Name: 多目标显色全安装原位在比较基因表达域杂交果蝇胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学习多靶点显色全安装原位杂交技术，用于在完整果蝇胚胎中同时检测三种不同mRNA分布模式。该方法可精确比较基因表达域，为发育生物学研究提供快速可靠的基因表达图谱分析工具。

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我们感谢同事们提供了用于模板生成的 cDNA 质粒。作者的研究工作得到了瑞典癌症基金会（CAN 2010/553）、瑞典研究与高等教育国际合作基金会（IG2011-2042）以及克努特和爱丽丝·瓦伦贝里基金会（KAW2012.0058）的支持。

1. RNA探针的标记 体外 转录
<ol>
	<li>在无 RNase 条件下，于 1.5 ml 微量离心管中配制体外转录反应体系：10.5 µl 经 DEPC 处理的 H2O、4.0 µl 5x 转录缓冲液、1.0 µl（1 µg）溶于 DEPC 处理 H2O 中的线性化纯化模板 DNA、1.3 µl NTP 混合液、0.7 µl 半抗原标记的 UTP、0.5 µl RiboLock RNA 抑制剂、2.0 µl RNA 聚合酶。 
	注意：最终反应体积为 20 µl。</li>
	<li>根据模板的启动子序列选择使用 T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶进行体外转录（参见参考文献17）。</li>
	<li>选择地高辛-11-UTP、生物素-16-UTP 或荧光素-12-UTP 作为 RNA 探针的标记物。更多细节请参见讨论部分中关于半抗原标记及探针浓度的说明。</li>
	<li>混匀转录反应液，并短暂离心。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 3 小时以完成转录。</li>
	<li>向转录反应体系中加入 1 µl 无 RNase 的 DNase I，以降解模板 DNA，充分混匀后于 37 °C 孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 DEPC 处理的 H2O 将样品体积调至 200 µl。</li>
	<li>加入 100 µl（0.5 倍体积）7.5 M 醋酸铵和 600 µl（3 倍体积）乙醇，以沉淀标记的 RNA 探针。室温孵育 30 分钟。
	<ol>
		<li>请勿使用冰冻乙醇，以免未掺入的核苷酸发生非特异性沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在温控离心机中，于 +20 °C 以最大转速（20,800 x g）离心 30 分钟，沉淀转录生成的 RNA。小心吸除上清液。</li>
	<li>用室温的 70% 乙醇洗涤所得沉淀，于 20,800 x g 离心 10 分钟，温度为 +20 °C。</li>
	<li>去除上清液时注意避免误吸松散的沉淀。将沉淀在开盖的微量离心管中于室温下静置数分钟，使其自然干燥。</li>
	<li>将所得沉淀溶解于 100 µl DEPC 处理的 H2O 中。</li>
	<li>加入 300 µl 预杂交缓冲液（50% vol/vol 去离子甲酰胺、5x SSC、50 µg/ml 肝素钠盐、0.1% vol/vol Tween-20、5 mg/ml 酿酒酵母 RNA），混匀后于 -20 °C 保存。探针可在 -20 °C 长期储存。 
	注意：首次测试新转录探针时，可将 3 µl 半抗原标记的 RNA 探针溶于 100 µl 杂交缓冲液中，以获得 WISH 实验所需的最终浓度。</li>
</ol>
2. 使用插入式培养皿处理胚胎样本
注意：在胚胎处理过程中，使用微量管或多孔板进行不同孵育步骤时，存在因更换溶液时意外吸取而导致大量胚胎丢失的风险。为避免此类损失，可使用篮状装置（如Netwell插入物）携带胚胎样本进行操作。这些插入物为聚苯乙烯材质，底部带有聚酯网膜（图2A），胚胎在处理过程中可置于其上。
<ol>
	<li>进行WISH实验处理胚胎时，将插入件组装到12孔板中（图2B），并向每孔加入2 ml相应的溶液。</li>
	<li>使用蓝色枪头将胚胎移入插入件中，确保所有胚胎均浸没于液体中。</li>
	<li>孵育结束后，将含有胚胎的插入件转移至另一个已装有下一步所需溶液的12孔板中。
	<ol>
		<li>使用载体和手柄（图2C）一次可将最多12个样品从一种溶液转移至另一种溶液（图2D）。 
		注意：为减少试剂用量，杂交前处理/杂交步骤可使用2.0 ml微量离心管（见步骤4.1），染色反应则使用24孔板（步骤6.2）。杂交和染色反应的体积分别为100 µl和400 µl。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 杂交用胚胎的制备
<ol>
	<li>采用标准实验方法收集、去壳、固定和去卵黄膜胚胎 14,18制备好的胚胎通常保存在-20 °C的甲醇中。</li>
	<li>将待使用的胚胎转移至 原位 杂交至RT，并分装至12孔板的插入孔中，每孔加入2 ml甲醇。</li>
	<li>在室温下通过逐步降低甲醇浓度的系列溶液复水胚胎。每次孵育胚胎3分钟，依次使用：(i) 75%甲醇/PBS 1×溶液；(ii) 50%甲醇/PBS 1×溶液，0.1% Tween-20；(iii) 25%甲醇/PBS 1×溶液，0.1% Tween-20；(iv) PBS 1×溶液，0.1% Tween-20；(v) PBS 1×溶液，0.1% Tween-20。</li>
	<li>在室温下，用含 4% 多聚甲醛的 1x PBS 固定胚胎 20 分钟。</li>
	<li>在室温下，用 1× PBS 缓冲液（含 0.1% Tween-20）洗涤 4 次，每次 3 分钟，以去除固定剂。同时，解冻并配制蛋白酶 K 和甘氨酸的工作液。</li>
	<li>在1x PBS、0.1% Tween-20中加入新鲜的蛋白酶K（10 µg/ml至50 µg/ml），于室温下对胚胎进行透化处理，持续3分钟。 
	注意：蛋白酶K处理的时间和强度需根据胚胎固定的程度进行调整。例如，如果省略预固定步骤（3.4），可采用较温和的蛋白酶K处理。</li>
	<li>通过在室温下用含2 mg/ml甘氨酸的1x PBS、0.1% Tween-20溶液冲洗两次，每次1分钟，终止反应。</li>
	<li>在室温下，用含4%多聚甲醛的1x PBS固定胚胎20分钟。</li>
	<li>随后，在室温下用含0.1% Tween-20的1×PBS缓冲液清洗四次，每次3分钟，以去除多聚甲醛固定剂。</li>
	<li>将固定后的胚胎转移至预杂交缓冲液中。胚胎可保存在预杂交缓冲液中于 -20 °C 储存，或直接进行探针杂交。</li>
</ol>
4. 探针杂交
<ol>
	<li>将保存在 -20 °C 预杂交缓冲液中的胚胎转移至室温，并将胚胎分装至 2.0 ml 微量离心管中，置于预杂交缓冲液中。</li>
	<li>在 65 °C 条件下，用预杂交缓冲液对胚胎样品进行至少 30 分钟的预杂交。 
	注意：预杂交和杂交步骤均使用水浴。在预杂交期间，可同时配制探针混合液，将最多三种不同的反义 RNA 探针混合，每种探针特异性针对不同的基因转录本，并用不同的半抗原标记。</li>
	<li>为获得探针混合液，将适量（通常为 1 µl 至 6 µl）所需的不同原始半抗原标记反义 RNA 探针加入 100 µl 杂交缓冲液（50% vol/vol 去离子甲酰胺，5x SSC，50 µg/ml 肝素钠，0.1% vol/vol Tween-20，5 mg/ml 酵母 RNA，5% wt/vol 硫酸葡聚糖）中。 
	注意：硫酸葡聚糖的添加为可选步骤。</li>
	<li>将反义 RNA 探针混合液置于 80 °C 金属浴中变性 5 分钟，随后立即将变性后的探针混合液转移至 65 °C 条件下。</li>
	<li>吸除胚胎样品中的大部分预杂交缓冲液，加入已变性的探针混合液。</li>
	<li>使胚胎样品在 65 °C 条件下与探针混合液过夜（O/N）杂交。 
	注意：通常在 55 °C 至 65 °C 范围内进行杂交、预杂交和杂交后洗涤步骤。65 °C 杂交提供最严格的条件，当在较低温度下使用时出现背景问题，建议采用此条件。若无背景问题，推荐在 55 °C 进行杂交，因其可增强信号强度并改善胚胎完整性。</li>
	<li>次日早晨，首先将严格性洗涤液转移至 65 °C，以确保其及时达到正确温度。</li>
	<li>将含有胚胎的杂交探针混合液从 2.0 ml 微量离心管转移至 12 孔板的插件中，每孔含 2 ml 预热的杂交洗涤缓冲液（2× SSC 中含 50% 甲酰胺，0.1% Tween-20）。将装有胚胎样品的 12 孔板放入烘箱，在 65 °C 条件下孵育 20 分钟。</li>
	<li>将胚胎样品转移至 2 ml 新鲜的杂交洗涤缓冲液中，在 65 °C 条件下孵育 20 分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>在 65 °C 条件下，用 2× SSC、0.1% Tween-20 洗涤一次（20 分钟），再用 0.2× SSC、0.1% Tween-20 洗涤三次（每次 20 分钟），以去除未结合的探针。</li>
	<li>将胚胎样品转移至室温的 1x PBS、0.1% Tween-20 溶液中。</li>
	<li>在封闭缓冲液（含 8% 羊血清的 1x PBS、0.1% Tween-20）中于室温孵育胚胎，时间不少于 30 分钟。</li>
</ol>
5. 半抗原标记探针的抗体检测
注意：与三种不同标记探针的同时杂交不同，每种探针在独立的抗体孵育和染色轮次中依次检测。因此，在每一轮检测中仅使用一种抗体（即抗地高辛-碱性磷酸酶、抗荧光素-碱性磷酸酶或抗生物素-碱性磷酸酶中的一种）。
<ol>
	<li>根据待检测的半抗原标记物，在步骤 5.1.1 至 5.1.3 中选择其一，并配制相应的抗体稀释液。 
	注意：对于不同标记探针的连续检测，每个检测循环中需使用另一种抗半抗原抗体。
	<ol>
		<li>检测荧光素标记探针时，将抗荧光素-碱性磷酸酶（AP）偶联物以 1:4,000 的比例溶于封闭缓冲液中。</li>
		<li>检测地高辛标记探针时，将抗地高辛-碱性磷酸酶（AP）偶联物以 1:4,000 的比例溶于封闭缓冲液中。</li>
		<li>检测生物素标记探针时，将抗生物素-碱性磷酸酶（AP）偶联物以 1:4,000 的比例溶于封闭缓冲液中，配制成溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胚胎在所选的抗半抗原-AP 溶液中于室温孵育 3 至 4 小时，或在 4 °C 过夜孵育。切勿同时加入三种抗体。</li>
	<li>为去除未结合的抗体，在室温下用含 0.1% Tween-20 的 1× PBS 洗涤胚胎，每次 15 分钟，共洗涤 4 次。</li>
	<li>为更换缓冲体系，在 TNT 缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 8.0，0.1 M NaCl，0.1% Tween-20）中于室温洗涤两次，每次 15 分钟。</li>
</ol>
6. 碱性磷酸酶显色染色
<ol>
	<li>在抗体检测之后，从步骤 6.1.1 至 6.1.4 中选择一种碱性磷酸酶显色反应，以获得所需的颜色信号（见表 1）。每一轮检测均使用不同的显色底物反应，以不同颜色显示每种转录本的表达模式。
	<ol>
		<li>Fast Red 染色
		<ol>
			<li>用 TT8.2（0.1 M Tris-HCl pH 8.2，0.1% Tween-20）将胚胎清洗两次，每次 15 分钟。</li>
			<li>在清洗胚胎的同时，使用 Fast Red TR/NAMP 碱性磷酸酶底物片剂套装配制 Fast Red 染色液。</li>
			<li>将片剂套装中的缓冲液片剂溶于 1 ml 蒸馏水中，通过涡旋混合，得到 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 溶液。</li>
			<li>将一片 Fast Red TR/NAMP 片剂投入已配制的 Tris 缓冲液中，涡旋至完全溶解，得到 Fast Red 染色液。</li>
			<li>使用 0.2 µm 注射器滤器过滤 Fast Red 染色液，去除未溶解颗粒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Fast Blue 染色
		<ol>
			<li>用新鲜的 SB8.2 染色缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 8.2，0.1 M NaCl，0.05 M MgCl2，0.1% Tween-20）将胚胎清洗两次，每次 15 分钟。</li>
			<li>在清洗胚胎的同时，使用 50 mg/ml Fast Blue BB（溶于 DMF）和 50 mg/ml 萘酚磷酸盐（溶于 DMSO）储备液配制 Fast Blue 染色液。</li>
			<li>在 SB8.2 缓冲液中新鲜配制 0.5 mg/ml 的 Fast Blue BB 溶液。</li>
			<li>在 SB8.2 缓冲液中新鲜配制 0.5 mg/ml 的萘酚磷酸盐溶液。</li>
			<li>在持续涡旋混合下，将配制好的萘酚磷酸盐溶液逐滴加入 Fast Blue BB 溶液中。最终两种底物组分的工作浓度均为 0.25 mg/ml。 
			注：不同的 Fast Blue / 萘酚磷酸盐组合会产生不同色调的颜色（见表 1）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>BCIP/NBT 染色
		<ol>
			<li>用新鲜的 SB9.5 染色缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 9.5，0.1 M NaCl，0.05 M MgCl2，0.1% Tween-20）将胚胎清洗两次，每次 15 分钟。</li>
			<li>为获得紫蓝色显色信号，每毫升 SB9.5 染色缓冲液中加入 1 µl 左旋咪唑、3.5 µl BCIP 和 4.5 µl NBT，新鲜配制 BCIP/NBT 染色液，并充分混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>INT 染色
		<ol>
			<li>用新鲜的 SB9.5 染色缓冲液将胚胎清洗两次，每次 15 分钟。</li>
			<li>为获得黄褐色显色信号，每毫升 SB9.5 染色缓冲液中加入 1 µl 左旋咪唑、5 µl Magenta-Phos 和 5 µl INT，新鲜配制 INT 染色液，并充分混匀。 
			注：也可使用 7.5 µl/ml 的 BCIP/INT 即用型染色液替代。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胚胎样品转移至 24 孔板中进行染色反应。每份样品加入 400 µl 所选染色液，在避光条件下孵育。</li>
	<li>在体视显微镜下定期观察信号发育情况。当达到理想信号强度且尚未出现明显背景信号时，终止染色反应。</li>
	<li>为终止显色反应，将染色后的胚胎转移至含有 2 ml TNT 的 12 孔板插件中，每孔含 2 ml TNT。用 TNT 清洗染色胚胎两次。</li>
	<li>在室温下用 1× PBS、0.1% Tween-20 清洗胚胎两次，每次 10 分钟，以去除残留底物。</li>
</ol>
7. 抗体去除/碱性磷酸酶失活
<ol>
	<li>在室温下，用 2 ml 低 pH 终止液（0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 2.2，0.1% Tween-20）孵育 10 分钟，以去除抗体并使碱性磷酸酶失活。</li>
	<li>在室温下，用 2 ml 1× PBS、0.1% Tween-20 洗涤 1 分钟。</li>
	<li>在室温下，用 1× PBS、0.1% Tween-20 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
</ol>
8. 第二轮检测
<ol>
	<li>为了检测第二种转录本的分布模式，请使用针对第二种半抗原标记的抗体-碱性磷酸酶（AP）偶联物，进行半抗原标记探针的抗体检测（步骤 5.1 至 5.4）。</li>
	<li>进行碱性磷酸酶的显色染色（步骤 6.1 至 6.5），所用底物组合应产生与第一轮检测所用颜色形成对比的显色结果（可选颜色参见表 1）。</li>
	<li>按照步骤 7.1 至 7.3 所述方法，去除第二抗体-AP 偶联物。</li>
</ol>
9. 第三轮检测
<ol>
	<li>为了检测第三种转录本的分布模式，使用针对第三种半抗原标记的抗体-碱性磷酸酶偶联物，进行半抗原标记探针的抗体检测（步骤 5.1 至 5.4）。</li>
	<li>进行碱性磷酸酶显色染色（步骤 6.1 至 6.5），所用底物组合应不同于前几轮检测中使用的底物。选择一种显色反应，使其产生的沉淀颜色易于与前两轮检测的颜色相区分（颜色选择参见表 1）。</li>
</ol>
10. 封片与成像
<ol>
	<li>将染色良好的胚胎转移至含30%甘油的PBS溶液中，孵育至胚胎完全浸透甘油溶液；当胚胎沉入底部时，表明已充分平衡。</li>
	<li>将胚胎转移至含70%甘油的H2O溶液中，在室温下平衡。染色后的胚胎可保存在70%甘油中，置于4 °C环境中。</li>
	<li>封片时，用移液器将染色胚胎转移至载玻片上的70%甘油液滴中，注意避免触碰粘附在载玻片上的间隔物（图3），然后盖上盖玻片。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察已封片的胚胎，轻移盖玻片使胚胎旋转至所需方向。</li>
	<li>使用配备微分干涉差（Differential Interference Contrast）光学系统的复合显微镜，以高分辨率（20X、40X物镜）观察方向正确的胚胎。</li>
	<li>使用数字彩色相机采集图像，并保存至数字存储设备中。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用放射性标记的核酸探针进行原位杂交（in situ hybridization, ISH）常用于检测RNA在组织切片中的定位。然而，放射性ISH方法耗时较长、灵敏度较低，且无法在整体标本中清晰呈现完整的转录本分布模式。相比之下，本文所述的多色整体原位杂交（MC-WISH）方法可在完整胚胎内以不同颜色直接比较多个基因表达区域。MC-WISH的优势在于，通过标准明场显微镜即可直观显示组织学背景，从而能够以高精度在拓扑上相互关联地比较基因表达区域，并快速、可靠地确定独特及重叠的表达位点。另一方面，多重荧光原位杂交（FISH）在灵敏度和分辨率方面更具优势，当需要实现mRNA检测的细胞水平甚至亚细胞水平分辨率时，应优先选用该方法。
MC-WISH 技术已绘制出广泛的转录本谱，表明几乎任何转录本不仅可在胚胎组织中分析，也可在幼虫、成体组织及其他物种中进行分析 黑腹果蝇确实，此处详述的方案对于 果蝇，与斑马鱼胚胎一起使用时同样高效 11,16,22此外，MC-WISH 方法可适用于多种无脊椎动物和脊椎动物的胚胎及组织样本。
半抗原标记与探针浓度
我们常规使用荧光素（fluorescein）、地高辛（digoxigenin）和生物素（biotin）作为RNA探针的半抗原标记。此外，也可使用二硝基苯酚（dinitrophenol）标记的探针，该标记方法已在斑马鱼WISH实验中被引入23-25。与其他半抗原标记相比，荧光素标记的探针灵敏度较低，因此荧光素最适合用于丰度较高的转录本检测。每种新转录的探针首先在单次WISH实验中进行测试，通过使用BCIP/NBT或Fast Red作为底物来评估其性能。当在数分钟至数小时内获得强信号且无背景显色时，该探针浓度即被视为最佳。
为了确保MC-WISH实验已完整检测到目标表达区域，必须使用最敏感的底物组合BCIP/NBT，通过单标记WISH实验对每种转录模式进行可视化。这可确保在多靶点实验中不会遗漏微弱的表达区域。为弥补其他底物组合灵敏度较低的问题，与标准的BCIP/NBT染色相比，必须使用两倍（甚至三倍）的探针浓度。
低pH灭活
低pH失活步骤可能导致反义半抗原标记RNA探针与正义mRNA杂交体的部分解体，从而在第二轮和第三轮染色中降低信号检测。为尽量减少灵敏度损失，失活步骤应尽可能短。我们发现，在低pH条件下孵育10分钟足以完全消除碱性磷酸酶（AP）活性。随后使用大体积缓冲液进行快速洗涤，可迅速稀释未结合的抗体-AP偶联物，防止其重新结合至半抗原化探针。替代方案包括使用多聚甲醛固定和加热失活。然而，某些显色沉淀物不耐热，且多聚甲醛固定可能不足以完全失活AP。若首次加入的抗体-AP偶联物未完全失活，则在后续检测轮次中可能导致mRNA表达模式被重复显影，从而造成与第二种待检测mRNA物种之间出现假阳性共表达信号。因此，在对照实验中，应在首次抗体-AP偶联物失活后将胚胎分为两部分，其中对照组不添加第二种抗体-AP偶联物，且在第二轮显色反应中不应产生任何信号。如果第二轮显色反应仍出现与第一轮相对应的信号分布模式，则表明失活程序不够有效。此时，应在下一次实验中延长低pH终止液中的孵育时间。
AP底物添加顺序
由于每一轮检测的灵敏度都会下降，因此建议先检测丰度较低的mRNA，再检测丰度较高的转录本。此外，Fast Red与Fast Blue底物组合的灵敏度显著低于紫蓝色的BCIP/NBT染色，因此对于表达水平较高的转录本，优先在第一轮染色中使用Fast染料。这样还有一个优势：可以在后续的BCIP/NBT染色过程中及时观察并终止反应，避免紫蓝色信号相对于较浅的Fast染料信号变得过深。因此，在标准的双色实验中，通常首先使用Fast Red检测表达较强的mRNA，然后使用BCIP/NBT检测较弱的mRNA。作为Fast染料的替代方案，也可使用黄色的INT底物组合，但其产生的沉淀物随时间推移会变得弥散。因此，BCIP/INT仅用于最后一轮染色。相应地，在三色实验中，我们通常依次使用Fast Red、BCIP/NBT（或Fast Blue），最后使用一种INT底物组合。需要注意的是，使用INT染色时应尽快拍摄染色后的胚胎样本。
偶氮染料的荧光检测
当较深颜色的沉淀掩盖了较浅颜色时，有时很难识别重叠的表达模式。例如，强显色的BCIP/NBT沉淀可能遮蔽较浅的快红染料信号。解决此问题的一种方法是在每次染色后立即采集图像，然后在下一轮检测前去除已施加的有色沉淀。在此情况下，醇溶性偶氮染料（快红）和INT沉淀分别在第一轮和第二轮检测后通过乙醇洗涤去除，而BCIP/NBT染色则作为最后一个碱性磷酸酶底物使用26。另一种方法是利用偶氮染料的荧光特性。快红可使用罗丹明滤光片组进行观察27，而快蓝则可用远红滤光片检测28,29。对显色图像与荧光图像进行比较或叠加，可揭示共分布位点。采用该方法时，必须及时终止BCIP/NBT信号的显色过程，以避免沉淀过密而淬灭偶氮染料反应产物的荧光信号。

原位 原位杂交（ISH）是在细胞、组织和生物体的形态学背景下检测和定位RNA转录本的标准方法 1ISH 实验产生的信号通常通过放射性、荧光和显色检测系统进行可视化。近年来，荧光原位杂交（FISH）技术取得了显著的技术进步2 显著提高了灵敏度和分辨率，使得能够在单细胞和亚细胞水平上检测和定量RNA表达，并实现单分子水平的RNA可视化 3,4虽然复杂的单分子荧光原位杂交技术被用于更专业的应用领域，但显色原位杂交作为一种常规RNA检测方法被广泛使用 原位 研究和临床诊断中的检测方法。用于显色检测&#160; 利用酶促沉淀反应，在杂交位点处产生颜色对比明显的可见产物 5这种方法的优势在于，RNA 的可视化可与常规组织学染色相结合，且通过标准明场显微镜即可直接观察到形态学背景。此外，所使用的多种显色底物可产生在有机和/或水性封片介质中稳定的沉淀物，因此可获得永久性的样品制备。 5.
在 果蝇，最初的原位杂交（ISH）方案采用放射性同位素标记的探针在切片样本上检测转录本 6尽管从组织切片中难以重建整个胚胎或器官系统的完整转录图谱，但通过使用非放射性标记探针的显色原位杂交（ISH）技术，可以在整体标本中全面检测RNA的分布情况。 7尽管存在多种染色原位杂交的变体，但在典型的整体染色原位杂交中 原位 杂交（WISH）方案中，通过与报告酶偶联的抗半抗原抗体检测杂交的半抗原标记探针，并利用沉淀型显色剂对mRNA转录本进行可视化。
报告酶碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（POD）和β-半乳糖苷酶（GAL）所产生的不同颜色沉淀物，使得在同一份样品中可特异性地同时检测多个靶标8-14。然而，POD的酶活性持续时间较短，而GAL的比色反应灵敏度相对较低，因此在缺乏额外（酪胺）信号放大技术15的情况下，使用这些酶检测丰度较低的转录本具有挑战性。相比之下，AP具有持久的酶活性，可实现长时间的底物转化，并获得较高的信噪比。因此，利用AP报告酶结合不同颜色的底物进行依次检测，已被证实可有效且特异地在单个胚胎中同时检测多达三种不同的转录本10-12,16。
对于这种多靶标显色WISH（MC-WISH）方法（图1) 14，通过生成标记的反义RNA探针 体外 转录产物并用一种可用的半抗原标签进行标记。胚胎经甲醛固定后，通过甲醇处理和蛋白酶K消化进行通透。将胚胎与最多三种不同标记的、分别针对不同基因的反义RNA探针同时进行杂交。通过严谨性漂洗去除未结合的探针后，每种半抗原标签在独立的检测轮次中分别显色。单轮检测包括将胚胎与偶联碱性磷酸酶（AP）的抗半抗原抗体孵育，再加入AP底物以产生局部稳定的有色沉淀，从而实现RNA的可视化。在抗体检测和染色完成后，通过低pH漂洗去除已结合的抗体-AP偶联物。在多色实验中，每轮检测使用针对不同半抗原标签的特异性抗体，并通过不同颜色的底物分别显示各转录模式。表1将胚胎置于甘油中，使用微分干涉差（DIC）光学系统的高分辨率复式显微镜进行成像。

<table><tbody><tr><td>去离子、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase 抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>无 DNase 和 RNase 的 DNase I&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP 混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>荧光素-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>生物素-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>二钠氢磷酸盐</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>盐酸&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>来自酿酒酵母的 RNA VI 型</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>羊抗生物素-碱性磷酸酶（AP）Fab 片段&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>羊抗地高辛-碱性磷酸酶（AP）Fab 片段</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>羊抗荧光素-AP Fab 片段</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>兔抗二硝基苯基-AP 抗体</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red 片剂试剂盒</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB 盐</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>萘酚-AS-MX-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>萘酚-AS-GR-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>萘酚-AS-BI-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP 溶液</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>甘油 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>通用培养箱</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; 插入式培养插件 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 15 mm 载具套件</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

为了分析胚胎发育和器官发生过程中活跃的基因调控网络，必须精确定义不同基因在空间上彼此之间的表达关系。 原位多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）可显著促进基因表达模式的即时比较，因为它能够在同一样本中以不同颜色清晰显示不同mRNA种类，从而实现高精度的基因表达区域空间关系比对，并明确特异性和重叠的表达位点。在本方案中，我们描述了一种用于比较不同基因mRNA表达模式的MC-WISH实验流程。 果蝇 胚胎。最多三种RNA探针（每种针对不同基因，并用不同的半抗原标记）可同时与胚胎样品进行杂交，随后通过基于碱性磷酸酶的比色免疫组织化学方法进行检测。此处详细描述了该操作流程。 果蝇，但同样适用于斑马鱼胚胎。

本方案可实现多种转录本模式的多色同时可视化。多重荧光原位杂交（MC-WISH）的优势在于能够直接比较同一胚胎中不同基因的表达模式。例如，可直接比较黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）囊胚期胚胎中empty spiracles（ems）19、fushi tarazu（ftz）20和sloppy paired 1（slp1）21的表达模式，并以多种颜色色调进行可视化呈现（图4）。
可使用不同的碱性磷酸酶（AP）底物组合以获得一系列颜色对比明显的沉淀产物（表1）。由Fast Red产生的红色沉淀和由BCIP/NBT产生的紫色沉淀易于区分，因此在双色实验中最常使用（图4A）。然而，BCIP/NBT染色会迅速变为较深的颜色，若转录本存在部分共分布，则可能掩盖Fast Red的显色信号。因此，使用Fast Blue具有一定优势，其分别与NAMP、NAGP和NABP组合可生成蓝色、绿色和紫色产物（表1）。Fast Blue与NAMP组合产生浅蓝色沉淀，与相邻或重叠表达区域中的Fast Red产物易于区分，如本研究中分别以红色和蓝色显示的ems和slp1表达位点所示（图4B）。Fast Blue与NAGP组合与Fast Red染色也具有良好的对比度，因此绿色的ems表达域与红色的slp1表达位点可清晰区分（图4C）。然而，若分别使用Fast Blue NABP和Fast Red检测ems和slp1的表达位点，则所产生的紫色和红色沉淀产物较难分辨（图4D）。如上所述，Fast Red与Fast Blue NAGP易于区分，这一点可通过分别以红色和绿色显示的slp1和ftz表达结果得到证实（图4D）。
MagentaPhos 与 INT 联用可产生黄色沉淀，用于显示 ftz 的节段性表达（图 4C、E）。如分别使用 Fast Blue NAMP 和 MAG/INT 检测 slp1 和 ftz 所示，黄色沉淀与蓝色底物之间具有良好的对比度（图 4E）。然而，黄色沉淀与 Fast Red 产物之间的区分较为困难。ems 的黄色染色表达区域几乎无法与红色显示的 slp1 头部表达区分开来（图 4F）。因此，每项实验必须谨慎选择显色底物的组合。
<img alt="胚胎染色工作流程；图示杂交、抗体选择和底物使用。" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. MC-WISH 流程图。 为实现三种不同转录模式的多色可视化，在每个检测循环中可选择不同的抗体-碱性磷酸酶（AP）偶联物与显色底物组合。缩写：AP，碱性磷酸酶；BIO，生物素；DIG，地高辛；FLUO，荧光素。其他缩写请参见图 4和表 1的图注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养用微孔板组件及组装；设置包括盖子和多孔布局示意图。" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 作为胚胎载体的插入物。 (A底部配有直径为15 mm聚酯膜的插件 74 µm 网孔尺寸被用作 果蝇 胚胎载体。B将插入物组装于12孔板中，后者作为各种溶液的储液槽使用。C可选用的载体和手柄可实现对（D12 个插入片段/胚胎样本同时进行。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="载玻片制备示意图，显示盖玻片堆叠、甘油液滴及光学分析装置。" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 染色胚胎的封片。 将胚胎置于两堆盖玻片之间的一滴70%甘油中，盖玻片堆叠起到间隔物的作用。轻轻移动所覆盖的大尺寸盖玻片，有助于将封片后的胚胎调整至观察和拍照所需的方位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇胚胎中的基因表达模式；ems、ftz、slp1 染色比较；显微镜图像" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4多色可视化 mRNA 转录本 果蝇 胚胎 MC-WISH 实验示例 果蝇 胚胎显示为侧视图。mRNA 的表达模式为 空 spiracles (ems), fushi tarazu (ftz）和 sloppy paired 1 (slp1) 通过不同碱性磷酸酶（AP）显色底物组合进行可视化，各图板上已标明所用底物。转录本通过（A) ftz FLUO 和 ems DIG，（B) slp1 FLUO, ems BIO，以及 ftz DIG，（C) ems BIO slp1 FLUO，以及 ftz DIG，（D) ftz BIO slp1 FLUO，和 ems DIG，（E) slp1 FLUO, ems DIG，和 ftz BIO，（F) ftz BIO slp1 FLUO，和 ems 地高辛标记探针。单倍型标记探针按列表顺序依次通过免疫组织化学方法进行检测。缩写：FB Fast Blue；FR Fast Red tablet。其他缩写请参见图注 图1 和 表1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>底物组合</td>
			<td>加入 1 ml AP 缓冲液中的量</td>
			<td>浓度 [µg/ml]</td>
			<td>AP 缓冲液</td>
			<td>颜色</td>
			<td>信号灵敏度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP NBT</td>
			<td>3.5 µl 4.5 µl</td>
			<td>175 337.5 </td>
			<td>SB9.5</td>
			<td>紫色</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAG INT</td>
			<td>5 µl 5 µl</td>
			<td>250 250</td>
			<td>SB9.5</td>
			<td>黄色</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/INT 溶液</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>250 250</td>
			<td>SB9.5</td>
			<td>黄色</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blue NAMP</td>
			<td>5 µl 5 µl</td>
			<td>250 250</td>
			<td>SB8.2</td>
			<td>蓝色</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blue NABP</td>
			<td>20 µl 10 µl</td>
			<td>1,000 500</td>
			<td>SB8.2</td>
			<td>紫色</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blue NAGP</td>
			<td>10 µl 10 µl</td>
			<td>500 500</td>
			<td>TT8.2</td>
			<td>绿色</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Red NAMP</td>
			<td>1 片</td>
			<td>1,000 400</td>
			<td>TT8.2</td>
			<td>红色</td>
			<td>++</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 底物组合。 缩写：+++，强；++，中等；+，弱；NBT，4-硝基蓝四氮唑氯盐；BCIP，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐；INT，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯盐；MAG，Magenta-Phos，5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸盐；NAMP，萘酚-AS-MX-磷酸盐；NABP，萘酚-AS-BI-磷酸盐；NAGP，萘酚-AS-GR-磷酸盐；SB9.5，pH 9.5 的染色缓冲液；SB8.2，pH 8.2 的染色缓冲液；TT8.2，pH 8.2 的Tris-吐温缓冲液。

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇 胚胎，通过不同颜色的沉淀物实现三种不同mRNA分布模式的同时特异性检测。

为了分析胚胎发育和器官发生过程中活跃的基因调控网络，必须精确定义不同基因的表达模式及其在时空上的调控机制。

多靶点显色原位杂交（Chromogenic Multi-target WISH）的总体目标是促进在完整黑腹果蝇（Drosophila）胚胎内mRNA分布模式的绘制。通过该方法，可在同一胚胎中直接比较三个不同基因的mRNA定位。多色WISH能够以快速且可靠的方式生成发育中生物体的基因表达图谱。这可为基因调控相互作用、胚胎活性发育或器官发生提供重要线索。该技术的主要优势在于，不同基因的mRNA表达模式可被可视化为明显且对比鲜明的颜色。因此，能够高精度地突出显示独特的和重叠的表达位点。采用标准流程，收集、去壳、固定并去卵黄膜处理所需胚胎。将其保存在甲醇中，并置于冰箱中，直至使用。现在，从室温下的胚胎开始操作。将一个插入物放入12孔板的第一个孔中，并加入2毫升甲醇。将所需数量的胚胎转移至该插入物中，该插入物将在整个实验过程中承载胚胎。接下来，使用递减浓度的甲醇系列对胚胎进行再水化，每次孵育3分钟。首先使用含75%甲醇的PBS溶液，接着使用含50%甲醇的PBST溶液，然后使用含25%甲醇的PBST溶液，最后用纯PBST溶液洗涤两次。随后，在室温下用含4%多聚甲醛的PBS溶液对胚胎进行预固定，持续20分钟。用PBST溶液洗涤四次以去除固定剂。在洗涤过程中，解冻并配制蛋白酶K和甘氨酸的工作液。洗涤结束后，在室温下用新鲜配制的蛋白酶K溶液处理胚胎3分钟，以实现通透化。随后用新鲜配制的甘氨酸溶液洗涤两次，每次1分钟，以终止反应。接着，在室温下用PBS配制的4%多聚甲醛溶液对胚胎进行后固定，持续20分钟。再用PBST溶液洗涤四次，每次3分钟，以彻底清除多聚甲醛。然后，将胚胎转移至预杂交缓冲液中。如暂不使用，可将其保存在冰箱中。开始时，将预杂交缓冲液中的胚胎分配至2毫升离心管中。每管加入约15微升沉淀后的胚胎。现在，将胚胎在65°C

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

多目标显色全安装<em&gt;原位</em&gt;在比较基因表达域杂交<em&gt;果蝇</em&gt;胚胎

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

性状的表型变异可能源于顺式调控元件（CRE）序列的突变，这些突变会影响基因表达模式。在黑腹果蝇（Drosophila...

transgenic Drosophila melanogaster 中 cis-调控元件（CRE）活性的定量比较

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇...

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

学习多靶点显色全安装原位杂交技术，用于在完整果蝇胚胎中同时检测三种不同mRNA分布模式。该方法可精确比较基因表达域，为发育生物学研究提供快速可靠的基因表达图谱分析工具。

多靶标显色整体原位杂交原位杂交法用于比较基因表达区域果蝇胚胎

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