Name: 一个神经元蛋白在神经元使用遗传编码的非天然氨基酸的光控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解如何利用遗传编码非天然氨基酸在海马神经元中实现神经元蛋白的光控功能。该方法为神经信号传导和脑功能研究提供高时空分辨率的实验手段。

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我们感谢 S. Szobota 博士在神经元培养和磷酸钙转染方面的有益讨论。L.W. 感谢索尔克创新基金、加州再生医学研究所（RN1-00577-1）和美国国立卫生研究院（1DP2OD004744）提供的支持。

本研究中的所有操作均按照加州拉霍亚索尔克生物研究所动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物操作方案进行。
1. 在 Kir2.1 中引入非天然氨基酸及在原代神经元培养物中表达相应的 PIRK
<ol>
	<li>DNA构建
	<ol>
		<li>选择Kir2.1上用于非天然氨基酸（Uaa）插入的靶位点。利用Kir2.1结构与功能的已有知识，确保所选位点在插入光响应性Uaa后能够实现对Kir2.1功能的光学调控21.</li>
		<li>构建编码 Kir2.1 基因的重组 DNA，将选定的位点突变为 TAG 琥珀终止密码子。采用标准克隆技术。25 将Kir2.1-TAG DNA克隆至哺乳动物表达质粒中。</li>
		<li>克隆对非天然氨基酸（Uaa）特异的tRNA/合成酶基因，并将该Uaa通过响应TAG终止密码子的方式整合到另一哺乳动物表达质粒中21. 
		注意：为了实现最优的非天然氨基酸（Uaa）插入效果，可在不同的质粒中测试不同的启动子以及基因表达盒（用于tRNA、合成酶和Kir2.1）的组合。</li>
		<li>使用质粒小提或大提商业试剂盒，按照制造商提供的操作步骤提取高质量质粒DNA。纯化后的DNA，其260/280比值约为1.9时最佳。必要时，可通过琼脂糖凝胶电泳检测所提质粒DNA的纯度。25高纯度的超螺旋质粒DNA最适合用于神经元转染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养大鼠海马原代神经元
	<ol>
		<li>将玻璃盖玻片（圆形，直径12 mm）放入24孔板中，每孔放置一片盖玻片，每孔加入250 µl 0.5 mg/ml 多聚-D-赖氨酸（溶于100 mM 硼酸盐缓冲液：400 ml 去离子蒸馏水中含1.24 g 硼酸和1.90 g 四硼酸钠）进行包被2O型或ddH₂O2在室温下密封孵育超过10小时（pH 8.5的O），每只幼鼠准备约10–12个包被的盖玻片。</li>
		<li>在解剖当天，使用异氟烷麻醉新生大鼠幼崽（出生后1-4天）后，断头取脑。将幼崽置于含有异氟烷（2-4%）的麻醉舱中进行麻醉，待其失去意识且对触觉刺激及足部夹捏无反应时开始操作。</li>
		<li>使用标准技术26在温热（约 37 °C）的生理盐水中解剖分离脑中的海马组织（生理盐水为 Hank's 平衡盐溶液，添加 10 mM HEPES 和 20 mM D-葡萄糖），并将分离的海马组织收集至含有 4.5 ml 温热生理盐水的锥形管中。</li>
		<li>向海马体中加入500 µl 2.5%胰蛋白酶（终浓度为0.25%），于37 °C水浴中孵育10分钟。</li>
		<li>用生理盐水（3 × 10 ml）彻底冲洗组织并进行吹打。</li>
		<li>用含有最低必需培养基（MEM）、5% 胎牛血清（FBS）、21.2 mM D-葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、2% B-27 和 0.1% 血清扩展剂的 1 ml 温热生长培养基重悬解离的神经元。 
		注意：在解剖当天加入 L-谷氨酰胺和 B-27，以配制新鲜的生长培养基。</li>
		<li>使用血细胞计数板对神经元进行计数，并将细胞以每孔1.0–1.5 × 10⁵个的密度接种于24孔板中的盖玻片上5 经40 µm尼龙滤网过滤后，每孔加入500 µl培养基调节细胞密度。</li>
		<li>将神经元培养物在 35 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育2：在95%空气加湿培养箱中培养2-3周。为获得最佳结果，培养期间应尽量避免扰动培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代神经元培养的磷酸钙（Ca-P）转染
	<ol>
		<li>配制贮存液并于 4 °C 保存：0.5 M BES (N,N-bis[2-羟乙基]-2-氨基乙烷磺酸)缓冲液（10倍浓度）；150 mM Na2HPO4 (100倍浓度)；2.8 M NaCl（10倍浓度）；无菌ddH₂O2O；无菌 1 N NaOH。</li>
		<li>转染当天，配制新鲜的 2.5 M CaCl₂2 ddH₂O 中的溶液2O 和 0.22 µm 滤膜进行无菌过滤。配制新鲜的 2× BES 缓冲盐溶液（BBS），其中含 50 mM BES、1.5 mM Na2HPO4，以及 pH 7.00 的 280 mM NaCl（用 NaOH 调节 pH），经 0.22 µm 滤膜无菌过滤。 
		注意：计算所需 CaCl₂ 的量2 根据需要转染的盖玻片数量，准备相应体积的溶液和BBS缓冲液。同时参见1.3.4。</li>
		<li>更换培养基，加入500 µl新鲜预热的转染培养基。 （转染培养基可用添加21.2 mM D-葡萄糖的MEM配制）。 
		注意：不要丢弃旧的培养基。</li>
		<li>计算 ddH₂O 的用量2O，并准备按顺序加入以配制转染溶液（每张盖玻片33 µl），其中含有1.65 µl CaCl20.7 µg DNA 和 16.5 µl 2x BBS</li>
		<li>在将转染液加入培养物之前立即配制。配制时，先将 CaCl₂ 与 2× HBS 按顺序混合。2 和 ddH₂O2O时轻轻振荡试管。持续振荡并缓慢将DNA加入溶液中。最后，在振荡的同时逐滴加入2x BBS缓冲液。</li>
		<li>立即向每张神经元培养的盖玻片中加入 30 µl 转染溶液。</li>
		<li>轻轻晃动培养皿数次以混匀溶液，随后在35 °C、5% CO₂条件下孵育。2：在含95%空气的加湿培养箱中孵育45分钟至1小时。神经元与转染液共孵育后，极细的Ca-P沉淀会形成一层覆盖在神经元表面。</li>
		<li>将转染培养基替换为500 µl预热的洗涤缓冲液（135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂）2，1 mM MgCl2，1 mM Na2HPO4，pH 7.3 的 10 mM 葡萄糖溶液，经 0.22 µm 滤膜无菌过滤）并在 35 °C、5% CO₂ 条件下孵育2：在含95%空气的加湿培养箱中孵育15–20分钟。洗涤步骤后，磷酸钙沉淀物将消失。</li>
		<li>更换为 500 µl 新鲜培养基。再次将培养基更换为之前保存的原始培养基。</li>
		<li>将Uaa Cmn（预先混合在50 µl温热的生长培养基中）加入培养物中，使终浓度达到1 mM。</li>
		<li>将转染后的培养物于35 °C、5% CO₂条件下孵育2：在进行检测前，于含95%空气的加湿培养箱中培养12-48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞记录结合光激活
	<ol>
		<li>配制细胞外/细胞内溶液。细胞内溶液包含 135 mM 葡萄糖酸钾、10 mM NaCl、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA，用 KOH 调节 pH 至 7.2，用蔗糖调节渗透压至 290 mOsm。细胞外溶液包含 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，用蔗糖调节渗透压至 300 mOsm。2，10 mM HEPES，1 mM EGTA，2.56 mM K2ATP 和 0.3 mM Li2pH 7.4 的 GTP。细胞外记录液含有 150 mM NaCl、3 mM KCl、5 mM MgCl2，0.5 mM CaCl2，5 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，pH 7.4。</li>
		<li>设置全细胞膜片钳电生理实验装置：配备4倍和20倍物镜、微分干涉差（DIC）显微镜及mCitrine滤光片（激发光：495/10 nm，发射光：525/25 nm）；显微操作器；膜片钳放大器；数据采集卡；数据采集与分析软件。
		<ol>
			<li>在显微镜装置上安装一个发射波长为385 nm的发光二极管（LED），从距离焦点1 cm处以45°角照射光线。使用光功率计检测LED的输出功率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用商用微量移液器拉制仪从玻璃电极拉制膜片钳移液管，使其电阻为3-6 MΩ。按照制造商的说明设置微量移液器拉制仪。
		<ol>
			<li>测试移液管电阻时，先用细胞内液填充移液管，并将其安装至电极夹持器上。将移液管浸入盛有细胞外液的35 mm培养皿中，培养皿置于显微镜载物台上。将接地电极浸入培养皿中以形成电路。</li>
			<li>打开放大器/数模转换器并启动数据采集软件。使用膜片钳测试程序监测电极电阻。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从培养箱中取出神经元培养的盖玻片，用细胞外液冲洗一次。使用真空脂将盖玻片固定在盛有新鲜细胞外液的35 mm培养皿中央。</li>
		<li>将盖玻片/培养皿置于电生理显微镜载物台上。</li>
		<li>使用标准膜片钳技术，对表达mCitrine荧光的神经元进行膜片钳记录27使用电流钳（I-clamp）方法记录神经元活动。首先，通过注入微小电流将静息电位调节至约 -72 mV。随后，注入阶跃电流（10–200 pA）以诱导动作电位的持续发放（5–15 Hz）。</li>
		<li>手动或使用数据采集软件，发射一个脉冲（单个持续时间为100毫秒的脉冲）-1 在记录神经元活动的同时，给予LED光照（持续一定时间），观察动作电位是否受到影响。</li>
		<li>加入 0.5 mM BaCl2 加入灌流液并验证动作电位是否恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kir2.1 中非天然氨基酸的引入及在小鼠胚胎脑中表达相应的 PIRK 体内
<ol>
	<li>DNA构建
	<ol>
		<li>参照第1.1步的方法设计质粒DNA。对于 体内 表达时，使用强启动子，例如 CAG（带有 CMV 增强子的鸡β-actin启动子）。</li>
		<li>使用无内毒素大提商业试剂盒，按照生产商说明书纯化DNA。进行苯酚-氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀25 以获得极高纯度的DNA（浓缩至2-5 µg/µl）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫内 小鼠胚胎新皮质的电穿孔技术 
	注意：基本技术方法为 在子宫内 电穿孔技术此前已有描述28.
	<ol>
		<li>在胚胎发育第14.5天（E14.5）使用戊巴比妥钠（腹腔注射，每克体重50 µg）或异氟烷（吸入，2-4%）对配准妊娠小鼠进行麻醉。通过检测意识丧失以及对触觉刺激和足部夹捏无反应来监测麻醉深度。</li>
		<li>在腹部正中线做一小切口。用镊子和手指轻轻暴露子宫角。</li>
		<li>使用玻璃移液管经子宫壁插入，向每只同窝胚胎的侧脑室注射约 1 µl DNA 溶液（每种质粒 2-5 µg/µl，根据构建体而定）。大多数情况下，总胚胎数的约 60-80% 被成功注射。</li>
		<li>使用电穿孔仪对胚胎进行电穿孔（33–35 V，持续时间50毫秒，间隔950毫秒，4–8次脉冲）。</li>
		<li>用镊子和手指轻轻将子宫角放回腹腔。用外科缝线缝合肌层，然后缝合皮肤，以使胚胎继续发育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非天然氨基酸显微注射
	<ol>
		<li>在E16.5时再次于腹部正中线做一小切口，用镊子和手指轻轻暴露子宫角。</li>
		<li>通过子宫壁插入玻璃移液管，向侧脑室电穿孔侧或双侧注射约 2-5 µl 的 Cmn-Ala（500 mM）。为提高 Cmn 的生物利用度，可使用二肽 Cmn-Ala（Cmn-丙氨酸）递送 Cmn 体内21.</li>
		<li>再次用镊子和手指轻轻将子宫角放回腹腔。用手术缝线缝合肌肉层，然后缝合皮肤，以使胚胎继续发育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取急性脑切片
	<ol>
		<li>配制1 L人工脑脊液（ACSF），其中含有119 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.3 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、1.0 mM NaH₂PO₄、26.2 mM NaHCO₃和11 mM葡萄糖2，2.5 mM CaCl2，1 mM NaH2PO4，26.2 mM NaHCO₃3，以及 pH 7.3 条件下的 11 mM 葡萄糖。</li>
		<li>取200 ml ACSF，在-80 °C下快速冷冻20-30分钟。将剩余的ACSF用5% CO₂持续通气2：95% O₂2 室温下的气体</li>
		<li>准备并灭菌手术器械，用于从胚胎中取出脑组织。同时准备一桶冰。</li>
		<li>在烧瓶中，用微波炉加热制备约 100 ml 的 4% 低熔点琼脂糖溶液。加热后冷却约 5 分钟，直至溶液开始凝固前使用。</li>
		<li>在Cmn-Ala注射后12-24小时，通过CO处死小鼠2 过量麻醉后，在腹部区域做大切口，用精细剪刀和镊子从子宫中分离出经过电穿孔或显微注射的胚胎。</li>
		<li>使用精细剪刀和镊子从胚胎中取出脑组织。</li>
		<li>将每个脑组织置于冰桶上的10 cm培养皿中。使用锋利刀片将脑分为两个半球，并将每个半球放置在培养皿中，使正中矢状面紧贴培养皿底部。迅速将琼脂糖溶液倒在脑组织上（每半球约500 µl）。</li>
		<li>使用锋利的刀片将琼脂糖在脑组织周围进行方形切割，制备包含脑组织的琼脂糖块。</li>
		<li>使用组织粘合剂将琼脂糖块的正中矢状面粘附在振动切片机的载物台上。向振动切片机的样品腔内加入预冷的ACSF，切出200 µm厚的矢状脑片。</li>
		<li>将急性脑片孵育在添加了 3 mM 的 ACSF 中 myo-肌醇，0.4 mM 抗坏血酸，2 mM 丙酮酸钠，于 33 °C 条件下孵育 42 分钟，同时通入 5% CO295% O2 气体</li>
		<li>42分钟后关闭加热器，继续在室温下通气孵育脑片。关闭加热器至少15分钟后开始全细胞膜片钳记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全细胞记录结合光激活
	<ol>
		<li>配制含有 130 mM 葡萄糖酸钾、4 mM MgCl₂ 的细胞内溶液2，5 mM HEPES，1.1 mM EGTA，3.4 mM Na2ATP、10 mM 磷酸肌酸钠和 0.1 mM Na3用KOH调节pH至7.3的GTP溶液。</li>
		<li>使用商用微量移液器拉制仪从玻璃电极拉制出膜片钳移液管，使其电阻为 3–6 MΩ。</li>
		<li>设置脑片电生理记录装置用于全细胞膜片钳实验，使用灌流泵以2 ml/min的流速向记录室灌注ACSF，并将记录室温度调节至约33 °C。 
		注意：膜片钳电生理记录系统配备灌流室、水浸物镜和温度控制器。此外，还需要GFP滤光片（激发光：480/30 nm，发射光：535/40 nm）和mCherry滤光片（激发光：580/20 nm，发射光：675/130 nm）。
		<ol>
			<li>在显微镜装置上安装一个发射波长为385 nm的LED，从距离焦点1 cm处以45°角照射光线。使用光功率计检测LED的输出功率。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用玻璃移液管小心拾取脑切片，放入灌流室中，用网格状固定器压住切片。</li>
		<li>从新皮层区域对表达mCherry/GFP荧光的神经元进行膜片钳记录27使用电压钳（V-clamp）法记录PIRK活性。首先将膜电位钳制在-60 mV，随后在固定的负膜电位（-100 mV）或电压斜坡（-100 mV至+40 mV）下记录电流。具体而言，在-100 mV下监测Kir2.1特异性的内向电流。</li>
		<li>手动或使用数据采集软件，发射一个脉冲（单个持续时间为100毫秒的脉冲）-1 在记录过程中，向神经元施加特定时长（秒级）的LED光照，观察PIRK蛋白是否被激活。一旦PIRK被激活，在-100 mV下的内向电流将显著增强。</li>
		<li>加入 0.5 mM BaCl2 向浴液中加入并验证PIRK是否再次失活。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

为了实现有效的光调控，关键的初始步骤是确定在目标蛋白中的哪个位置插入光响应性非天然氨基酸（Uaa）。目标蛋白的结构与功能信息对于指导候选位点的选择非常有帮助。同时，光调控的目的将决定哪一个位点最为合适。在选定候选位点后，我们建议先在哺乳动物细胞系（例如人胚胎肾（HEK）细胞）中对这些位点进行测试，因其培养和操作更为简便，之后再推进至原代神经元 体内为确定Kir2.1光激活位点，最初在HEK细胞中对Kir2.1孔道区域的多个位点进行了测试。结果显示，C169位点最为理想，因为Kir2.1在C169所处位置的孔道尺寸足以容纳Cmn侧链，又足够小以使Cmn侧链能够阻断离子通透。当在HEK细胞表达的Kir2.1中将Cmn引入C169位点时，所得突变型Kir2.1在无光照条件下无活性，但在短暂光照后被激活，证实了PIRK的成功构建。21.
高效表达正交tRNA和合成酶对于在细胞中获得高效的非天然氨基酸（Uaa）插入效率至关重要 体内正交合成酶基因可利用在哺乳动物细胞和神经元中常用的聚合酶II启动子和多聚腺苷酸化信号实现高效表达。对于正...

与传统的电刺激相比，光刺激具有更高的时间与空间分辨率，且对样本的生理系统干扰最小。自1971年首次演示使用激光刺激神经元以来1，人们已开发出多种创新方法，通过光对外源性地控制神经元活动。光解笼锁激动剂的方法已被长期用于研究神经网络对配体的生理反应2,3,4。然而，由于笼锁激动剂的扩散，该技术的特异性有限。通过异位表达光敏感的视蛋白通道和泵可实现基因特异性调控5,6,7，该方法已成功应用于多种模式生物中特定神经网络的调控。然而，将此方法扩展至光学控制其他多种神经蛋白则较为困难，因为将视蛋白的光响应特性嫁接到其他蛋白上需要复杂的工程改造，可能改变目标蛋白的天然特性。将外源性光敏配体通过化学方式共价连接至蛋白，展示了另一种调控通道蛋白功能的方法8,9,10。该配体通过偶氮苯基团的光异构化作用被引入或移出蛋白的结合位点。然而，这种共价连接化学主要局限于膜蛋白的胞外侧，难以应用于胞内侧或胞内蛋白。
光响应性非天然氨基酸（Uaas）在被整合到蛋白质中后，为利用光调控蛋白质提供了一种通用策略。早期研究中，通过化学氨酰化将光笼保护的Uaas连接到tRNA上，随后将这些tRNA显微注射入 非洲爪蟾卵母细胞 将非天然氨基酸掺入膜受体和离子通道11，这些研究推动了对其结构与功能关系的理解12,13,14该显微注射方法主要局限于较大的卵母细胞。通过使用正交的tRNA/合成酶对，遗传编码非天然氨基酸（Uaa）可绕过技术上具有挑战性的tRNA酰化和显微注射步骤，利用细胞内源性蛋白质翻译系统在活细胞中实现Uaa的整合。15,16,17,18已证明非天然氨基酸（Uaa）可掺入原代神经元和神经干细胞中的神经元蛋白19,20最近，光响应性非天然氨基酸（Uaa）已被遗传编码整合到哺乳动物大脑的神经元蛋白中 体内 首次21这些进展使得在神经元蛋白的天然细胞环境中利用Uaas进行研究成为可能。
内向整流钾通道Kir2.1是一种强整流通道，可通透K⁺+ 电流更易流入细胞而非流出，其在调控多种生理过程（包括细胞兴奋性、血管张力、心率、肾盐转运和胰岛素释放）中具有重要作用22Kir2.1过表达使靶神经元的膜电位超极化，导致其兴奋性降低23,24为了在其天然细胞中光学控制Kir2.1，Kang 等 将光响应性非天然氨基酸遗传编码整合到哺乳动物细胞、神经元及小鼠胚胎脑中表达的Kir2.1蛋白中21短暂的光脉冲能够将非天然氨基酸（Uaa）转化为天然氨基酸半胱氨酸（Cys），从而激活目标蛋白Kir2.1。当这种光诱导型内向整流钾离子（PIRK）通道蛋白在大鼠海马原代神经元中表达时，可通过光激活抑制神经元放电。此外，PIRK通道还在小鼠胚胎新皮层中表达，并检测了皮层神经元中光激活的PIRK电流。非天然氨基酸（Uaa）技术的成功应用 在体内 在哺乳动物大脑中，该技术为在天然环境中光学操控神经元蛋白打开了大门，从而能够在分子水平上对神经元过程和机制进行光学解析。
本方案中，我们描述了将非天然氨基酸（Uaas）遗传编码整合到培养的原代神经元及小鼠胚胎脑中的实验步骤。 体内. 光响应性非天然氨基酸 Cmn 和 Kir2.1 用于演示该过程。文中提供了评估非天然氨基酸成功插入及光学调控神经元蛋白活性的方法。本方案为在神经元中进行遗传编码非天然氨基酸提供了清晰的指导 体内，以及通过光响应性非天然氨基酸（Uaa）光学调控神经元蛋白质功能。我们预期该方案将促进此类技术的广泛应用 体内 用于神经科学与光遗传学生物研究的Uaa技术。

<table><tbody><tr><td>盖玻片，圆形，12 mm，厚度 0.13–0.17 mm</td><td>卡罗来纳生物公司</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat 多聚-D-赖氨酸</td><td>康宁发现实验室耗材</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>虹膜铲—弯曲型</td><td>精细科学工具</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>解剖刀 - 细斜尖</td><td>精细科学工具</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ 血清增强剂</td><td>BD 生物科学</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m细胞筛</td><td>康宁生命科学</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES（&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸 &lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-双(2-羟乙基)牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>LED光源 &amp;ndash; 黑色LED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖，分析级</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

光刺激是一种非侵入性调控生物事件的方法，具有优异的空间和时间分辨率。目前亟需开发新方法，以实现对在天然环境中表达的内源性蛋白质进行光调控。本文介绍了一种利用基因编码的非天然氨基酸（Uaa）在神经元中直接光学控制神经元蛋白功能的方法。通过使用正交的tRNA/氨酰-tRNA合成酶对抑制琥珀密码子，将光敏性非天然氨基酸4,5-二甲氧基-2-硝基苄基-半胱氨酸（Cmn）特异性地插入神经元蛋白Kir2.1（一种内向整流钾通道）的孔道区域。体积较大的Cmn可物理阻塞通道孔道，使Kir2.1处于非导通状态。光照可瞬间将Cmn转化为较小的天然氨基酸半胱氨酸（Cys），从而激活Kir2.1通道功能。我们表达了这些 p光诱导 i向内 r大鼠海马原代神经元中的光门控内向整流钾（PIRK）通道，并证明PIRK的光激活通过钾离子外流使神经元放电停止+ 通过激活的Kir2.1通道的电流。利用 在子宫内 电穿孔，我们还在小鼠胚胎新皮层中表达PIRK 体内，展示PIRK在新皮层神经元中的光激活。遗传编码非天然氨基酸（Uaa）对靶蛋白类型或细胞定位无限制，且已有多种光反应性Uaa可供用于调控不同的天然氨基酸残基。因此，该技术有望广泛应用于多种神经元蛋白，实现对大脑中不同过程的光学调控。本方案提供了一种在神经元中实现复杂Uaa插入的可行操作流程 体外 和 体内 在分子水平上实现对神经元蛋白质活性的光控调节。

为了在神经元中的蛋白质中遗传编码非天然氨基酸（Uaa），首要的重要步骤是设计合适的基因构建体，以在神经元中高效地递送和表达基因。实现Uaa插入需要三个遗传组分：（1）在选定的Uaa插入位点引入TAG琥珀终止密码子的目标基因；（2）一种正交tRNA，用于识别突变后的TAG终止密码子；（3）一种正交氨酰-tRNA合成酶，用于将Uaa装载到正交tRNA上。每个组分都需要由适当的启动子驱动表达。这三个基因表达盒可以包含在一个质粒中，也可以分别置于多个质粒中。为了在神经元中表达PIRK，使用经过进化、特异性识别光反应性Uaa Cmn的正交tRNALeuCUA/CmnRS（Cmn-tRNA合成酶）配对系统，将Cmn插入Kir2.1蛋白中21,29。将Kir2.1基因中的Cys169残基突变为TAG琥珀终止密码子（Kir2.1-TAG），并在Kir2.1的C末端融合荧光蛋白mCitrine，以便在神经元培养物中可视化PIRK的表达（图1）。
<p class="jove_cont...

此处介绍一种通过基因编码将光反应性非天然氨基酸定点插入培养神经元中表达的靶向神经元蛋白，从而利用短时闪光选择性激活该神经元蛋白的方法。 体内 被展示。

光刺激是一种具有优异空间和时间分辨率的非侵入性调控生物事件的方法。目前亟需开发新的方法以……

本实验的总体目标是利用基因编码的非天然氨基酸，在神经元中通过光学手段控制神经元蛋白的功能。该方法能够以空间和时间分辨率回答特定神经元蛋白在脑功能神经信号传导中的作用等关键科学问题。该技术的主要优势在于，其具有广泛适用性，可应用于多种神经元蛋白，从而实现对多种神经元过程的光学调控。 将海马神经元接种到24孔板中的盖玻片上，每孔加入500 µL生长培养基，并通过40 µm尼龙滤膜过滤。随后，将神经元培养物置于含5%二氧化碳、95%空气的湿润培养箱中，35 °C培养2至3周。转染当天，用双蒸水新鲜配制2.5 mol/L氯化钙溶液，并用0.22 µm滤器进行无菌过滤。接着，配制新鲜的 pH 7 的 2× BBS，并用 0.22 微米滤膜进行无菌过滤。然后，将培养基替换为 500 微升新鲜的、预热的转染培养基，不要丢弃旧的培养基。在将转染溶液加入培养物之前立即配制：将氯化钙与重蒸水混合，同时缓慢震荡试管。继续振荡试管，并将DNA缓慢加入溶液中。接着，逐滴加入2X BBS缓冲液。2X BBS缓冲液的配制是磷酸钙转染实验中的关键步骤，对于新的DNA质粒或制备物，建议将2X BBS缓冲液的最适pH值校准在6.90至7.15之间。然后，立即将30 µL转染液加入神经元培养物的每个盖玻片上。轻轻晃动培养皿数次以混匀溶液，并在35 °C下孵育45分钟至1小时。约1小时后，应可见一层细小的磷酸钙沉淀覆盖在神经元表面。接下来，将转染培养基替换为500 µL预热的洗涤缓冲液，在35°C下孵育15至20分钟。洗涤后，磷酸钙沉淀物应消失。随后，将洗涤缓冲液替换为500 µL新鲜培养基。随后，将生长培养基更换为之前保存的原始培养基。然后，在50微升预热的生长培养基中加入预先混合的非天然氨基酸Cmn，使其终浓度为1毫摩尔。将转染后的培养物在35摄氏度下孵育12至48小时，然后进行记录。在此步骤中，配制细胞外和细胞内溶液。在我们的实验装置中，将发射波长为385纳米的LED安装在显微镜旁边，以45度角将光线投射到距离焦点一厘米的位置。然后，使用微电极拉制仪用玻璃电极拉制若干膜片电极。随后，从培养箱中取出神经元培养的盖玻片，用细胞外液冲洗一次。用细胞外液充分灌流记录系统。接着，将盖玻片置于电生理显微镜载物台上，采用标准膜片钳技术进行操作。对转染了M-citrine荧光蛋白的神经元进行膜片钳记录。随后，采用电流钳技术记录神经元的电活动。首先，将静息电位调节至约-72毫伏。然后，注入阶跃电流以诱导神经元以每秒5到15次的频率持续产生动作电位。在记录过程中，向神经元传递单次LED脉冲，并监测其动作电位的变化。随后，在灌流液中加入0.5毫摩尔的氯化钡，以恢复动作电位。在急性脑切片条件下，对来自新皮质区域表达mCherry-GFP荧光的神经元进行膜片钳记录。随后采用电压斜坡法记录PIRK活性。具体而言，在负1

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一个神经元蛋白在神经元使用遗传编码的非天然氨基酸的光控制

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可扩展的流体注射器阵列用于病毒靶向完整三维脑环路

在脑片电生理实验中，可对表达ChR2的成年新生神经元进行操控，以研究其对嗅觉神经环路功能的贡献。...

使用经济型LED阵列对神经元进行光刺激

在多孔板中取一培养物，该培养物为携带质粒的Corynebacterium glutamicum，该质粒在其核糖核酸抗终止子（RAT）序列下游带有荧光报告基因。转录过程中，RAT-RNA 形成茎环结构，阻断 RNA 聚合酶，从而停止报告基因的表达。该质粒还组成型表达 LicV，这是一种融合蛋白，由 RAT-RNA 结合蛋白 LicT 和对蓝光敏感的 VVD 结构域组成。在黑暗条件下，LicV 保持单体状态，不能结合 RAT-RNA...

光遗传学调控基因表达 谷氨酸棒状杆菌

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

本文介绍了一种对传统电压钳荧光法（VCF）的改进，该方法使用荧光非天然氨基酸（fUAA）替代马来酰亚胺染料，以探测离子通道中的结构重排。实验流程包括Xenopus卵母细胞的DNA显微注射、RNA与fUAA的共注射，以及电流和荧光信号的同步测量。...

电压钳荧光法在 非洲爪蟾 利用荧光非天然氨基酸研究卵母细胞

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

本方案提供了一种工作流程，介绍如何将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学技术相结合，以特异性刺激完整神经环路中选择性基因表达降低的突触前终末。...

结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。...

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。...

通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

了解如何利用遗传编码非天然氨基酸在海马神经元中实现神经元蛋白的光控功能。该方法为神经信号传导和脑功能研究提供高时空分辨率的实验手段。

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

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