从培养儿童原发性鼻腔上皮细胞和重新编程为诱导多能干细胞

该程序的总体目标是培养从儿童获得的鼻上皮细胞，并将其重编程为诱导多能干细胞。这种方法可以帮助回答充气疾病领域的关键问题，例如哮喘是如何发展的。这种技术的主要优点是它可以收集儿童的气道上皮细胞，而无需进行压力手术。

在培养中，这些细胞处于同质群体中，是产生诱导多能干细胞或 iPSC 的极好来源。当我们与 Ji 博士和 Hershey 博士谈论他们的研究时，我们第一次有了这项研究的想法，该研究旨在收集儿童的中上皮细胞以研究哮喘和空气污染的表观遗传变异。

这些技术的视觉演示至关重要，因为鼻腔采样和鼻上皮细胞 iPSC 重编程是很难学习的技术，因为它们基于个人经验，而不是既定方案。在参与者访问之前，将两毫升新鲜支气管上皮生长培养基（缩写为 BEGM）转移到 15 毫升锥形管中。然后，向该培养基中加入 20 微升青霉素、链霉素和两性霉素 b 的混合物至终浓度为 0.01%当参与者到达时，引导他们坐在椅子上坐下。

然后在取样前立即打开细胞学刷，不要将其接触任何表面，以确保其保持无菌状态。继续指示参与者坐着不动，并将他们的头向上倾斜到天花板上。如果他们焦躁不安，让它们坐在自己的手上，这样它们就不会试图把刷子拍走。

接下来，将刷子对准并插入鼻腔后部通道变窄的地方。然后，用手腕的扭动动作将刷子向下滑动，将其从鼻孔中取出。继续将刷子放入先前准备好的锥形管中，并确保将其浸没在 BEGM 中。

然后剪掉刷子的多余部分，并将盖子固定在管子上。收集样品后，立即将其放入装满温水的烧杯中，使其尽可能保持在 37 摄氏度左右。然后将其运送到实验室。

进入实验室后，在 BEGM 中轻轻搅动刷子。接下来，去除 10 μL 样品，然后加入 10 μL 活/死细胞染色剂。继续将此混合物引入血细胞计数器。

并且只在显微镜下计数活细胞。细胞计数后，取 50 μL 样品，然后用 1X PBS 将其稀释至 200 μL。将剩余的未稀释细胞混合物连同刷子一起转移到受调节的 37 摄氏度水浴中，直到细胞接种。

继续将 PBS 稀释的样品添加到连接到载玻片上的 Cytospin 漏斗中。并以 400 rpm 的速度旋转整个 aparatus 两分钟。然后，取下漏斗，让载玻片在黑暗中干燥一夜。

如文本方案中所述，用 Hema 3 对载玻片进行染色后，在显微镜下观察并计数细胞。通过上皮细胞的独特特征识别上皮细胞。柱状、纤毛和一个圆形细胞核，并确定这些细胞在制剂中的百分比。

要开始播种，请在经过认证的组织培养罩内轻轻旋转锥形体内的刷子，然后将其从试管中取出。然后，轻轻旋转 T25 培养瓶内表面的刷子，之前涂有牛真皮胶原蛋白，注意不要划伤涂层。然后将刷子丢弃在适当的生物危害容器中。

将 BEGM 中剩余的细胞从锥形瓶中缓慢移液到 T25 培养瓶中，至少移液 7 乘以 10 至第五个细胞。继续在倒置显微镜下观察细胞。如文所述，在培养和传代细胞后，继续将 5 乘以 10 至第五个鼻上皮细胞放入 6 孔组织培养板的每孔 2 毫升 BEGM 中。

然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 24 小时。孵育后，确保细胞稳健增殖。然后在通风橱下向每个含 BEGM 的孔中加入聚凝胺，使终浓度为 8 μg/mL。

通过添加慢病毒颗粒继续转导鼻上皮细胞，在每个孔中向培养基中表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc，如文本方案中所述。将转导的细胞孵育约 3 小时后，使用机构批准的程序去除含病毒的培养基并丢弃。然后用 BEGM 替换该培养基，并将转导的鼻上皮细胞放回培养箱中。

三天后，用新鲜的 BEGM 替换培养基。然后在相同条件下孵育转导的细胞。第二天，将 0.1% 明胶溶液加入六孔板的两个孔中，以开始制备小鼠胚胎成纤维细胞包被板。

然后用相应的盖子盖住板，并在 37 摄氏度下孵育过夜。在第 5 天继续，解冻含有大约 5 乘以 10 至第五个灭活小鼠胚胎成纤维细胞（缩写为 MEF）的小瓶。然后将这些细胞放入 10 mL MEF 培养基中。

然后继续以 200 x g 的速度旋转它们 5 分钟。然后，吸出上清液并将 MEF 重悬于同一培养基中。计数这些细胞后，从先前制备的六孔板中吸出明胶溶液。

接下来，将 1.87 倍 10 至第五个 MEF 添加到板的每个明胶包被孔中，并在 37 摄氏度下孵育至少 24 小时。然后在培养的第 6 天，从转导的细胞中吸出用过的培养基，并在 1X PBS 中洗涤。接下来，向板的每个孔中加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶溶液。

细胞分离后，继续用胰蛋白酶中和溶液或 TNS 中和，然后如前所述收集和离心细胞。离心后，吸出上清液，并将细胞重悬于 4 毫升补充有青霉素和链霉素的 BEGM 中。继续将两毫升这种细胞悬液引入先前制备的板的每个明胶和 MEF 包被的孔中。

将细胞孵育过夜后，用 2.5 毫升标准人胚胎干细胞（缩写为 hESC）替换 BEGM，培养基，每毫升含有 4 纳克碱性成纤维细胞生长因子。继续培养细胞并每天用新鲜的 hESC 培养基喂养它们，直到在培养物中观察到 hESC 样集落，其中含有假定的诱导多能干细胞或 iPSC。手动切除这些集落，并将这些集落转移到 24 孔板的单独孔中，以便在无饲养层系统中作为单独的细胞系进行培养和扩增。

最初，鼻腔样本是细胞类型和碎片的混合物。然而，随着培养物和培养基的变化，上皮细胞在这些制剂中变得占主导地位，如图所示，在细胞传代后一天拍摄。在这里，上皮细胞生长至汇合，表现出大细胞核和拉伸的细胞质。

由于本研究中使用的慢病毒颗粒的特性，当这种鼻上皮细胞被转导时，它们会在转导后 4 天表达 tdTomato 荧光标记，如细胞右上图所示。与相应的明场图片进行比较后发现，并非每个细胞都表现出 tdTomato 信号，如底部的合并图像所示。因此，并非每个细胞都被转导。

然而，转导效率约为 90%当按照方案中的说明培养转导的鼻上皮细胞时，它们会产生 iPSC 集落。在 iPSC 集落收获并在标准无饲养层条件下培养后，此类集落中的单个细胞表现出典型的 hESC 样形态，例如圆形、大细胞核和高细胞核与细胞质比率，如该放大图像所示。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一个半小时内完成。

尝试此程序时，请务必记住正确取样，将细胞保持在 37 摄氏度，并尽快以正确的密度接种。在此程序之后，可以执行其他方法，例如使用原代鼻上皮细胞建立气液界面，以回答其他问题，例如我们空气如何响应过敏原和病原体。开发后，这项技术为研究人员对哮喘、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化等疾病进行建模铺平了道路。

该技术还有助于研究环境对体外人体系统中肺发育的影响。看完这个视频后，您应该对如何从儿童培养鼻上皮细胞并从该群体中产生 iPSC 有一个很好的了解。由于我们使用的是人胚胎干细胞和诱导多能干细胞，因此请记住始终遵守机构和国家指南。