Name: 光感受器细胞光谱灵敏度在从昆虫模型决定在体内细胞内记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习使用细胞内记录技术测定蝴蝶复眼光感受器细胞的光谱敏感性。该方法可预测昆虫的色觉范围，并揭示滤光色素对光敏感性的影响，为昆虫视觉研究提供重要依据。

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我们感谢已故的&#160;Rudy Limburg 制作了万向节臂视野计，感谢 Kimberly Jamison、Matthew McHenry 和 Raju Metherate 借给我们设备，感谢 Almut Kelber 和 Kentaro Arikawa 的鼓励。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（授予 KJM）以及 NSF 资助项目 IOS-1257627（授予 A.D.B.）的支持。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

细胞内记录是一种较难掌握的技术，因其涉及诸多技术步骤。要获得成功的实验结果，必须考虑几个关键因素。首先，实验所用的平台必须具备良好的防振性能。许多研究人员使用气浮台，其台面与底座完全分离，可提供优异的振动隔离效果。我们的实验装置采用一块厚重的大理石台面，上方放置一个沙箱，将显微操作器、电极夹持器和样品台装置置于其中。这是一种有效且成本较低的替代方案，尤其适用于无法方便获取室内气体或压缩空气的实验室。此外，还可采取其他减振措施，例如使用被动式空气悬浮系统，或在桌腿上加装缓冲元件例如，打开的网球、自行车内胎、厚凝胶垫）。此外，实验装置必须置于法拉第笼内，且所有设备需妥善接地。法拉第笼前方应设有可拆卸的金属网屏蔽层，以便在笼内操作时取下，记录时重新装回。即使少量的环境电噪声（尤其是来自交流电源的50 Hz噪声）也可能导致原本良好的记录无法使用。
在制备样本时，包绕小眼的血淋巴和色素层可能会阻碍成功记录。如果角膜上的切口过大，体内血淋巴的正常泵动会导致切口处液面上下移动，从而引起记录不稳定。一旦切开，即使使用凡士林密封，血淋巴和表面色素层也会迅速凝结成无法穿透的痂状物，因...

通过测量细胞膜上离子流动引起的电压或电流变化，可以观察细胞（如神经元）的电学特性。目前已开发出多种电生理技术用于测量细胞中的生物电事件。动物眼睛中所含的神经元易于接近，且其神经环路通常比大脑中的更为简单，因此这些细胞是进行电生理研究的理想对象。眼内电生理学的常见应用包括视网膜电图（ERG）1,2和微电极细胞内记录。ERG技术涉及将电极置于动物眼球内部或表面，施加光刺激，并测量所有邻近细胞反应总和所导致的电压变化3-6。如果研究目标是特异性地表征单个感光细胞的光谱敏感性，通常多种细胞类型会对同一刺激以不同强度同时响应&#160;，因此仅从ERG数据中确定特定细胞类型的敏感性可能较为困难，尤其是在眼睛中存在多种光谱特性相似的感光细胞时。一种可能的解决方案是构建转基因Drosophila，使其眼部多数R1-6细胞表达目标感光细胞（视蛋白）基因，然后进行ERG记录7。该方法的潜在缺点包括感光蛋白表达量极低或完全不表达8，以及转基因动物的构建和筛选过程耗时较长。对于光谱上不同类型的感光细胞种类较少的眼睛，可通过使用彩色滤光片对眼睛进行适应性处理，降低某些细胞类型对ERG信号的贡献，从而有助于估算其光谱敏感性的峰值9。
细胞内记录是另一种技术，通过微电极刺入细胞并施加刺激，电极仅记录该单个细胞的反应，因此对多个单个细胞进行记录和分析，可以获得生理学上不同细胞类型的特异性敏感性10-14。尽管本实验方案主要关注光谱敏感性的分析，但使用锐利电极进行细胞内记录的基本原理可针对其他应用进行调整。例如，通过采用不同的样本制备方法，并使用尖端石英电极，可根据研究问题记录视叶更深层或其他脑区的信号。例如，单个感光细胞的反应时间15、视叶（包括外髓状体、内髓状体或叶状体17）16中的细胞活动、脑18或其他神经节19的活动，均可采用类似技术进行记录；此外，颜色刺激也可替换为偏振光刺激20-22或运动刺激23,24。
光转导是指光能被吸收并转化为电化学信号的过程，这一特性古老而普遍，几乎存在于当今所有动物门类中25。位于感光细胞中、负责启动视觉光转导的视觉色素是视紫红质（rhodopsin）。所有动物的视紫红质均由一种视蛋白（opsin）和一个与之结合的发色团组成，其中视蛋白属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族，发色团则来源于视黄醛或类似的分子26,27。视蛋白的氨基酸序列和发色团的结构会影响视紫红质对不同波长光的吸收能力。当发色团吸收一个光子后，视紫红质被激活，进而在细胞内启动G蛋白级联反应，最终导致膜结合离子通道的开放28。与大多数神经元不同，感光细胞发生的是分级电位变化，这种变化可通过光刺激强度改变所引起的反应幅度相对变化进行测量。通常情况下，特定类型的感光细胞仅表达一种视蛋白基因（尽管存在例外情况8,10,29-31）。复杂的色觉，如许多脊椎动物和节肢动物所具备的，依赖于包含数百至数千个感光细胞的复杂眼睛，每个细胞表达一种（偶尔为多种）视紫红质类型。视觉信息通过眼睛和大脑中复杂的下游神经信号，对感光细胞马赛克阵列的响应进行比较，从而形成包含颜色和运动信息的完整图像感知。
通过细胞内记录测量光感受器细胞对不同波长光的原始反应后，可以计算其光谱敏感度。该计算基于单变量原理（Principle of Univariance），该原理指出，光感受器细胞的反应仅取决于其吸收的光子数量，而与所吸收光子的具体性质无关32。任何被视紫红质吸收的光子都会引发相同类型的反应。实际上，这意味着细胞的原始反应幅度会因光照强度增加（可吸收的光子更多），或因波长向其敏感度峰值偏移（视紫红质对该波长的吸收概率更高）而增强。我们利用这一原理，将已知强度下同一波长的细胞反应，与相同强度但波长不同且相对敏感度未知条件下的反应进行关联。通常根据细胞敏感度达到峰值的波长来鉴定细胞类型。
本文介绍了一种用于记录和分析蝴蝶复眼中感光细胞光谱敏感性的细胞内记录方法，并着重于使该方法更易于被更广泛的研究群体所采用。尽管细胞内记录在文献中仍较为常见，尤其是在昆虫色觉研究领域，但我们发现，关于材料与方法的描述通常过于简略，难以据此重现该技术。我们以视频形式呈现本方法，旨在促进其更便捷地被复制和应用。同时，我们所描述的技术采用易于获取且价格合理的设备。我们还指出了在优化这一新颖且复杂的技术过程中常遇到但通常未被报道的注意事项，以避免研究进程因此类问题而延缓。

<table><tbody><tr><td>蝴蝶蛹</td><td></td><td></td><td>可提供多种本地物种，跨州运输需美国农业部（USDA）许可。Carolina Bio Supply 公司提供多种可在美国境内订购的昆虫物种，无需额外许可。</td></tr><tr><td>大型塑料圆筒</td><td></td><td></td><td>任何能够保持湿润的培养室均可使用</td></tr><tr><td>2号昆虫针</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% 沙漠牧豆树蜂蜜</td><td>特易购</td><td></td><td>任何蜂蜜或蔗糖溶液均可使用</td></tr><tr><td>氙弧灯</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>通用电源供应器</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>光学追踪</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>大型轨道载具（2个）</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>小型轨道载具（4x）</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>螺纹适配器，8-32外螺纹转1/4-20外螺纹，每包10个</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>光学安装柱，1.0 英寸，0.5 英寸直径，不锈钢，8-32 &amp;& 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>无滑动光学柱架，2英寸，0.5英寸直径柱，1/4-20（5个）</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>固定镜头接口，50.8 毫米</td><td>纽波特公司</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>固定镜头接口，25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>聚光镜组件</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>凸面石英透镜，50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>六位置滤光轮，x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>滤光轮安装轮毂</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>凹面二氧化硅透镜，25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>准直器支架</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>准直光束探头</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>套管转换器，SMA端接转11 mm标准套管</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>该适配器可使光纤装入准直器支架中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>600 &amp;mu;直径为 m 的紫外-可见光光纤电缆</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel 现已成为 Newport Corporation 的一部分</td></tr><tr><td>带驱动单元的快门</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.1 OD</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.3 光密度</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，0.5 OD</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，1.0 OD</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，2.0 OD</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>紫外熔融石英金属中性密度滤光片，3.0 OD</td><td>纽波特</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal 灯</td><td>海洋光学</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>海洋光学</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite 软件</td><td>海洋光学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>310 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>320 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>330 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>340 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>350 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>360 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>370 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>380 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>390 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>400 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>410 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>420 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>430 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>440 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>450 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>460 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>470 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>480 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>492 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>500 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>510 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>干涉带通滤光片，520 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>540 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>550 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>560 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>570 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>580 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>589 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>600 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>610 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>620 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>632 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>640 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>650 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>660 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>671 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>680 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>690 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>700 nm 干涉带通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td></td><td></td><td>任何可接地且适合实验装置的金属结构均可使用。</td></tr><tr><td>体视显微镜，6倍、12倍、25倍、50倍放大倍数</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>野生型 M5</td><td>任何体视显微镜均可使用</td></tr><tr><td>带摆动臂和重型底座的显微镜支架</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>任何带有支架的重型底座均可</td></tr><tr><td>万向节</td><td></td><td></td><td>定制构建，参见 &lt;强&gt;图4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiber-lite 高强度照明器</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>用于样本照明</td></tr><tr><td>光纤灯鹅颈导光管</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>任何鹅颈灯导管均可使用</td></tr><tr><td>大理石台面</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抬高的木桌</td><td></td><td></td><td>应在该桌子中间开孔，以便沙盘能够放置在下方的大理石桌面上</td></tr><tr><td>装有沙子的木箱</td><td></td><td></td><td>定制构建，任何装有沙子的盒子</td></tr><tr><td>操作器</td><td>卡尔·蔡司 - 耶拿</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电极夹 holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>样品台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于接地的鳄鱼夹导线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>绝缘铜线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>银丝，直径0.125 mm</td><td>世界精密仪器公司</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC 电缆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>前置放大器与前置放大头stage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug 噪声消除器</td><td>Quest Scientific</td><td>恶作剧</td><td></td></tr><tr><td>示波器，30 MHz，2通道，双踪，交替触发，不带探头</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T型接头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 硬件 2/20</td><td>ADI 仪器</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart 软件</td><td>ADI 仪器</td><td>图表 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz 脉冲发生器</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾，3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带槽塑料管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点石蜡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>韦勒</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带球窝磁性底座的平台</td><td>Hama 照片和视频</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双刃碳钢可折断剃须刀片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性 在体 内 细胞内记录

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

细胞内记录是一种强大的技术，用于确定单个细胞对特定刺激的反应方式。在视觉研究中，细胞内记录历来是研究单个感光细胞对不同光刺激敏感性的常用技术，至今仍在广泛使用。然而，目前文献中仍缺乏详细的实验方法，使得希望在眼部开展细胞内记录实验的研究人员难以重复相关操作。本文以昆虫作为研究眼生理学的通用模型。昆虫的感光细胞位于眼睛表面附近，易于触及，且参与视觉的许多机制在动物不同门类之间具有保守性。我们描述了在蝴蝶眼睛中进行感光细胞体内细胞内记录的基本操作流程，旨在使电生理经验较少的研究人员也能更便捷地掌握该技术。我们介绍了所需的基本设备、如何准备活体蝴蝶用于记录、如何将玻璃微电极插入单个细胞，以及最终的记录过程。此外，我们还解释了原始反应数据的基本分析方法，以确定不同类型细胞的光谱敏感性。尽管本实验方案主要聚焦于光谱敏感性的测定，但该装置同样适用于其他刺激（例如，偏振光）及方法的多种变体。

对于记录装置的许多组成部分，仅靠文字描述无法提供足够的细节. 图1 是完整记录装置中所涉及组件的示意图。在 图2， 为白光及每种干涉滤光片绘制光谱，以说明为何需要校正因子以及计算该校正因子所需的信息。 图3 展示了用于这些实验的卡丹臂的照片和示意图。 图4 是一张显示记录阶段和显微操作仪的复合图像。 图5 展示了实验前准备蝴蝶的多个步骤。 
一旦开始记录，光刺激引起的电压负向变化表明电极位于细胞外，如图6a所示。反应强度取决于电极尖端与感光细胞的接近程度以及光刺激的入射角度。在电极尖端接近到足以刺入细胞之前，反应应足够大（>30 mV）。图6b显示了对光刺激明显的去极化反应，表明电极已进入感光细胞。静息电位应保持稳定，反应幅度应较大（至少40 mV），尽管绝对幅度可能存在较大差异。我们测量的是相对反应，因此更重要的是信噪比要高。如...

演示了细胞内记录的电生理技术，并用于测定蝴蝶复眼中单个感光细胞的光谱敏感性。

细胞内记录是一种强大的技术，用于确定单个细胞对特定刺激的可能反应。在视觉研究中，细胞内记录……

本细胞内记录方法的总体目标是确定昆虫复眼内单个感光细胞在体内的光谱敏感性。该方法可揭示细胞所敏感的光波长是否受到滤光色素的影响。该技术的主要优势在于，通过了解单个感光细胞的光谱敏感性，我们能够预测动物所能感知的颜色范围。为准备记录，实验前至少45分钟打开氙灯，拉制玻璃电极前至少30分钟打开微电极拉制仪。接着，打开所有记录设备。确保快门默认处于关闭状态，以防止光线通过光纤电缆。然后，使用微电极拉制仪拉制细的硼硅酸盐玻璃微电极。用3摩尔的氯化钾溶液从后端填充电极。制备样品时，在显微镜下，用热石蜡将一只蝴蝶固定在小型塑料管内，使其头部固定并从管的一端伸出。然后，用蜡固定喙、触角和翅膀。接着，用一块干燥的蜡压住腹部。通过在管内腹部后方放置湿润的纸巾，保持管内湿润。确保标本完全固定不动。接下来，用一小块石蜡将标本管固定在一个带有球窝关节的小平台上，该平台连接至磁性底座。在解剖显微镜下，通过口部将一根银丝插入头部，作为参考电极。实验前，将导线永久固定在平台上。接着，使用剃须刀片在左眼角膜上切一个小孔，并用凡士林密封该孔以防止干燥。角膜切开后，应尽快将记录电极插入眼中，因为眼内的血淋巴会迅速硬化，导致电极无法插入。尽可能在将进行记录的设备上进行解剖。然后，使用鳄鱼夹将头级接地线连接到标本平台的参考电极上。将电极安装在电极夹持器上。随后，将银丝插入微电极内的氯化钾溶液中。使用带有鹅颈管附件的光源，在体视显微镜下照亮标本，同时将电极缓缓置入眼内。调整电极夹持器，使微电极 precisely 位于角膜 previously 切开的小孔正上方。然后，使用显微操作器将微电极缓慢插入昆虫复眼中，直至电路接通。电极进入复眼后，将体视显微镜移出法拉第笼外。关闭照射标本的光源，使昆虫在黑暗中静置10至20分钟以完成暗适应。通过施加1纳安电流并记录电压变化来检测电极的电阻。电阻值通常应在100至250兆欧之间。接下来，启动脉冲发生器，在整个实验过程中提供一束闪光，并将光纤电缆对准眼睛。通过每次闪光观察示波器上的电压变化。电压的负向变化表明电极尚未进入细胞。移动光纤电缆在样本周围的位置，直至观察到最大电压反应。为了产生去极化光反应，前后旋转显微操作器，使电极产生微小的垂直移动，同时轻敲电极架的底座，或使用前置放大器上的“buzz”功能。持续进行微调，直至示波器上出现去极化光反应。然后调节光纤电缆，以找到最大的去极化信号。使用显微操作器进行微调，并根据需要启用放大器上的震颤功能，以确保电极稳定记录细胞。稳定的记录应表现为静息电位几乎无变化、背景噪声低，并具有持续且显著的去极化反应。获得稳定的记录至关重要，其中静息膜电位应无噪声且不随时间发生改变。反应应为大幅且呈阳性，无超极化现象。待系统稳定后，打开软件并关闭名为“Experiments Gallery”的对话框，以弹出一个包含四个通道的窗口。调整软件窗口右上角的电压刻度至500毫伏。然后，单击右下角的“开始”以开始记录。最小化第三和第四通道，并调整X轴和Y轴比例。随后让软件持续运行至实验结束。对于白光刺激，使用中性密度滤光轮设置为仍能引发反应的最高光密度（OD）值，记录最多10个独立反应。此处显示了3.0 OD和2.0 OD下的反应变化。接下来，按照从3.5至0.0 OD的每种组合顺序，记录相同数量的反应，以获得反应的光强对数曲线。在使用干涉滤光片记录细胞对所有波长的反应之前，应首先快速确定峰值波长。在光路中不使用任何中性密度滤光片的情况下，放置一片透紫外滤光片，短暂观察反应幅度。随后依次更换为透射蓝光、透射绿光和透射红光的滤光片，重复该步骤，以初步判断峰值反应所在的波长范围。在更换另一种干涉滤光片之前，记录下产生最大反应幅度的滤光片波长下的数据。在使用后续滤光片记录之间，让细胞对一到两次无滤光片的白光闪光产生反应，以帮助监测峰值反应是否随时间下降。然后，使用其他干涉滤光片进行记录，每种滤光片最多记录10次反应。这是一个进入细胞前观察到的显著负电压变化的示例。此处显示的是一条干净的记录，其背景噪声很小，并具有较大的去极化反应，通常至少为 40 毫伏。而这里是一个较差记录的示例，因其在主峰之后出现了负电位变化。这是另一个不良记录的示例。静息电位正在发生大幅度波动，大量的背景噪声可能会掩盖反应的幅度。这是从单次记录中获得的光谱敏感性的代表性示例。细胞类型根据其在相似波长处的峰值敏感性以及敏感性光谱的整体形状进行分类。随后对相同类型的细胞进行平均处理，并在每个波长处以标准误差条表示平均敏感度。该图展示了昆虫中三种典型细胞类型的光谱敏感度。一旦掌握，该技术可在约两小时内完成。通过此操作步骤，可开展行为学实验，以确定所有感光细胞类型是否均参与颜色辨别。

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神经科学

光感受器细胞光谱灵敏度在从昆虫模型决定<em&gt;在体内</em&gt;细胞内记录

本视频概述了在固定状态的黑腹果蝇（Drosophila）眼部进行光感受器活动电生理记录的实验方案，可实现对光刺激下电压变化的精确测量。...

电压响应的电生理记录 黑腹果蝇 视网膜光感受器对光刺激的反应

该视频演示了通过建立全细胞记录模式，对Drosophila小眼（ommatidium）中的感光神经元进行电活动记录。重点展示了光脉冲激活瞬时受体电位通道，从而产生可测量的量子 bumps（quantum...

Drosophila 光感受器的全细胞电压钳记录

本视频展示了在蝴蝶眼睛中进行光感受器细胞体内细胞内记录并测定不同类型细胞光谱敏感性的实验步骤。该技术可用于研究单个光感受器细胞对不同光刺激的敏感性。...

蝴蝶感光细胞光谱敏感性的体内细胞内记录

来源：Wagner, K. 等，利用eGFP标记蛋白研究果蝇感光细胞中的膜蛋白转运。J. Vis. Exp.

研究膜蛋白转运在 果蝇 光感受器细胞

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。...

记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇...

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP...

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

螯虾感光细胞在光刺激下的脱敏与恢复

我们提出了一种电生理学方法，用于表征双稳态光敏色素：（i）利用光敏色素分子在吸收光子后发生的电荷位移及其在感光细胞中的大量存在，以及（ii）利用视紫红质与高视紫红质这两种光敏色素状态之间的吸收光谱差异。这些方法可用于筛选影响双稳态光敏色素系统的突变。...

用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

本视频演示了一种从E13大鼠背侧脊髓分离并培养联合神经元的方法。离体培养的联合神经元可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。...

从胚胎脊髓中分离和培养联合神经元

学习使用细胞内记录技术测定蝴蝶复眼光感受器细胞的光谱敏感性。该方法可预测昆虫的色觉范围，并揭示滤光色素对光敏感性的影响，为昆虫视觉研究提供重要依据。

从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性在体内细胞内记录

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