Name: 青光眼诱导在程序在体内大鼠模型和全安装视网膜准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解在大鼠模型中诱导青光眼样条件以造成视网膜神经节细胞显著丢失的方法。该技术通过高渗盐水注射至巩膜外静脉，模拟人类青光眼的渐进性神经节细胞丢失，为青光眼研究和神经保护策略提供重要实验基础。

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C. Linn 由美国国立卫生研究院（NIH NEI EY022795）资助。

所有使用动物受试者的操作均符合美国西密歇根大学动物护理与使用委员会（IACUC）的标准。
1. 动物
<ol>
	<li>本研究使用三个月龄的雄性和雌性大鼠。</li>
	<li>将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，自由获取食物和饮水。</li>
</ol>
2. 动物麻醉用KAX混合液的制备
<ol>
	<li>将50 mg的赛拉嗪（20 mg/ml）溶于5 ml的氯胺酮（100 mg/ml）中，加入1 ml的乙酰丙嗪（10 mg/ml）和3 ml蒸馏水，充分混匀。</li>
	<li>使用注射器滤器灭菌，并将此溶液储存于10 ml血清瓶中。</li>
</ol>
3. KAX 注射
<ol>
	<li>称量动物体重（g），然后放回笼中，待准备注射时取出。</li>
	<li>注射 0.1 ml&#160;KAX/100 g 动物体重，使用带 28 G 针头的 1 ml 胰岛素注射器腹腔注射&#160;针</li>
	<li>待动物完全失去意识后，通过捏压其足部和尾部检查反射反应。</li>
	<li>手术期间将所有动物安全地安置在实验室中。</li>
	<li>术后，将动物放回笼中，并在室温下保持其舒适状态&#160;直至意识恢复。只有当动物苏醒并恢复至正常行为后，方可将其送回动物房。</li>
</ol>
4. 手术准备与微针组装
<ol>
	<li>制备无菌的 2 M NaCl 溶液。</li>
	<li>使用微电极拉制仪（图 1C）将一根内径为 0.86 mm 的重抛光标准薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制成两根精细锥形的玻璃微针（图 1D、图 1E）。</li>
	<li>使用后填充注射针和 1 ml 注射器（图 1B）将上一步中的一根微针用 2 M 盐水从尾端填充。轻敲电极尖端以排出气泡。</li>
	<li>用 2 M NaCl 溶液填充第二个 1 ml 注射器。连接一根 18 G&#160;针头，然后接上一段聚乙烯管（长约 10 英寸）（图 1A）。使用注射器活塞通过针头将盐水充满聚乙烯管。</li>
	<li>当微针和管道均充满盐水后，小心地将两者连接。排除连接处之间的任何空气（图 2）。</li>
	<li>通过将微针尖端轻轻刮擦粗糙的纸巾表面，对其进行精细斜面处理。</li>
	<li>通过轻推注射器活塞，使液体在纸巾上形成细流，以此检测微针的阻抗。液流宽度不应超过 0.5 mm。</li>
</ol>
5. 动物准备
<ol>
	<li>在角膜上滴加 1 - 2 滴局部麻醉剂（盐酸丙帕卡因滴眼液，USP，0.5%），等待直至无眼部反射出现。</li>
	<li>用剪刀修剪胡须。</li>
	<li>用棉签蘸取聚维酮碘溶液，擦拭实验眼周围区域。</li>
	<li>在显微镜下，使用止血钳夹住下眼睑，使眼球突出，暴露巩膜静脉并限制眼球运动。（图 3，箭头所示）</li>
</ol>
6. 诱导青光眼的盐水注射
<ol>
	<li>当微针组件和动物准备就绪后，开始注射。</li>
	<li>当确认动物对足部/尾部夹捏无反应时，以与静脉呈10至20度的低角度小心刺入巩膜上静脉（图3，白色箭头）。当血液进入微针尖端时，表明已成功穿刺入静脉（图3，黑色箭头）。</li>
	<li>手动缓慢地向静脉内注射约50 µl生理盐水。此过程应持续约10秒。随着盐溶液在血管系统中循环，静脉将变为苍白色（图4，箭头）。部分区域可能仍保持鲜红色（图4，箭头）。
	<ol>
		<li>在与第一次注射位置相对的一侧再次向静脉注射一次，以确保视网膜整体受损，累及全部视网膜神经节细胞层。 
		注意：数分钟内，随着盐溶液在血管系统中循环，应可通过瞳孔观察到明显浑浊的外观。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对侧眼不做处理，作为内部对照使用。</li>
</ol>
7. 动物恢复
<ol>
	<li>移除止血钳。</li>
	<li>使用棉签将三重抗生素软膏（杆菌肽锌、硫酸新霉素、硫酸多黏菌素B）&#160;涂抹于止血钳夹住的部位及注射部位。使用止血钳不会导致眼部周围组织损伤。</li>
	<li>&gt;将麻醉后的动物置于配备循环温水毯的笼子中，以防止低体温。&#160;持续观察动物，直至其恢复意识和正常行为。将已清醒的动物送回动物饲养群。动物将在饲养群中饲养至处死时间点。</li>
</ol>
8. 动物安乐死与视网膜摘除
<ol>
	<li>在诱导青光眼手术后一个月，通过 CO₂ 窒息法处死动物2 窒息及继发性胸腔穿刺。&#160;
	<ol>
		<li>将动物放入舱内，并牢固盖上盖子。</li>
		<li>打开 CO2 以及允许20%体积/分钟CO的气体调节阀2 移位 腔室中的氧气。</li>
		<li>让动物存留 4 到 5 分钟以确保死亡。</li>
		<li>关闭两个阀门。</li>
		<li>将动物从舱中取出，使用无菌手术刀进行二次胸腔穿刺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死后，使用解剖刀小心切开眼球周围眼眶内的结缔组织，注意不要切到眼球本身。</li>
	<li>使用弯头剪刀小心剪断视神经及任何残留组织，以完整摘出眼球。将摘出的眼球置于含有新鲜PBS的无菌60 mm × 15 mm一次性培养皿中。</li>
	<li>从眼球制备眼杯。操作时，在虹膜与巩膜交界处稍靠后的位置用手术刀做一小切口，随后用小型弹簧剪沿眼球周缘继续剪开，以移除角膜半球，保留与视神经相连的半球部分。</li>
	<li>从安乐死动物的眼杯中找到内部极薄的粉红色/米色视网膜。用钝头镊子夹住视网膜的色素层以固定眼杯。用另一对闭合的镊子轻轻剥离整个完整的视网膜，使其脱离眼球后壁。避免直接夹捏、牵拉或拽动视网膜。</li>
	<li>使用小型弹簧剪刀剪下视神经仍与视网膜相连的区域。</li>
	<li>务必从视网膜上切除任何残留的色素上皮或巩膜组织。</li>
	<li>使用移液管将分离的视网膜极其轻柔地转移至洁净的、涂有硅胶的35 mm × 10 mm培养皿中，培养皿内含新鲜的PBS。</li>
</ol>
9. 视网膜全层铺片制备
<ol>
	<li>将视网膜置于Sylgard培养皿中后，使用镊子和一根仙人掌针将其固定。保持视网膜神经节细胞层朝上，视神经朝下。即使经过固定，视网膜的半球形结构仍清晰可见；当视网膜神经节细胞层处于理想方向时，其曲率会向上（朝向天花板）卷曲。</li>
	<li>使用小型剪刀从视神经乳头处开始，将视网膜切成四个象限，形成类似四叶草的放射状结构。</li>
	<li>用额外的仙人掌针将视网膜的四个象限固定，尽可能展平视网膜，但避免拉伸（图5）。</li>
	<li>在室温下，用3 ml的4%多聚甲醛固定Sylgard培养皿中已固定的视网膜，过夜&#160;。</li>
</ol>
10. 视网膜抗体染色
注意：使用一抗和二抗对固定后的视网膜进行染色，以观察视网膜中的神经元（图6）。
<ol>
	<li>用 PBS 将固定后的平铺视网膜冲洗三次，每次 2 分钟。</li>
	<li>用含1% Triton X-100和1%胎牛血清的PBS溶液对视网膜进行通透处理，持续60分钟。</li>
	<li>用 PBS 冲洗视网膜三次，每次 2 分钟。</li>
	<li>用含0.1% Triton X-100的PBS冲洗两次，每次5分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 PBS 中加入 1% Triton X-100 和 1% 胎牛血清，室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>用含0.1% Triton X-100的PBS缓冲液冲洗两次，每次5分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将每片视网膜在含有3 ml 1%胎牛血清的PBS中，加入纯化的鼠抗大鼠CD90/小鼠CD90.1抗体（1:300稀释），于室温孵育过夜。</li>
	<li>用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 冲洗视网膜一次，5 分钟。</li>
	<li>用 PBS 冲洗两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将每片视网膜在含有3 ml PBS（不含FBS）的溶液中孵育，加入Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG（1:300），4℃过夜。</li>
	<li>用 PBS 充分清洗视网膜。</li>
	<li>在解剖显微镜下，小心地从视网膜上移除仙人掌针。</li>
	<li>用移液管将视网膜轻柔转移至载玻片上。确保保持视网膜节细胞层朝向天花板的方向。即使在固定后，视网膜仍明显呈半球形；当视网膜节细胞层处于正确朝向时，视网膜的曲率会向上方（朝向天花板）卷曲。</li>
	<li>用 KimWipe 或其他吸水材料吸去多余的 PBS，注意不要吸到视网膜。</li>
	<li>加入5滴 &#189; 甘油和 &#189; 以 PBS 按重量配制作为封片介质。</li>
	<li>用盖玻片覆盖视网膜，避免产生气泡。</li>
	<li>使用透明指甲油、胶水或其他粘合剂固定盖玻片。</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突或竞争利益。

本方案描述了一种在动物模型中诱导青光眼样病变的方法 体内 大鼠模型。该操作通过注射高渗盐水在小梁网中诱导瘢痕形成 29, 32瘢痕组织的形成会阻塞房水流出，导致前房压力升高。随着房水流出减少和压力积聚，由弹性韧带悬挂的晶状体向后移位进入玻璃体腔。玻璃体腔内的压力继而作用于视网膜，损伤脆弱的视网膜神经元。本实验结果显示，术后2周视网膜神经节细胞数量开始减少，术后1个月出现显著的神经节细胞丢失。
本方案仅是诱导啮齿类动物青光眼的一种方法。目前已有多种实验模型可通过眼内压升高或视神经直接损伤来实现视网膜神经节细胞的损害30。这些方法通常最初在较大的动物中建立，随后经过改良应用于小鼠和大鼠33。通过眼内注射毒素（如星形孢菌素34和NMDA，即不可水解的谷氨酸类似物35）可诱导视网膜神经节细胞快速死亡。然而研究表明，此类毒素在小鼠中具有剂量-效应关系，且会对非靶向的其他细胞产生影响35。此外，该模型中视网膜神经节细胞的损伤远比人类青光眼的渐进性...

青光眼是一组影响视网膜神经元的疾病，特别是视网膜神经节细胞1-2。这些细胞的轴突汇聚形成视神经，将视觉信息传递至大脑，从而产生视觉感知。因此，视网膜神经节细胞及其轴突的损伤会导致视觉功能缺陷。
与青光眼疾病相关的主要特征包括视网膜神经节细胞（RGC）的退化与死亡、眼内压（IOP）升高以及视盘凹陷和萎缩。这些特征可导致视野缺损或完全且不可逆的失明。目前，青光眼已在全球范围内导致3亿人失明3。因此，它是全球第三大失明原因4。
青光眼中视网膜神经节细胞（RGC）死亡的确切机制尚不明确。目前已有大量研究致力于揭示这一谜题。然而已知的是，青光眼的主要危险因素是由于眼前房中房水（AH）循环异常导致的眼内压升高。房水在无血管的眼前房中起到透明无色的血液替代作用，可为周围细胞提供营养，清除代谢过程中产生的废物，运输神经递质，并在病理状态下允许药物和炎性细胞在眼内循环1。
房水循环的维持涉及睫状体和小梁网。房水由睫状体产生，随后流入前房，以维持眼内组织的整体健康。当液体流经睫状肌内的三层海绵状组织时，75%至80%的房水通过非色素性睫状上皮主动分泌排出。液体经小梁网和施莱姆管排出，后者将房水导入血液循环5。其余20%至25%的房水绕过小梁网，通过葡萄膜-巩膜途径以超滤和扩散方式被动排出。该途径似乎相对独立于眼内压1。
当房水的生成与流出失去平衡时，眼内压力会升高。如前所述，眼内压升高是青光眼发生的主要危险因素。这种压力会损伤眼球后部视网膜中复杂的神经元层次结构。视神经中视网膜神经节细胞轴突的损伤会导致大脑无法再接收到准确的视觉信息。因此，视觉感知逐渐丧失，最终可能导致完全失明。
迄今为止，青光眼尚无治愈方法。现有的不同治疗手段主要旨在降低眼内压。这些方法包括局部用药，如β1-肾上腺素能受体阻滞剂或局部前列腺素类似物。β受体阻滞剂通过减少房水的生成来降低眼内压7。前列腺素通过增加房水外流来降低眼压8-14。α-肾上腺素能激动剂和碳酸酐酶抑制剂也作为辅助治疗手段使用。α-肾上腺素能激动剂通过葡萄膜巩膜途径增加房水外流15-17。碳酸酐酶抑制剂通过酶抑制作用减少房水生成18。此外，也有更为侵入性的治疗方法用于青光眼的治疗。激光小梁成形术可用于增加房水外流19。另一种手术疗法称为小梁切除术，在传统的小梁通路受阻时，创建替代的引流部位以滤过房水20-21。
这些治疗方案已知可有效降低眼内压（IOP）。然而，高达40%的青光眼患者眼内压水平正常，表明需要更全面的治疗方法22,23。此外，青光眼中观察到的视网膜神经节细胞死亡一旦开始即不可逆，而目前的治疗方法无法阻止疾病进展24-28。这凸显了开发有效神经保护疗法的迫切需求，此类疗法应直接针对神经元自身的存活。青光眼模型的建立对于实现这一目标至关重要。
本研究展示了一种利用Morrison最初提出的改良方法在成年Long Evans大鼠中诱导类似青光眼效应的技术29。该方法通过向巩膜上静脉丛注射2 M高渗盐水，造成组织瘢痕化，从而减少小梁网中房水的流出，导致眼内压升高，并在手术后一个月内引起视网膜神经节细胞（RGCs）的显著丢失30-31。此类诱导青光眼的实验操作可能是推动青光眼治疗新进展的关键。

<table><tbody><tr><td>盐酸赛拉嗪，纯度至少99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液，USP，100 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml 瓶</td></tr><tr><td>马来酸乙酰丙嗪，10 mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml 瓶</td></tr><tr><td>血清瓶，10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>1 ml 胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G 针头&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M 溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>重型抛光标准薄壁硼硅酸盐毛细管&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>无灯丝，0.86 mm</td></tr><tr><td>用于填充微移液管的Microfil注射器针头</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18号鲁尔锁针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>注射器针头</td></tr><tr><td>柔性聚乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>直径0.034英寸，约10英寸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸丙帕他卡因滴眼液，USP，0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp;无菌瓶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>止血钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>弯边</td></tr><tr><td>三重抗生素软膏&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm 一次性培养皿</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x 稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>镊子（2把），Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 转移移液管，聚乙烯材质，非无菌</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 或 52947-948</td><td>1 ml 和 2 ml 刻度</td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm 易握培养皿&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>仙人掌针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 或 818715.0100</td><td>配制成4%溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温-100（Triton X-100）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>分别配制成1%和0.1%溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>纯化小鼠抗大鼠CD90/小鼠CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>货号 554892</td><td>1:300 稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠抗体&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>按重量配制成50%甘油与50% PBS混合液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>厚度1，22 × 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

青光眼是一种影响视网膜神经节细胞（RGCs）的中枢神经系统疾病。构成视神经的RGC轴突负责将视觉信号传递至大脑以实现视觉感知。RGC及其轴突的损伤可导致视力丧失和/或失明。尽管青光眼的具体病因尚不明确，但其主要危险因素是眼内压升高。在动物模型中诱导青光眼的实验方法，为研究RGC死亡机制的科研人员提供了重要工具。此类研究信息有助于开发有效的神经保护疗法，从而预防视力丧失。本文所述方案介绍了一种在动物模型中诱导类似青光眼状况的方法 体内 大鼠模型中，向巩膜上静脉丛注射 50 µl 2 M 高渗盐水。血管变白表明注射成功。该操作可导致视网膜神经节细胞（RGC）丢失，以模拟青光眼。注射后一个月处死动物并摘除眼球。随后去除角膜、晶状体和玻璃体，制备眼杯。接着用仙人掌针将视网膜从眼球后部剥离并固定在硅胶培养皿上。此时可对视网膜中的神经元进行染色分析。本实验室结果显示，与内部对照相比，术后一个月内约有 25% 的 RGC 丢失。该方法可实现对青光眼样条件下视网膜神经节细胞死亡的定量分析 体内 大鼠青光眼模型

本部分介绍了用于诱导青光眼样病变的装置组件及操作步骤 体内 大鼠青光眼模型。我们展示了用于进行高渗盐水注射的各类工具与设备，该注射可导致眼内压升高。我们展示了向巩膜上静脉丛注射时出现的特征性褪色现象以及随之产生的前房混浊外观。我们还描述了视网膜剥离与平铺制备的过程，以便分析丢失的视网膜神经节细胞（RGCs）。最后，我们展示了注射对视网膜神经节细胞存活的影响。由于RGCs在大鼠视网膜不同区域的分布不均，图像从四个 200 µm2 视网膜上每个区域位于视神经乳头中心外4 mm处。对实验组和对照组视网膜切片中Thy 1.1标记的视网膜神经节细胞（RGCs）总数进行计数、取平均值并比较 31采用该方法，视网膜神经节细胞计数从对照未处理条件下每张图像平均225个，下降至诱导青光眼样条件后一个月的168个（N = 30）。综上所述，本文所述步骤可按顺序操作，用于分析视网膜神经节细胞胞体及其轴突的死亡情况。
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青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法

青光眼是一种影响视网膜神经节细胞（RGCs）的中枢神经系统疾病。构成视神经的RGC轴突负责将视觉信号传递至……

本实验的总体目标是通过诱导类似青光眼的条件，在大鼠视网膜中造成显著的视网膜神经节细胞丢失。该方法有助于解答青光眼及神经保护领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够引起视网膜神经节细胞的渐进性丢失，类似于人类青光眼中所观察到的病理过程。开始此操作时，使用微电极拉制仪从一根壁薄且经过重抛光的标准硼硅酸盐玻璃管中拉出两根精细锥形的玻璃微针。然后，用1毫升注射器将其中一根微针回填入2摩尔的生理盐水。轻敲电极尖端以排出其中的气泡。接着，用另一个一毫升注射器吸取两摩尔的 NaCl 溶液。将其连接至18号针头，然后将针头连接到10英寸的聚乙烯管上。使用注射器活塞通过针头将生理盐水充满聚乙烯管。当微针和导管均充满生理盐水后，小心地将两者连接。通过轻敲排除连接处的气泡，以消除其中的空气。然后，将微针尖端轻轻在纸巾上刮擦，以精细修整其斜面。用注射器推动微针的推杆，轻轻按压，直至在纸巾上观察到细小的液流，以检查微针的阻力。液流宽度不应超过0.5毫米，以确保针尖具备适当的完整性。在本操作中，使用KAX混合麻醉剂对动物进行麻醉后，通过轻捏其足部或尾部检查反射反应，以确认动物已处于无意识状态。然后，用剪刀修剪胡须。接着，将棉签浸透聚维酮碘溶液，擦拭实验眼周围区域。在显微镜下，使用止血钳夹住下眼睑底部，使眼球突出，暴露巩膜上静脉，并限制眼球运动。接下来，以微针与巩膜上静脉呈10至20度角的方向，小心刺入该静脉。当观察到血液进入微针尖端时，表明穿刺静脉成功。随后缓慢向静脉内注射50 µL生理盐水。随着盐溶液流经血管，血管会因盐溶液的循环而呈现苍白的白色，但某些区域可能仍保持鲜红色。该操作中最关键的一步是在注射2摩尔盐水时进行的。必须确保血管内出现苍白现象，以保证操作的成功。保持针头稳定并以20度角进针是该操作的关键。随后，向静脉内进行第二次注射，以确保充分损伤视网膜神经节细胞层。数分钟内，随着盐溶液在血管系统中循环，应可通过瞳孔观察到眼内出现明显的浑浊现象。现在，使用解剖刀切割眼球周围眼眶内的结缔组织，注意不要切到眼球本身。然后，用弯头剪刀小心地剪断视神经及任何残留的组织，完整取出眼球。将取出的眼球置于含有新鲜 PBS 的无菌培养皿中。接下来，用手术刀在虹膜与巩膜交界处稍后方做一小切口，从眼球制备一个眼杯。沿眼球周长继续切开，以将角膜半球从眼球上移除。用镊子夹住视网膜的色素层以固定眼杯，再用另一把镊子轻轻将粉 beige 色完整视网膜从眼球后部剥离下来。随后，剪除或掐断视神经与视网膜相连的区域。务必去除视网膜上残留的色素上皮或巩膜组织。然后，将分离的视网膜轻轻转移至一个洁净的、涂有Sylgard的培养皿中，内含新鲜的PBS。将视网膜置于Sylgard培养皿中后，用针固定视网膜位置，保持视网膜神经节细胞层朝上，视神经朝下。接着，从视神经乳头处向外辐射，将视网膜切成四个象限，形成四叶草形状。然后，使用额外的仙人掌针将视网膜的四个象限固定，尽可能使视网膜展平但不拉伸。随后，将固定好的视网膜置于Sylgard培养皿中，加入3毫升4%多聚甲醛，在室温下固定过夜，再进行常规染色步骤。以下是接受青光眼诱导生理盐水注射一个月后，对照未处理眼与实验眼的比较。视网膜神经节细胞使用抗 Thy 1.1 抗体进行标记。该操作导致 RGC 数量减少、轴突从主轴突束上解聚，以及残余 RGC 的圆形度发生畸变。这些是盐水注射后产生的特征性轴突解聚现象。视网膜内显示了一条血管，这些是轴突束。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。在进行此操作时，务必始终使用新鲜、锋利且带有斜面的微针。采用此方法后，还可进行免疫细胞化学、蛋白质印迹、原位杂交、mRNA测序或行为学分析等其他方法，以回答与青光眼相关的其他问题，例如视网膜神经节细胞的丢失如何影响动物的视觉敏锐度。该技术建立后，为青光眼领域的研究人员探索大鼠神经保护策略铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过向巩膜上静脉注射高渗盐水，在大鼠中诱导显著的视网膜神经节细胞丢失。

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医学

青光眼诱导在程序<em&gt;在体内</em&gt;大鼠模型和全安装视网膜准备

来源： Bosco, A., et al. 神经退行性疾病中视网膜小胶质细胞活化的体内动态：小鼠青光眼中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量. J. Vis. Exp. (2015)...

在青光眼小鼠模型中对视网膜小胶质细胞的活体成像

本文所述方案用于整体视网膜标本的结构评估。内容包括组织解剖、将标本贴附于亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜插片上、通过团注方式加载荧光标记物，以及比较碳二亚胺与多聚甲醛固定在细胞和突触组分免疫组织化学分析中的应用效果。...

用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。...

大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

本文介绍一种在小鼠眼球中诱导眼压升高的实验方案，该过程可导致视网膜神经节细胞丢失，类似于青光眼中所观察到的现象。将磁性微珠注射至前房，并利用磁铁将其吸引至虹膜角膜角，以阻塞房水的流出通道。...

一种利用磁性微珠阻塞模型诱导小鼠眼压依赖性青光眼的方法

以下报告介绍了如何使用适当的染料、接触镜片和激光参数来复制非动脉炎性前部缺血性视神经病变（rNAION）的啮齿类动物模型。同时，我们还揭示了评估rNAION病灶的适当步骤 体内.

非动脉炎性前部缺血性视神经病变的啮齿类动物模型（rNAION）

本方案描述了一种利用神经递质谷氨酸在体外对大鼠全层视网膜进行化学神经刺激研究的新方法。in...

利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学 体外

我们展示了三种不同的组织制备技术，用于免疫组织化学可视化大鼠视网膜微血管周细胞， 即，...

视网膜冷冻切片、全层铺片及低渗分离血管制备用于微血管周细胞的免疫组织化学可视化

通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。...

一种通过巩膜周缝合诱导大鼠和小鼠青光眼的模型

氧诱导的视网膜病变（OIR）可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变，并可作为评估抗血管生成药物治疗新生血管疾病的概念验证研究模型。OIR...

用于啮齿类动物缺血性视网膜疾病的氧诱导视网膜病变模型

糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一。组织学、血-视网膜屏障破坏检测以及荧光血管造影是研究视网膜病理生理学的宝贵技术，这些技术可进一步提高针对糖尿病视网膜病变的高效药物筛选能力。...

大鼠模型中视网膜病理生理学评估

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。...

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

了解在大鼠模型中诱导青光眼样条件以造成视网膜神经节细胞显著丢失的方法。该技术通过高渗盐水注射至巩膜外静脉，模拟人类青光眼的渐进性神经节细胞丢失，为青光眼研究和神经保护策略提供重要实验基础。

诱导青光眼的实验操作步骤体内大鼠模型与视网膜整体装片制备

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诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

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