Name: 乳腺癌代谢调控的系统生物学雌激素受体信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 了解乳腺癌代谢调控的系统生物学方法，整合转录组、染色质组和代谢组数据，使用MCF7细胞分析雌激素受体信号通路。该技术为癌症代谢机制研究提供全局视角。

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本研究工作得到了美国农业部国家食品与农业研究所的资助，项目编号为ILLU-698-909（ZME），以及辉瑞公司（Pfizer, Inc）的资助（ZME）。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表美国农业部的官方观点。

1. RNA-Seq 样本的制备
<ol>
	<li>细胞培养与处理
	<ol>
		<li>将MCF7细胞培养于含酚红的改良MEM（IMEM）培养基中，添加10% 灭活胎牛血清（FBS）和1% 青霉素/链霉素，于37 °C、5% CO2 湿润环境中培养。 
		注：本研究全程使用相同的细胞系及细胞培养条件。</li>
		<li>在6孔板中每孔接种100,000个MCF7细胞，每种处理设三个重复。第3天更换培养基，每孔加入2 ml新鲜培养基，含或不含10-8 M E2。将培养板置于37 °C、5% CO2 湿润环境中孵育24小时。</li>
		<li>收集细胞时，向每孔加入1 ml RNA提取试剂（酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法试剂），室温孵育5分钟。用移液器吹打收集细胞裂解液，转移至1.5 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA提取
	<ol>
		<li>向1 ml细胞裂解液（步骤1.1.3）中加入200 µl氯仿，涡旋振荡10秒。室温孵育5分钟。在4 °C条件下以16,000 × g离心15分钟。离心后，小心转移上层水相至新离心管，避免扰动其他相。</li>
		<li>向含有转移后水相的新离心管中加入500 µl 100%异丙醇，通过反复倒置混匀。于-20 °C过夜孵育。在4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。可见管底形成沉淀。弃去上清液，用750 µl无RNase的70%乙醇短暂涡旋洗涤沉淀。</li>
		<li>在4 °C条件下以6,000 × g离心5分钟。弃去上清液，再于4 °C以16,000 × g离心1分钟，以收集残留乙醇。使用加样枪配合凝胶上样枪头吸除残余乙醇，将离心管倒置放置于空气中干燥10分钟。根据沉淀大小，用20–50 µl经DEPC处理的水溶解沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照说明书4使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化。依据说明书9使用基于荧光测定的检测试剂盒测定RNA浓度。 
	注：采用260 nm处的光密度（OD）值测定RNA浓度，260 nm与280 nm处OD比值用于评估样品纯度。建议使用生物分析仪（Bio-analyzer）检测RNA质量。</li>
	<li>取约0.5至1 μg纯化后的RNA用于测序。 
	注：生物技术中心将按照先前所述方法2制备测序文库，并进行双端测序。</li>
</ol>
2. ChIP-Seq 样本的制备
<ol>
	<li>细胞培养与处理
	<ol>
		<li>每10 cm培养皿中接种500,000个MCF7细胞，使用生长培养基。 
		注意：每次下拉使用16块板。第3天，移除培养基，并加入5 ml新鲜培养基，含或不含10-8 向每块板加入 M E2。在 37 °C、湿润的 5% CO₂ 条件下处理细胞 45 分钟2 大气）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>交联与细胞收集
	<ol>
		<li>向5 ml培养基中加入250 µl 37%甲醛以交联染色质，室温孵育15 min。用5 ml预冷的1x MEM洗涤细胞，终止交联。</li>
		<li>每块培养板中加入 250 µl 细胞裂解缓冲液（10 mM EDTA，50 mM Tri HCl，1% SDS，0.5% N,N-二甲基十二烷-1-胺氧化物）收集细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色质片段化
	<ol>
		<li>将细胞以30%的振幅超声处理8次，每次30秒，以达到所需的染色质片段大小。每次30秒超声处理后，将样品置于冰上冷却。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，然后小心吸取上清液，避免扰动底部的沉淀。</li>
		<li>取5 µl上清液，按照之前所述方法，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。10理想的DNA片段大小应在200-500 bp之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色质免疫沉淀
	<ol>
		<li>保存25 µl细胞裂解液作为输入样本。在50 ml离心管中，将4 ml细胞裂解液与20 ml免疫沉淀缓冲液（2 mM EDTA、100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl和0.5% Triton X）、ERα抗体（500 µl F10和500 µl HC-20）以及500 µl蛋白A和蛋白G包被的磁珠混合。4 °C旋转孵育过夜，以形成染色质-抗体复合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤与逆转交联
	<ol>
		<li>使用磁力架将磁珠吸附至磁化侧，以去除洗涤缓冲液。</li>
		<li>用 25 ml 洗涤缓冲液 I（2 mM EDTA，20 mM Tris HCl，0.1% SDS，1% Triton X，150 mM NaCl）洗涤磁珠。为在不破坏DNA-蛋白质复合物的前提下充分洗涤磁珠，应沿管壁缓慢加入 25 ml 洗涤缓冲液，然后反复倒置离心管，直至所有磁珠均匀分散于缓冲液中，不再形成沉淀。也可使用旋转仪倒置离心管。切勿涡旋震荡样品。后续步骤中均采用相同方法洗涤磁珠。</li>
		<li>用25 ml洗涤缓冲液II（2 mM EDTA，20 mM Tris HCl，0.1% SDS，1% Triton X，500 mM NaCl）洗涤磁珠。</li>
		<li>用 25 ml 洗涤缓冲液 III（1.6 mM EDTA，10 mM Tris HCl，1% NP-40，1% 脱氧胆酸钠，250 mM LiCl）洗涤磁珠。</li>
		<li>用25 ml 1×TE缓冲液（1 mM EDTA和10 mM Tris HCl）洗涤磁珠两次。</li>
		<li>用 500 µl 洗脱缓冲液（1% SDS 和 10 mM NaHCO₃）洗脱 DNA3) 然后将500 µl DNA洗脱液分装至4个管中。对于输入样品的DNA，用125 µl洗脱缓冲液进行DNA洗脱。</li>
		<li>将试管置于加热块上，65 °C孵育过夜。用铝箔覆盖加热块上的试管，以确保所有试管受热均匀。在试管上放置重物，防止试管盖打开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取
	<ol>
		<li>室温冷却离心管5分钟。使用ChIP DNA提取试剂盒从pull down样品中分离DNA，具体操作按照制造商说明书进行。
		<ol>
			<li>将洗脱缓冲液预热至 65 °C。向每管中加入 625 µl 结合缓冲液。若出现沉淀，再加入 250 µl 结合缓冲液，直至溶液澄清。</li>
			<li>将样品上样至柱中，在16,000 × g条件下离心30秒。用250 µl洗涤缓冲液洗涤样品。首次使用时请记得在洗涤缓冲液中加入乙醇。重复洗涤一次。</li>
			<li>用15 µl洗脱缓冲液洗脱DNA。将来自4个管的相同pull down的DNA合并，以获得约55 µl的DNA。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用DNA纯化试剂盒分离输入DNA。
		<ol>
			<li>将洗脱缓冲液预热至 65 °C。向每管中加入 625 µl 结合缓冲液，孵育 10 分钟。将样品加载至置于 2 ml 收集管中的层析柱上。</li>
			<li>用750 µl洗涤缓冲液洗涤样本，在16,000 x g离心1分钟。重复离心以去除残留缓冲液。将DNA洗脱至30 µl EB中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用经改良的商用荧光染料法测定DNA浓度11.
		<ol>
			<li>将20倍浓缩的TE缓冲液稀释为1倍TE缓冲液，作为稀释试剂和DNA样品的检测缓冲液。取5 µl已分离的DNA，用1倍TE缓冲液稀释至50 µl。</li>
			<li>从2 µg/ml的DNA储备液配制DNA标准品，浓度范围为0（空白）、1、10、100、1000 µg/ml。在96孔板中，每种标准品及DNA稀释样品均设置两个复孔，各加入25 µl。（建议标准品设置三个复孔。）</li>
			<li>在塑料管中用1×TE缓冲液将dsDNA试剂稀释200倍，配制工作液。用铝箔包裹工作液溶液以避光。向每个样品中加入200 µl工作液。室温孵育5分钟。用铝箔包裹板以避光。</li>
			<li>使用荧光酶标仪（激发波长480 nm，发射波长520 nm）测定样品的荧光值。绘制荧光值与DNA浓度的DNA标准曲线。根据所生成的DNA标准曲线确定样品的浓度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用qPCR验证ChIP实验
	<ol>
		<li>取2 µl分离的DNA，加水稀释至20 µl。将2.5 µl DNA稀释液、5 µl Green I PCR预混液、1 µl引物和1.5 µl无核酸酶水混合，设置三份重复的qPCR反应。</li>
		<li>使用Fast Real-Time PCR系统按照以下程序运行qPCR：第一步：95 °C 预变性60秒；第二步：95 °C 变性10秒，60 °C 退火延伸60秒，重复第二步39个循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10 ng DNA样本送至生物技术中心进行测序。 
	注意：生物技术中心将ChIP DNA按照说明制备成文库，并采用先前详细描述的方法进行单端测序2.</li>
</ol>
3. 代谢组学检测样品制备
<ol>
	<li>细胞培养与处理
	<ol>
		<li>将400,000个MCF7细胞接种至每个10 cm培养皿中，使用生长培养基。每种处理准备三个样本，每个样本使用两个培养皿以获得足够数量的细胞用于检测。第3天，吸除培养基，并向细胞中加入5 ml新鲜培养基，培养基中含或不含10-8 M E2。在37 °C、5% CO2 湿润环境中处理细胞24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本收集
	<ol>
		<li>向培养皿中加入5 ml预冷的1×PBS，轻轻倾斜培养皿数次后吸除PBS。重复洗涤两次，并在最后一次洗涤后尽可能吸净PBS。</li>
		<li>向每个培养皿中加入750 µl预冷丙酮，刮取细胞。将两个培养皿中的丙酮细胞悬液合并至一个2 ml离心管中，置于冰上。</li>
		<li>细胞计数用于归一化
		<ol>
			<li>每种处理另取两个培养皿用于细胞定量。为使细胞脱离培养皿，向每个培养皿中加入2 ml HE缓冲液（1×HBSS、10 mM HEPES、0.075% NaHCO3 和1 mM EDTA），孵育5分钟。</li>
			<li>用移液器反复吹打使细胞在HE缓冲液中充分混匀。取总共20 µl细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在送至代谢组学中心进行代谢物鉴定与定量前，将样本储存于-80 °C。采用气相色谱-质谱联用分析（GC-MS）进行检测。</li>
</ol>
4. 整合分析
<ol>
	<li>RNA-Seq 数据分析：
	<ol>
		<li>使用 FastQC 进行 FASTQ 文件质量检测：读段质量控制（http://galaxy.illinois.edu）
		<ol>
			<li>在NGS：质控与操作工具中选择FastQC：Read。从当前历史记录中上传原始数据文件。 
			注意：建议为输出文件命名一个标题，以便提醒自己该任务的内容，因为可能会有多个输出结果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>执行后，输出文件将显示在历史记录中。对每个序列文件重复相同步骤。使用NGS:FASTX Toolkit中的Clip功能去除接头。</li>
		<li>使用 Tophat2 将测序读段比对至 hg19 参考基因组，并采用 RefSeq 基因组参考注释12 （默认值）
		<ol>
			<li>在NGS：RNA分析工具中选择Tophat2。指明文库配对类型（单端与双端）。</li>
			<li>上传当前历史记录中的输入FASTQ文件。选择参考基因组。使用默认设置，或使用完整参数列表进行修改。</li>
			<li>执行后将生成两个输出文件：一个是剪接位点的 UCSC BED 轨道文件；另一个是 BAM 格式的读段比对列表。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将BAM文件上传至测序数据分析工具。使用定量分析工具计算表达值。</li>
		<li>使用表达分析工具，采用默认值和倍数变化，鉴定差异性上调的基因 &#62;2 和 p值 &#60;0.05。同样，使用表达分析工具（Expression Analysis Tool）并采用默认值和倍数变化来鉴定差异性下调的基因 &#60;0.5 和 p 值 &#60;0.05.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ChIP-Seq 数据分析：
	<ol>
		<li>使用 Bowtie2 将 FASTQ 读段比对至 hg1913 Galaxy 中的默认值
		<ol>
			<li>在NSC：比对工具中选择Bowtie2。确认文库是否为双端测序（单端 vs 双端）。从当前历史记录中上传FASTQ文件。</li>
			<li>选择参考基因组。使用默认参数设置。执行后将生成包含比对序列读段的 BAM 格式输出文件。对每个序列文件重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 MACS 鉴定峰14 p 值阈值为 6.0e-7，FDR 为 0.01，如前所述2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代谢组学数据分析：
	<ol>
		<li>将代谢物的化学名称转换为 KEGG_ID。</li>
		<li>通过比较对照组与处理组中检测到的代谢物水平，鉴定差异调控的代谢物. E2 处理的样本（本研究中采用 2 倍截断值）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整合分析：
	<ol>
		<li>使用测序数据分析工具鉴定具有ERα结合位点的基因。采用20 kb作为距离阈值，通过“区域到基因”功能将结合区域关联至相应基因。</li>
		<li>利用倍数变化从RNA-Seq数据分析中鉴定差异上调和下调基因 &#62;2 和倍数变化 &#60;0.5，分别与 p值 &#60;以0.05作为阈值，通过维恩图比较分析与ERα结合位点相关基因列表。</li>
		<li>使用此列表通过 Metscape 鉴定受 E2 调控的代谢通路15 Cytoscape 模块
		<ol>
			<li>在应用中选择 Metscape 模块，点击构建网络，然后选择基于通路的选项。</li>
			<li>选择生物体（人类）。选择E2非调控化合物列表（KEGG ID）数据文件，以及E2上调基因列表。</li>
			<li>选择“化合物-反应-酶-基因”作为网络类型。选择化合物/基因作为查询对象。</li>
			<li>构建网络。使用E2下调的化合物和基因重复上述步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+hormone+physiology%3A+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta%2C+and+their+coregulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676(2013).</li>
<li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+%28ERalpha%29+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001(2014).</li>
<li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436(2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription%2C+actin+reorganization%2C+and+invasiveness+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+PicoGreen+%C2%AE+dsDNA+Reagent+and+Kits%22">Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049">http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049</a> (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+Assays+for+high-throughput+quantitation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+oligos%22">Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf</a> (2006).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+%28GCAT%29+benchmarks%5BTitle%5D)+AND+%22BioData+Min%22%5BJournal%5D)">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metscape%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092(2010).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-regulated+transcriptomes%3A+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li>
</ol>

伊利诺伊大学获得了辉瑞公司资助的研究人员发起的科研项目经费。ZME 和 YCZ 的薪酬由该项经费支持。

本文中，我们描述了对经雌二醇（E2）处理的 MCF-7 细胞进行 RNA-Seq、ChIP-Seq 和代谢组学数据的生成及整合分析。我们建立了一套实验方案，策略性地采用最高效的方法和用户友好的软件，以获得具有生物学意义的发现。据我们所知，本研究是首个整合三种不同组学分析数据，并鉴定出由雌激素受体 α（ERα）在乳腺癌细胞中直接调控的新型代谢通路的研究。
转录组学 
高质量的RNA是成功进行转录组分析的关键。良好的实验操作可避免RNA降解，包括创建无RNase的实验台面、频繁更换手套以及在-80℃保存样品。 &#176;C，并在使用时保持在冰上。添加于-20℃过夜孵育 &#186;C 可提高 RNA 回收率。为避免 RNA 反复冻融，可在 RNA 分离与纯化后即分配用于下游实验。由于测序可能存在错误，通常需利用样本的 cDNA 进行 qRT-PCR，以验证 RNA-Seq 鉴定出的差异表达基因，因此应保留足够的 RNA 用于此目的。我们采用双端测序，以便分析剪接变异体、非编码 RNA 和 miRNA。为降低测序成本，也可选择单端测序。与基因芯片相比，RNA-Seq 更为灵敏...

雌激素是调控两性多种生理过程的重要调节因子，包括生殖组织、代谢组织、大脑和骨骼1。除了在这些组织中发挥有益作用外，雌激素还促进起源于乳腺和生殖组织的癌症发展。雌激素主要通过雌激素受体（ERs）发挥作用，诱导细胞类型特异性的效应。利用RNA-Seq对ERα调控的转录本进行深度测序，并结合ChIP-Seq分析全基因组范围内ERα的DNA结合位点，已被证明有助于理解ERα在不同组织及其相关癌症中的作用机制。我们及其他研究者已发表与不同受体（ERα与ERβ）2,3、不同配体3-5以及不同共调节因子2,4,6,7相关的基因表达谱。
RNA-Seq 是研究转录组的主要方法，与基于微阵列的基因表达分析相比，具有更高的精确度和效率8。从细胞系2-4,7、组织或肿瘤样本中提取的 RNA 经过测序后，比对到现有的基因组组装序列上，从而鉴定出差异表达的基因。染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于解析转录因子和共调节因子在已知调控结合位点上的染色质结合情况。ChIP-Seq（即染色质免疫沉淀后接高通量测序）可无偏倚地检测全基因组范围内的结合位点。代谢组学是另一种日益广泛应用的系统生物学方法，用于定量测量活体系统对各种刺激（包括化学物质和遗传扰动）产生的动态多参数响应。
通过进行全局代谢谱分析，可以从细胞、组织和血液中获得功能性的读出结果。此外，转录组实验获得的信息并不总能反映参与生物化学通路的酶的实际水平变化。转录组与代谢组数据的联合分析使我们能够识别基因表达变化与实际代谢物变化之间的关联并建立联系。整合利用这些大规模数据集所提供的信息，可揭示转录因子在调控复杂生物系统中的作用机制，特别是与人类发育以及癌症、糖尿病等疾病相关的过程。
哺乳动物基因组的复杂性使得整合和全面解读转录组、顺式调控组和代谢组实验所获得的数据具有挑战性。识别能够导致靶基因表达变化的功能性结合事件非常重要，因为一旦确定了功能性结合位点，后续的分析（包括转录因子（TF）基序分析）就可以更准确地进行，从而有助于鉴定出具有生物学意义的转录因子级联反应及其调控机制。此外，RNA-Seq与ChIP-Seq实验的直接比较并不总是可行的，因为每种实验的数据在尺度和噪声水平上存在差异，某些情况下有意义的信号可能被群体噪声所掩盖。据我们所知，目前尚无研究整合这三种独立但相互关联的方法来理解ERα在乳腺癌中对代谢的直接调控作用。因此，本文的总体目标是将有效的结合事件与基因表达及代谢物变化关联起来。为实现这一目标，我们整合了RNA-Seq、ChIP-Seq和代谢组学实验的数据，鉴定出由雌激素诱导的ERα结合事件，这些事件可导致代谢通路中基因表达的变化。我们首次提供了一整套完整的实验方案（图1），用于生成ChIP-Seq、RNA-Seq和代谢组学图谱，并对数据进行整合分析，以揭示调控乳腺癌细胞系代谢的新基因调控回路。

<table><tbody><tr><td>甘油三酯混合物</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>油酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>油酸-水溶性粉末&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>生命技术&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>输入样品的DNA提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA 纯化 &amp;和浓缩器</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA检测试剂盒</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA纯化</td></tr><tr><td>DEPC 处理水&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>无DNase/RNase</td></tr><tr><td>Model 120 超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>使用1/8探针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific 隔音罩</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>用于降低噪音</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf 离心管 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 个管子（每袋 100 个，共 2 袋）</td></tr><tr><td>随机引物混合物&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP 混合液</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV 逆转录酶</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>罗氏</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% 琼脂糖凝胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 检测试剂盒</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA定量（100次检测）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂&amp;nbsp;</td><td>罗氏&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>每片可配制10 ml裂解缓冲液</td></tr><tr><td>PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合片剂</td><td>罗氏&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>每片可配制10 ml裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Qubit 检测试剂盒</td><td>生命技术公司&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>用于100次检测</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 多功能酶标仪&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>快速实时荧光定量PCR系统</td><td>应用科学&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

乳腺癌中雌激素受体信号通路调控代谢的系统生物学

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

随着组学技术的发展，我们对癌症和代谢综合征等慢性疾病的理解得到了提升。然而，有效挖掘从基因表达微阵列、深度测序实验或代谢谱分析中获得的大规模数据集中的信息，对于揭示并有效靶向调控疾病细胞表型的关键因子至关重要。雌激素受体α（ERα）是一种主要的转录因子，调控着对雌激素响应性乳腺癌至关重要的基因程序。为了理解ERα信号通路在乳腺癌代谢中的作用，我们利用了经雌二醇处理的MCF-7细胞的转录组、染色质结合组和代谢组数据。本报告中，我们描述了用于RNA-Seq、ChIP-Seq和代谢组学实验的样本制备方法，以及对所得数据进行的整合性计算分析。该方法有助于阐明由特定转录因子调控的、影响正常或病变细胞代谢的新型分子机制和基因调控回路。

转录组学 
为了分析E2处理引起的差异表达基因，我们选择进行RNA-Seq实验。除了提供mRNA水平的信息外，RNA-Seq数据还可用于监测非编码RNA（长链非编码RNA、微小RNA）以及可变剪接事件的变化。我们未提供关于非编码RNA或可变转录基因的分析信息，因为本研究的重点是鉴定在代谢调控中起重要作用的蛋白质编码基因。然而，RNA-Seq是获取基因差异表达信息的极佳方法。
为了获得高质量的测序读长，获取高纯度的RNA至关重要。在提取RNA后，我们使用RNA纯化试剂盒对RNA进行了纯化。然而，此过程几乎会损失近50%的RNA，因此在纯化步骤结束时，应充分考虑起始RNA的量，以确保获得所需的RNA量（100–500 ng）。
我们使用荧光计RNA HS检测法对RNA得率进行定量，该方法非常准确，是低丰度RNA定量的首选方法。接下...

整合全基因组测序实验与代谢组学实验的数据具有挑战性。本文首次报道了对经雌二醇处理的乳腺癌细胞的转录组、顺式调控组和代谢组数据的生成、分析及整合。

随着组学技术的出现，我们对癌症和代谢综合征等慢性疾病的理解已得到提升。然而，有效的……

本实验的总体目标是利用全基因组转录组、系统组和代谢组数据，理解雌激素受体α（ER Alpha）在乳腺癌中的直接代谢调控机制。该方法有助于回答核受体和癌症生物学领域中的关键问题，例如特定转录因子在调控代谢以促进细胞侵袭性方面的作用。该技术的主要优势在于能够全面揭示基因及其所介导的代谢调控的细微特征。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Yiru Chen 演示。按照文本方案培养 MCF7 细胞后，向每个孔中加入 1 毫升 RNA 提取试剂，室温孵育 5 分钟以收集细胞。使用移液器收集细胞裂解液，并将其转移至 1.5 毫升离心管中。为了分离RNA，向1毫升细胞裂解液中加入200微升氯仿，涡旋振荡10秒。室温孵育5分钟后，在4°C条件下以16,000 × g离心15分钟。离心后，小心将上层水相转移至新离心管中。向水相中加入 500 µL 100% 异丙醇，通过倒置混匀。然后在 -20 °C 下孵育过夜。次日早晨，在 4 °C 条件下以 1600 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，加入750 µL无RNase的70%乙醇，短暂涡旋。将样品在6,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。然后，移除上清液，再将样品在16,000 × g、4 °C条件下离心1分钟。使用凝胶加样枪头移液去除残留乙醇，将离心管倒置，室温晾干10分钟。随后加入20至50微升DEPC水溶解沉淀，按照文本方案纯化并定量RNA。按照文本方案培养 MCF7 细胞后，向细胞中加入 5 毫升培养基和 250 微升 16% 多聚甲醛，以交联染色质，并在室温下孵育 15 分钟。然后使用 5 毫升预冷的 1× 缓冲液洗涤细胞，终止交联反应。每块培养板用 250 微升细胞裂解缓冲液收集细胞。然后，为了将染色质打断至所需大小，以30的振幅对细胞进行超声处理，每次30秒，共8次。每次30秒超声处理后，将样品置于冰上冷却。接下来，将样品在4°C、16,000 × g条件下离心10分钟，随后小心吸取上清液，避免扰动管底的沉淀。取5 µL上清液加入1%琼脂糖凝胶中，进行电泳以确定DNA片段大小。理想片段长度应在200至500个碱基对之间。为进行染色质免疫沉淀，需保留25 µL细胞裂解液作为输入样本。然后，在一个50毫升离心管中，将4毫升细胞裂解液与20毫升免疫沉淀缓冲液（IP缓冲液）、ER Alpha抗体以及蛋白A和蛋白G包被的磁珠混合。在4摄氏度下旋转孵育过夜，以促进染色质-抗体复合物的形成。根据文本方案，使用洗涤缓冲液洗涤磁珠后，向磁珠中加入500微升洗脱缓冲液，并将DNA洗脱至4个离心管中。对于DNA输入样品，用125微升洗脱缓冲液进行洗脱。接着，将离心管放入加热块中，并用铝箔覆盖，在上方放置一个重物以防止管盖打开。在65摄氏度下孵育过夜。使用ChIP DNA提取试剂盒从拉下样品中分离DNA时，将离心管在室温下冷

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乳腺癌代谢调控的系统生物学雌激素受体信号

本视频介绍了一种用于代谢物分析的乳腺癌细胞样本制备技术。乳腺癌细胞经雌二醇处理后，雌二醇会与雌激素受体α结合，从而引起代谢物组成的变化。...

代谢组学样品制备：用于代谢物谱分析的细胞样品制备方法

本视频介绍了一种基于细胞的报告基因检测方法，用于测定植物来源化合物的雌激素活性。具有类似雌激素活性的化合物可模拟雌激素与雌激素受体结合，从而启动下游报告酶基因的转录。该报告酶在反应中产生生物发光，指示化合物的雌激素活性。...

植物雌激素雌激素活性筛选的雌激素受体-报告基因活性检测

雌激素和微小RNA（microRNA）的分子信号转导在乳腺癌的发生和发展中至关重要。雌激素可激活作为转录因子的雌激素受体。许多转录因子能够调控微小RNA的表达，而受雌激素调控的微小RNA可通过多种高通量技术进行表达谱分析。...

乳腺癌细胞中雌激素调控的microRNA分析

一种用于研究激素在人类乳腺中作用的ex vivo模型

临床上，绝经期女性雌激素缺乏可能加剧脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生。我们通过双侧背部外侧切口行双侧卵巢切除术，在apoE-/-小鼠中建立了体内雌激素缺乏模型。该小鼠模型可用于筛选绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。...

一种用于筛选绝经后心血管功能障碍外源性雌激素治疗的体内雌激素缺乏小鼠模型

我们优化了一种市售的雌激素受体β报告基因检测方法，用于筛查人类和非人灵长类动物食物中的雌激素活性。通过验证已知具有雌激素活性的人类食品大豆呈强阳性反应，而其他食物无活性，证实了该检测方法的有效性。...

利用基于细胞的雌激素受体β报告基因检测法筛选植物雌激素

本方案描述了一种利用现成材料和原代人乳腺组织构建体外微生理系统以研究乳腺癌的方法。...

使用微生理系统在人乳腺组织中建立乳腺癌模型

本实验方案描述了一种全面的策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移方面的药理作用及其作用机制。...

探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

在骨转移的发病机制中，血管生成是一个关键过程，因此成为成像与治疗的重要靶点。本文介绍一种部位特异性的乳腺癌骨转移大鼠模型，并描述了用于无创成像血管生成的策略 体内...

利用磁共振成像、容积计算机断层扫描和超声在乳腺癌骨转移裸鼠模型中进行血管生成的多模态成像

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内...

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

了解乳腺癌代谢调控的系统生物学方法，整合转录组、染色质组和代谢组数据，使用MCF7细胞分析雌激素受体信号通路。该技术为癌症代谢机制研究提供全局视角。

乳腺癌中雌激素受体信号通路调控代谢的系统生物学

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