从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性 在体 内 细胞内记录

本细胞内记录方法的总体目标是确定昆虫复眼内单个感光细胞在活体状态下的光谱敏感性。该方法可揭示细胞所敏感的光波长是否受到滤光色素的影响。该技术的主要优势在于，通过了解单个感光细胞的光谱敏感性，我们能够预测动物所能感知的颜色范围。

为准备记录，实验前至少45分钟打开氙灯，拉制玻璃电极前至少30分钟打开微电极拉制仪。接着，打开所有记录设备。确保快门默认处于关闭状态，以防止光线通过光纤电缆。

然后，使用微电极拉制仪拉制细的硼硅酸盐玻璃微电极。用3摩尔的氯化钾溶液从后端填充电极。制备样品时，在显微镜下用热蜡将一只蝴蝶固定在小型塑料管内，使头部保持不动并从管的一端伸出。

然后，用蜡固定吻部、触角和翅膀。接着，用一块干燥的蜡压住腹部。通过在管内腹部后方放置湿润的纸巾，保持管内湿润。

确保标本完全固定不动。接下来，使用少量石蜡将标本管固定在一个带有球窝关节的小平台上，该平台连接至磁性底座。在解剖显微镜下，通过口部将一根银丝插入头部，作为参考电极。

实验前，将导线永久固定在平台上。接着，使用剃须刀片在左角膜上切一个小孔，并用凡士林密封该孔以防止干燥。角膜切开后，应尽快将记录电极插入眼内，因为眼内的血淋巴会迅速硬化，导致电极无法插入。

如果可能，应在将进行记录的设备中进行解剖。然后，使用鳄鱼夹将头段接地线连接到标本平台的参考电极上。将电极安装在电极夹持器上。

随后，将银丝插入微电极中的氯化钾溶液。使用带有鹅颈式附件的光源，在体视显微镜下照亮标本，同时将电极缓缓插入眼球。调整电极 holder，使微电极正对先前在角膜上切开的小孔上方。

然后，使用显微操作器将微电极缓慢插入昆虫复眼中，直至电路接通。电极进入复眼后，将体视显微镜移出法拉第笼外。关闭照射标本的光源，让昆虫在黑暗中静置10至20分钟以完成暗适应。

通过施加1纳安电流并记录电压变化，检测电极的电阻。电阻值通常应在100至250兆欧之间。接下来，启动脉冲发生器，在整个实验过程中发出一束闪光，并将光纤电缆对准眼睛。

每次闪光时，在示波器上检查电压变化。电压的负向变化表明电极尚未进入细胞。移动光纤电缆在样本周围的位置，直至观察到最大电压反应。

为了产生去极化光反应，反复旋转显微操作器，使电极产生微小的垂直移动，同时轻轻敲击电极架的底部，或使用前置放大器上的“buzz”功能。持续进行微调，直至示波器上出现去极化光反应。随后，调节光纤电缆的位置，以找到最大的去极化信号。

使用显微操作器进行微调，并根据需要启用放大器上的蜂鸣功能，以确保电极稳定记录细胞。稳定的记录应表现为静息电位几乎无变化、背景噪声低，并具有持续且显著的去极化反应。获得稳定的记录至关重要，其中静息膜电位应无噪声且不随时间发生改变。

反应应为大幅且正向，无超极化现象。待系统稳定后，打开软件并关闭名为“Experiments Gallery”的对话框，以弹出一个包含四个通道的窗口。调整软件窗口右上角的电压刻度至500毫伏。

然后，单击右下角的“开始”以启动记录。最小化第三和第四通道，并调整 X 轴和 Y 轴比例。随后让软件持续运行直至实验结束。

对于白光刺激，使用中性密度滤光轮设置为仍能引发反应的最高光密度（OD）值，记录最多10个独立反应。此处显示了在3.0 OD和2.0 OD时反应的变化。接下来，依次以从3.5至0.0 OD的每种组合记录相同数量的反应，以获得反应的光强对数曲线。在使用干涉滤光片记录细胞对所有波长的反应之前，应首先快速确定峰值波长。

在光路中不使用任何中性密度滤光片的情况下，放置一片透紫外滤光片，短暂观察反应幅度。随后依次更换为透蓝光滤光片、透绿光滤光片和透红光滤光片，重复该步骤，以初步判断峰值反应所在的波长范围。在更换至另一种干涉滤光片之前，需在产生最大反应幅度的滤光片波长下进行记录。

在使用后续滤光片进行记录之间，让细胞对一到两次无滤光片的白光闪光产生反应，以帮助监测峰值反应是否随时间下降。然后，使用其他干涉滤光片进行记录，每种滤光片最多记录10次反应。这是进入细胞前观察到的一个显著负电压变化的示例。

此处显示的是一条干净的记录，其背景噪声很小，并具有较大的去极化反应，通常至少为 40 毫伏。而这里是一条质量较差的记录示例，因其在主峰之后出现了负电位变化。这是另一条不良记录的示例。

静息电位正在经历大幅度波动，且大量背景噪声可能掩盖反应的幅度。这是从单次记录中获得的光谱敏感性的代表性示例。细胞类型根据其在相似波长处的峰值敏感性以及敏感性光谱的整体形状进行分类。

随后对相同类型的细胞进行平均处理，并在每个波长处绘制出带有标准误差条的平均敏感度。该图显示了昆虫中三种典型细胞类型的光谱敏感度。一旦掌握，该技术可在约两小时内完成。

通过此操作流程，可开展行为学实验，以确定所有感光细胞类型是否均参与颜色辨别。