料，仅在显微镜下计数活细胞。</li>
	<li>取 50 µl 样品，用 1× PBS 稀释至 200 µl。加入连接在玻片上的细胞离心涂片装置中，以 300 rpm 离心 2 分钟。让玻片过夜干燥，然后按照制造商说明书进行染色。最好在避光条件下过夜干燥。</li>
	<li>使用 Hema 3 染色液染色玻片
	<ol>
		<li>将每种溶液（Hema 固定液，浅蓝色；Hema 3 溶液 I，粉红色；Hema 3 溶液 II，深蓝色）转移至染色缸中；不使用时保持加盖。将玻片插入玻片染色架中</li>
		<li>将玻片持续浸入固定液中 30 秒，然后让多余液体流尽。将玻片持续浸入溶液 I 中 30 秒，然后让多余液体流尽。将玻片持续浸入溶液 II 中 30 秒，然后让多余液体流尽</li>
		<li>用去离子水冲洗，直至水流清澈。最好在避光条件下过夜干燥</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下观察玻片，计数细胞，确定上皮细胞百分比。若取样良好，应达到 90% 或更高。</li>
</ol>
3. 接种细胞
注意：所有细胞培养操作均须在经过认证的无菌细胞培养罩内进行，并采用无菌技术。
<ol>
	<li>用牛皮胶原蛋白（BDC）I型包被培养板。将0.5 ml浓度为3 mg/ml的BDC加入49.5 ml 1× PBS中稀释后使用。若仅需少量培养板，可相应减少配制量。如需要，用2 ml BDC包被一个T25培养瓶，并在无菌操作台中过夜孵育，或在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸除残留液体。将培养瓶置于无菌操作台中，用紫外光照射30分钟。包被后的培养瓶可在4 °C保存最多一个月，但在接种细胞前需恢复至室温或37 °C。</li>
	<li>将刷子和细胞置于BEGM培养基中，在37 °C保存直至准备接种。轻轻晃动锥形管内的刷子，但不要涡旋震荡。
	<ol>
		<li>在T25培养瓶中接种7 × 105个细胞。若细胞数量不足，可使用较小容器，例如6孔板中的一个孔。此规格的培养容器约需3 × 105个细胞。 
		注意：若细胞数量未达到要求，不建议继续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌操作台内，将刷子从管中取出，并在包被好的培养瓶表面轻轻旋转涂抹，注意避免刮伤包被层。使用后将刷子丢弃至适当的生物危害废物容器中。</li>
	<li>用移液器缓慢将锥形管中剩余的BEGM培养基中的细胞转移至T25培养瓶中。在显微镜下观察细胞。此时可见部分悬浮细胞，以及少量来自鼻腔的碎片，此现象在此阶段属正常（图3A）。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>接种细胞后，将其静置培养48小时，期间避免扰动图348 小时后，缓慢轻柔地加入 2 ml 温热的 BEGM 和 20 µl 无菌青霉素/链霉素/两性霉素 B（P/S/F）。 
	注意：不要吸出最初的 2 ml 培养基。</li>
	<li>第4天th 接种后24小时，小心吸除所有液体，加入4 ml新鲜预热的BEGM培养基，含1x青霉素/链霉素（无需再添加两性霉素B）。每两天更换一次培养基，并观察细胞的贴壁、生长和融合情况。当细胞融合度达到约80%时，通常需要2-3周，即可进行传代。</li>
	<li>一个T25培养瓶（约2.5 × 10⁵）6 细胞长满后可传代至三个T25培养瓶或一个T75培养瓶。首次传代后，细胞应生长旺盛且状态良好，大约每三天达到一次汇合。</li>
</ol>
5. 细胞传代
<ol>
	<li>轻轻吸去培养板中的培养基。每T25培养瓶加入1 ml 0.05%胰蛋白酶溶液，放入培养箱中孵育约4分钟，或直至细胞从培养板上脱落。每2分钟检查一次细胞脱落程度，胰蛋白酶作用时间不得超过10分钟。</li>
	<li>加入5 ml胰蛋白酶中和液（TNS）或含血清的培养基以中和酶活性。将所有液体和细胞从培养瓶中转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>以200 × g（加速度0，减速度0）离心5分钟，获得细胞沉淀。吸去上清液，并将细胞重悬于所需体积的BEGM + P/S培养基中（T25培养瓶加4 ml，T75培养瓶加10 ml）。</li>
	<li>按照上述方法（2.1）使用活/死染色进行细胞计数。将适量BEGM培养基和细胞加入已包被的培养瓶中，放回培养箱继续培养。按前述方法维持培养，或以冻存液（70% BEGM、20% FBS和10% DMSO）在0.5–2 × 106 个细胞/ml的浓度下进行冷冻保存。</li>
</ol>
6. 重编程为诱导多能干细胞
注意：在生成诱导多能干细胞（iPSCs）之前，须确保遵守所有关于人类iPSCs生成与使用的机构规章制度。无菌操作技术对于iPSC培养尤为重要，因为培养基通常不含有抗生素。为了成功实现重编程，神经嵴细胞（NECs）必须呈现健康状态并具有旺盛的增殖能力。
<ol>
	<li>将每孔 5 × 105 个 NEC 接种至 6 孔组织培养板中。24 小时后，在 BEGM 中加入聚凝胺，使其终浓度为 8 µg/ml，并通过向培养基中添加表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的慢病毒颗粒来转导 NEC。目标为实现约 5 的感染复数（MOI）27。
	<ol>
		<li>为确定 MOI，对浓缩的慢病毒原液进行系列稀释，并用这些稀释液转导 HT1080 细胞。在 HT1080 细胞中首次明确检测到 dTomato 表达后，通过计数各稀释度中 dTomato 阳性细胞/小细胞团的数量，计算每毫升“转导单位”&#34;的数量&#34;。 
		注意：通常会存在过高（全部为 dTomato 阳性）或过低（无阳性细胞或仅有少数阳性细胞）的稀释度。</li>
		<li>对可识别出独立阳性细胞/小细胞团的稀释度进行计数。通过相应的稀释倍数校正每毫升转导单位数，从而确定病毒滴度。MOI 即为转导细胞数与病毒颗粒数之比27。 
		注意：每个 dTomato 阳性细胞/小细胞团被认为来源于单个病毒颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转导约 3 小时后，移除培养基并更换为新鲜 BEGM。按照机构批准的程序丢弃含慢病毒的培养基。将转导后的 NEC 放回培养箱继续培养 3 天。</li>
	<li>第 3 天，更换为新鲜 BEGM，再继续培养 3 天。吸除废弃培养基，用 1× PBS 洗涤细胞，每孔加入 1 ml 0.05% 胰蛋白酶溶液。按上述方法（第 5 节）用胰蛋白酶传代细胞。小心吸除上清液，将细胞重悬于 4 ml BEGM + P/S 中。可将细胞传代至已包被 BDC 的 6 孔板新孔中，或如准备就绪，可加入 MEF 培养物中（见下一步）。</li>
	<li>制备 MEF 包被的培养板。第 4 天，在 6 孔板的两孔中各加入 0.1% 明胶溶液（1 ml/孔）（如需进行 ± Thiazovivin (SPT) 实验，请参见步骤 6.6）。次日，解冻一管灭活的 MEF28。</li>
	<li>将 MEF 加入 10 ml MEF 培养基（DMEM + 1× NEAA + 10% dFCS）中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟以形成沉淀。用 MEF 培养基重悬细胞。吸除 6 孔板中的明胶溶液，每孔加入 1.87 × 105 个 MEF 至明胶包被的 6 孔板中。于 37 °C 过夜培养，或至少培养 24 小时。</li>
	<li>将含转导细胞的 BEGM 每孔 2 ml 转移至预先包被的 6 孔板的两孔中，过夜培养。次日，将 BEGM 更换为每孔 2.5 ml 含 4 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子的标准 hESC 培养基。每日用新鲜 hESC 培养基 ± SPT 喂养细胞，持续 10 天。 
	注意：可添加小分子化合物混合物（SB431542、PD0325901 和 Thiazovivin (SPT) 混合物）以提高 NEC 重编程的效率和速度23。</li>
	<li>十天后，继续使用不含 SPT 的 hESC 培养基每日喂养。每日更换培养基，直至出现类似 hESC 的克隆（图 5A，P0 克隆）。根据其高核质比和明显的核仁特征，识别可能含有 iPSC 的克隆。</li>
	<li>手动切除具有 hESC 样形态的克隆，并将其转移至不同的孔中，在无饲养层系统中分别培养和扩增为独立细胞系。切除的克隆应能迅速适应这些培养条件。
	<ol>
		<li>接种切除的克隆后，这些独立的潜在 iPSC 细胞系现被视为第 1 代（p1）。每日使用 mTeSR1 培养基喂养。按照标准操作进行 iPSC 细胞系的传代与扩增。p1 克隆可能需要数天至一周时间才能生长至适合传代的大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 培养中维持诱导多能干细胞
<ol>
	<li>每天喂养并评估培养物。使用无菌玻璃移液管或微量移液器吸头刮除出现明显分化的区域。每日挑取后更换培养基。</li>
	<li>大约每四天传代一次细胞：轻轻吸除培养基，每孔（6孔板）加入1 ml预热的Dispase溶液（1 mg/ml）（相当于喂养体积的一半），于37 °C孵育约4分钟。此时菌落边缘开始翘起，表现为菌落周围出现白色轮廓。轻轻吸除Dispase溶液，并用预热的DMEM/F12洗涤3次。</li>
	<li>加入2 ml mTeSR1培养基，使用细胞刮刀将菌落从培养板上刮下。用5 ml血清移液管或P1000移液器轻轻吹打细胞，直至菌落分散成较小的细胞团。
	<ol>
		<li>避免产生过小的细胞团或单细胞，因为其存活率及后续增殖能力会显著降低。重新接种菌落时，按1:4至1:6的比例传代可维持最佳的菌落密度。轻柔地将菌落和培养基从原孔中转移，并接种至新的Matrigel包被的培养孔中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鼻上皮细胞（NECs）是研究气道疾病的可及性平台，而NEC-iPSC为探索疾病的发生、治疗和疗法提供了令人振奋的途径1,31,32。NECs可通过无创或潜在伤害性较小的操作轻松获取6,23。根据我们的经验，按照本方案所述采集鼻黏膜样本对儿童而言似乎比抽血更少造成压力且更容易接受。因此，该方法可能特别适用于儿科患者群体，并与气道疾病的研究密切相关。NECs的另一优势在于，一旦进入培养阶段，通过培养基和培养条件的选择可富集上皮细胞并实现细胞群体的均一化。相比使用血液细胞等复杂组织，这种方法更具优势，也更便于利用转录组学和表观遗传学方法评估细胞来源对所获得iPSC细胞系的影响。
采集鼻黏膜样本时，必须确保采样部位正确，以获取尽可能多的上皮细胞，这一点可通过显微镜下观察细胞涂片来确认（图2）。正确的采样应获得≥90%的上皮细胞。获取健康受试者的样本至关重要，同时必须确保采样操作规范，以最大程度地提高所获得并接种的细胞数量。本方案中描述的旋转动作（第1.5节）可确保刷头尽可能广泛地接触鼻腔表面。当有异物接近面部时，...

来自人体样本的诱导多能干细胞（hiPSCs）是干细胞研究中发展迅速的技术。与胚胎干细胞（hESC）研究相比，该技术具有更少的伦理和道德争议1,2。尽管在表观遗传学上与hESCs并不完全相同3-5，hiPSCs仍为研究发育过程和疾病表型提供了独特途径，并且可从与疾病状态相关的组织中获得5-8。目前正不断探索生成hiPSCs的新方法，以确定最适起始细胞类型，推动制备适用于移植的符合药品生产质量管理规范（GMP）质量的iPSCs，并进一步提高重编程过程的时效性和效率6,9-11。
气道上皮细胞在过敏性炎症的发生中起着关键作用12，上皮组织通过与免疫细胞和基质细胞的相互作用，是过敏反应和气道重塑的主要驱动因素。气道上皮在哮喘等肺部疾病的发生和持续过程中发挥着至关重要的作用。然而，在临床环境中获取下气道上皮细胞较为困难，尤其是来自健康对照者和儿童的样本。多项研究的数据支持鼻黏膜上皮细胞可作为下气道上皮细胞有效且实用的替代模型13-20，特别是在研究对空气污染物和过敏原的反应时。鼻黏膜中超过90%为纤毛气道上皮细胞，采集鼻上皮细胞（NECs）的操作可轻松应用于四至五岁以上的儿童，因其侵入性远低于其他细胞/组织取样技术，且发生感染等不良事件的风险极低20-23。该方法为健康和患病儿童提供了一种快速、简便的取样途径，避免了耗时、不必要且常伴有疼痛的支气管镜检查，后者通常需要镇静。先前的研究发现，哮喘严重程度相关的疾病亚型在哮喘患儿的鼻黏膜和支气管细胞样本中均可被区分，且两种组织类型在约90%的非泛在基因中基因表达相似22,24。作为诱导多能干细胞（iPSCs）的来源，鼻上皮细胞相较于其他常用细胞类型具有优势。成纤维细胞常用于iPSC的生成，尽管这些细胞可通过皮肤活检轻松培养，但该过程通常需要局部麻醉、切口和缝合，且存在一定的感染风险。因此，患者对此类活检的知情同意较难获得25。成纤维细胞的一种替代来源是外周血单个核细胞（PBMCs），但儿科患者可能难以提供足够量的血液用于iPSC生成。此外，成纤维细胞和血细胞来源的iPSC在下游应用方面存在局限性，尤其是向某些特定细胞类型的分化能力5,26。因此，鉴于其相对易于获取且采集后不良反应风险低，鼻上皮细胞是儿科人群中iPSC生成的理想细胞来源。
近年来，诱导多能干细胞（iPSCs）作为一种研究人类发育、建立新型疾病模型以及作为个性化治疗潜在细胞来源的平台，受到了广泛关注。在充分实现该技术潜力之前，必须阐明重编程过程的分子基础。但目前，本方案及其所述程序将阐明聚焦于气道暴露的研究，并为涉及iPSCs的个性化医学效应研究提供一个平台。
多个实验室的协作工作已成功开发出一种技术，不仅可用于采集鼻黏膜样本，还可用于培养鼻上皮细胞（NECs），并将这些细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）23。本文概述了一种优化的采样、培养和重编程操作方案。

<table><tbody><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>实验步骤 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM 培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>实验步骤 1.1.</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/抗真菌剂（Penn/Strep/Fungicide）</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>实验步骤 1.1.</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Penn/Strep）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>实验步骤 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft 细胞刷</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>实验步骤 1.2.</td></tr><tr><td>台盼蓝（trypan blue）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>实验步骤 2.1.</td></tr><tr><td>血细胞计数板（hemacytometer）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>实验步骤 2.1.</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>细胞学漏斗夹（Cytology Funnel Clips）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>细胞离心涂片漏斗（cytospin funnel）</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4 细胞离心涂片仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>空白载玻片（blank slide）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 染色试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>实验步骤 2.2.</td></tr><tr><td>牛皮 I 型胶原蛋白（Bovine Dermal Collagen, type 1）</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>实验步骤 3.2.</td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>实验步骤 3.3.</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>实验步骤 5.2.</td></tr><tr><td>胰蛋白酶中和液（Trypsin Neutralizing Solution）</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>实验步骤 5.2.</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），65 &amp;deg;C 热灭菌 30 分钟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>实验步骤 5.5.</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 Hybri-Max&amp;trade;，无菌过滤，BioReagent 级，适用于杂交瘤，&amp;ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>实验步骤 5.5.</td></tr><tr><td>多顺反子慢病毒（polycistronic lentivirus）*</td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Millipore</td><td>SCR511</td><td>实验步骤 6.4.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 此处列出了一种商业来源的重编程载体。我们常规使用 Voelkel 等人（PMID: 20385817）报道的 4-in-1 质粒，在实验室内部制备 VSV-G 假型多顺反子重编程慢病毒。该质粒可通过联系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚凝胺（polybrene）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>实验步骤 6.4.</td></tr><tr><td>经照射处理的 CF1 小鼠胚胎成纤维细胞（Irradiated CF1 MEFs）</td><td>GlobalStem&amp;nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>实验步骤 6.4.</td></tr><tr><td>人胚胎干细胞培养基（hESC media）</td><td>参见本方案中提供的配方</td><td></td><td>实验步骤 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>实验步骤 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>实验步骤 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&amp;nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>实验步骤 6.11.</td></tr><tr><td>适用于人胚胎干细胞的 Matrigel（hESC-qualified Matrigel）</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>实验步骤 6.13.</td></tr><tr><td>Corning 6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>实验步骤 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1 培养基</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>实验步骤 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml 一次性滤瓶（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分散酶（dispase）</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>实验步骤 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>实验步骤 7.3.</td></tr><tr><td>细胞刮刀（cell lifter）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>实验步骤 7.4.</td></tr><tr><td>人胚胎干细胞培养基（hESC Media）**</td><td></td><td></td><td>实验步骤 6.11.&lt;br/&gt; 各组分应混合后过滤除菌。培养基可在 4 &amp;deg;C 保存最多两周。温浴时，避免在 37 &amp;deg;C 超过 15 分钟</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;11330-032</td><td>终浓度</td></tr><tr><td>敲除血清替代物（KO replacement serum, KO-SR）</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100 倍非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1 倍</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;g/ml 碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

鼻上皮细胞（NECs）是呼吸道的一部分，可对空气污染物产生反应，并且是呼吸病毒最先感染的细胞。它们还通过先天免疫反应以及与免疫细胞和呼吸道基质细胞的相互作用，参与多种呼吸道疾病的发生发展。由于在临床就诊期间易于获取，鼻上皮细胞在儿童相关研究中具有特殊价值。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）可由多种细胞类型产生，是研究人类发育与疾病建模的有力工具，也具有再生医学应用的潜力。本方案是首个针对从儿童参与者来源的鼻上皮细胞成功生成iPSCs的研究性操作流程。该方案详细描述了如何从儿童获取鼻上皮细胞，如何从这些样本建立原代NEC培养，以及如何将原代NECs重编程为特征明确的iPSCs。鼻黏膜样本在与儿童空气污染暴露相关的流行病学研究中具有重要用途，也为研究呼吸道疾病提供了关键工具。来源于此类样本的原代鼻上皮细胞及其诱导生成的iPSCs，可为哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸道上皮生物学多个领域的患者特异性研究提供无限的材料来源。

鼻腔的起始部分称为鼻前庭，该区域由软骨包围29。采样刷需顺利通过鼻前庭，越过鼻瓣（内孔，或称鼻孔后方所见的“黑孔”），在下鼻甲处采集样本（图1）。鼻甲为骨性结构，可增加鼻腔表面积29，因此是理想的采样部位。该区域还覆有富含血管的黏膜组织，其结构与下呼吸道黏膜相似，并在应对环境暴露的免疫反应中具有活性。
正确取样组织可确保被重编程的细胞为上皮细胞。可通过初始细胞计数和细胞离心涂片法进行评估，也可通过观察培养中的细胞来判断。细胞离心涂片制备后经离心、干燥和染色，可显示样本的细胞组成。大多数样本由柱状且带有纤毛的上皮细胞构成，细胞具有一个圆形细胞核。使用Hema 3染色试剂盒染色后，细胞质呈浅蓝色，细胞核呈较深的紫色（图2）；当细胞直接从鼻腔获取时，常可见其成团聚集。尽管鼻腔细胞样本最初包含多种细胞类型以及鼻腔碎片，但随着培养时间的延长和培养基的更...

本出版物展示了从儿童鼻腔上皮黏膜成功采样和培养的方法，并将这些细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。

鼻腔上皮细胞（NECs）是呼吸道中响应空气污染物的部分，也是呼吸道病毒最先感染的细胞。

本实验的总体目标是培养从儿童获取的鼻腔上皮细胞，并将其重编程为诱导性多能干细胞。该方法有助于回答呼吸系统疾病领域中的关键问题，例如哮喘的发生机制。该技术的主要优势在于，无需采用令儿童不适的操作即可收集呼吸道上皮细胞。在培养过程中，这些细胞属于同质性群体，是生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的优良来源。当我们与Ji博士和Hershey博士讨论他们关于从儿童中采集间质-上皮细胞以研究哮喘和空气污染中表观遗传变异的研究时，我们首次提出了本研究的设想。这些技术的可视化演示至关重要，因为鼻腔采样以及鼻腔上皮细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）是难以掌握的技术，其学习主要依赖于个人经验，而非既定的实验方案。在受试者到达之前，将 2 毫升新鲜的支气管上皮细胞生长培养基（简称 BEGM）转移至一个 15 毫升的锥形管中。随后，向该培养基中加入 20 微升的青霉素、链霉素和两性霉素 B 混合液，使其终浓度为 0.01%。当受试者到达后，引导其就座于椅子上。然后在采集样本前立即打开细胞刷，不要让其接触任何表面，以确保无菌。接着指导受试者保持静止坐姿，并将头部向上仰起，朝向天花板。如果受试者躁动不安，可让他们坐在自己的手上，以防试图挥开刷子。接下来，将刷子对准鼻腔后部通道变窄的位置进行插入。随后，通过手腕的旋转动作将刷子从鼻孔中向下滑动取出。然后将刷子放入先前准备好的锥形管中，并确保其完全浸没于BEGM中。然后剪去刷子的多余部分，并将管盖拧紧。样本采集后，立即放入盛有温水的烧杯中，使其温度尽可能保持在37摄氏度左右，随后尽快运送至实验室。进入实验室后，将刷子在BEGM中轻轻振荡。随后，取10微升样本，加入10微升活/死细胞染色剂。接着将此混合液加入血细胞计数板中。 在显微镜下仅计数活细胞。细胞计数后，取50微升样品，用1×PBS稀释至200微升。将剩余未稀释的细胞混合液连同刷子一起转移至设定为37摄氏度的恒温水浴中，直至进行细胞接种。将 PBS 稀释的样本加入已固定在载玻片上的细胞离心涂片仪漏斗中。以 400 rpm 转速离心两分钟。随后取下漏斗，将载玻片置于避光环境中过夜干燥。按照文中实验方案所述，用 Hema 3 对载玻片染色后，在显微镜下观察并计数细胞。根据其独特形态特征鉴定上皮细胞：柱状形态、纤毛以及一个圆形细胞核，并确定此类细胞在样本中的百分比。开始接种时，在经认证的组织培养罩内，轻轻将刷子在锥形管中 swirl 混匀，然后将其从管中取出。随后，将刷子在预先包被了牛皮胶原蛋白的 T25 培养瓶内表面轻轻旋转涂抹，注意避免刮伤包被层。之后，将刷子丢弃至适当的生物危害废物容器中。将锥形瓶中剩余的细胞用BEGM缓慢吹打混匀后转移至T25培养瓶中，细胞数量至少为7 × 10⁵个。随后在倒置显微镜下观察细胞状态。按照文中所述进行细胞培养与传代后，将5 × 10⁵个鼻上皮细胞接种于6孔组织培养板的每个孔中，每孔加入2 mL BEGM培养基。然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下将细胞培养24小时。培养结束后，确保细胞处于旺盛增殖状态。随后在通风橱内向每孔含BEGM的培养基中加入Polybrene，使其终浓度为8微克/毫升。按照文本方案中所述，通过向每孔培养基中添加表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的慢病毒颗粒，对鼻上皮细胞进行转导。将转导后的细胞孵育约三小时后，移除含病毒的培养基，并按照机构批准的程序丢弃。随后用 BEGM 替换该培养基，将转导后的鼻上皮细胞放回培养箱中继续培养。三天后，将培养基更换为新鲜的 BEGM，然后在相同条件下继续培养转导的细胞。次日，向六孔板中的两个孔加入 0.1% 明胶溶液，以开始制备小鼠胚胎成纤维细胞包被的培养板。然后用相应的盖子盖好培养板，并在 37 摄氏度下过夜培养。第五天时，解冻一支含有约 5 × 10⁵ 个灭活小鼠胚胎成纤维细胞（简称 MEFs）的小瓶，随后将这些细胞放入 10 毫升 MEF 培养基中。以200 × g离心5分钟。随后吸除上清液，并将MEFs重悬于相同的培养基中。待细胞计数完成后，吸除预先准备的六孔板中的明胶溶液。接着，将 1.87 × 10⁵ 个 MEFs 加入到每孔已包被明胶的培养板中，于 37°C 培养至少 24 小时。然后在转导后培养的第 6 天，吸除转导细胞的旧培养基，并用 1× PBS 洗涤细胞。随后，向培养板的每孔中加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶溶液。细胞脱离后，用胰蛋白酶中和液或TNS进行中和，然后按照前述方法收集并离心细胞。离心后吸除上清液，将细胞重悬于4 mL添加了青霉素和链霉素的BEGM培养基中。随后将2 mL该细胞悬液分别加入预先制备好的、经明胶和MEF包被的培养板的各个孔中。细胞孵育过夜后，将支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）替换为2.5毫升含4纳克/毫升基础成纤维细胞生长因子的标准人胚胎干细胞（hESC）培养基。继续培养细胞，并每天用新鲜的hESC培养基进行换液，直至在培养物中观察到具有拟似诱导性多能干细胞（iPSCs）的hESC样克隆。手动挑取这些克隆，并将其转移至24孔板的不同孔中，以便在无饲养层系统中作为独立细胞系进行培养和扩增。最初，鼻腔样本由多种细胞类型和碎片混合而成。然而，在经过培养和换液后，上皮细胞在这些样本中逐渐占据主导地位，如本图所示为细胞传代后一天拍摄的图像。图中上皮细胞已生长至融合状态，显示出较大的细胞核和伸展的细胞质。由于本研究中使用的慢病毒颗粒的特性，当鼻上皮细胞被转导后，它们会表达 tdTomato 荧光标记物，如转导后四天的细胞（右上图）所示。与相应的明场图像相比，合并图像（底部）显示并非每个细胞都表现出 tdTomato 信号，因此并非每个细胞都被成功转导。然而，转导效率约为90%。当转导后的鼻上皮细胞按照本方案所述进行培养时，可形成iPSC集落。在收获iPSC集落并置于标准无饲养层条件下培养后，这些集落中的单个细胞表现出典型的类似hESC的形态特征，例如圆形、细胞核大以及核质比高，如本放大图像所示。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一个半小时内完成。进行该操作时，需注意正确采集样本，将细胞保持在37摄氏度，并尽快以正确的密度接种。完成该操作后，可进一步采用其他方法，例如利用原代鼻上皮细胞建立气液界面模型，以探究我们呼吸的空气如何对过敏原和病原体产生反应等问题。该技术建立后，为研究人员模拟哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）和囊性纤维化等疾病提供了重要途径。该技术还有助于在体外人类系统中研究环境因素对肺部发育的影响。观看本视频后，您应能够清楚地了解如何从儿童鼻腔上皮细胞中培养细胞，并由此类细胞群体生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。由于我们涉及人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的操作，务必始终遵守所在机构及国家的相关指导原则。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从培养儿童原发性鼻腔上皮细胞和重新编程为诱导多能干细胞

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本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。...

原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

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由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

学习从儿童鼻腔无创采集上皮细胞并进行培养，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）的技术。该方法为哮喘等呼吸道疾病研究提供可靠的细胞来源，有助于深入理解疾病机制并开发新治疗策略。

从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞

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