利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

本实验的总体目标是利用基因编码的非天然氨基酸，在神经元中通过光学手段控制神经元蛋白的功能。该方法能够以空间和时间分辨率回答特定神经元蛋白在脑功能神经信号传导中的作用等关键科学问题。该技术的主要优势在于，其具有广泛适用性，可应用于多种神经元蛋白，实现对多种神经元过程的光学调控。

开始本实验前，将海马神经元接种到24孔板中的盖玻片上，每孔加入500 µL生长培养基，并通过40 µm尼龙滤网过滤。随后，将神经元培养物置于含5%二氧化碳、95%空气的湿润培养箱中，35 °C培养2至3周。转染当天，用双蒸水配制新鲜的2.5 mol/L氯化钙溶液，并使用0.22 µm滤器进行无菌过滤。

接着，配制新鲜的pH为7的2×BBS溶液，并使用0.22微米滤膜进行无菌过滤。随后，将培养基替换为500微升新鲜的、预热的转染培养基，但不要丢弃旧的培养基。在将转染溶液加入培养物之前，立即配制：将氯化钙与重蒸水混合，同时缓慢振荡离心管。

继续振荡离心管，并将DNA缓慢加入溶液中。接着，逐滴加入2X BBS缓冲液。2X BBS缓冲液的配制是磷酸钙转染实验中的关键步骤，对于新的DNA质粒或制备物，建议将2X BBS缓冲液的最适pH值校准在6.90至7.15之间。

然后，立即将 30 微升转染液加入神经元培养物的每个盖玻片上。轻轻晃动培养皿数次以混匀溶液，并在 35 摄氏度下孵育 45 分钟至 1 小时。约 1 小时后，应可见一层细小的磷酸钙沉淀覆盖在神经元表面。

接下来，将转染培养基替换为500 µL预热的洗涤缓冲液，在35°C下孵育15至20分钟。洗涤后，磷酸钙沉淀物应消失。现在，将洗涤缓冲液替换为500 µL新鲜培养基。

随后，将生长培养基更换为之前保存的原始培养基。然后，在50微升预热的生长培养基中加入预先混合的非天然氨基酸Cmn，使其终浓度为1毫摩尔。转染后的培养物在35摄氏度下孵育12至48小时，然后进行记录。

在此步骤中，配制细胞外和细胞内溶液。在我们的装置中，将发射波长为385纳米的LED安装在显微镜旁边，以45度角将光照射到距离焦点1厘米的位置。然后，使用微电极拉制仪用玻璃电极拉制若干膜片电极。

随后，从培养箱中取出神经元培养的盖玻片，用细胞外液冲洗一次。用细胞外液充分灌流记录装置。接着，采用标准的膜片钳技术，将盖玻片放置在电生理显微镜载物台上。

对转染了M-citrine荧光蛋白的神经元进行膜片钳记录。接着，采用电流钳技术记录神经元的电活动。首先，将静息电位调节至约-72毫伏。

然后，注入阶跃电流以诱导动作电位以每秒5到15次（5至15赫兹）持续发放。在记录过程中，向神经元给予单次LED脉冲，并监测其动作电位的变化。随后，在灌流液中加入0.5毫摩尔的氯化钡，以恢复动作电位。

在急性脑切片条件下，对来自新皮质区域表达m-cherry GFP荧光的神经元进行膜片钳记录。随后采用电压斜坡法记录PIRK活性。具体而言，在负100毫伏条件下监测Kir2.1特异性的内向电流。

然后，在记录的同时向神经元传递单个LED脉冲，并监测PIRK蛋白是否被激活。一旦PIRK被激活，在负100毫伏下的内向电流将显著增加。最后，在灌流液中加入0.5毫摩尔的氯化钡，验证PIRK是否失活。

图中展示了健康的SD大鼠海马神经元培养的典型图像。两个健康的神经元表现出饱满的胞体以及明显的树突和轴突。这些是体外培养的大鼠海马神经元的微分干涉差（DIC）和荧光图像，已转染PIRK表达质粒但未加入CMN。

在 1 毫摩尔 CMN 存在的情况下，转染的神经元能够表达全长的 PIRK M-citrine 蛋白，从而显示出绿色荧光。以下是一个单次光脉冲抑制表达 PIRK 的海马神经元活性的示例。这些小鼠胚胎皮层神经元的荧光图像显示，CMN 已成功整合到体内的 GFP 和 Kir2.1 蛋白中。

在此图中，小鼠新皮层神经元记录到的电流显示了 PIRK 的光依赖性激活。该技术的应用可拓展至由特定神经元蛋白功能障碍引起的脑部疾病的治疗，例如 Andersen 综合征中的突变 Kir2.1 蛋白，因为该技术有助于揭示 Kir2.1 缺陷所影响的脑环路。一旦掌握，该技术可用于在活神经元中以高特异性通过光来控制神经元蛋白的功能。

观看本视频后，您应能充分理解如何在神经元中将非天然氨基酸掺入蛋白质，从而实现对目标神经元蛋白质的光控调控。