Name: 体内碱性彗星试验和酶修饰碱性彗星试验测量DNA链断裂和DNA氧化损伤大鼠肝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习体内碱性彗星试验和酶修饰碱性彗星试验，用于在大鼠肝脏中同时检测DNA链断裂和氧化损伤。该方法灵敏、经济，适用于监管安全评估和癌症研究。

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本工作由美国食品药品监督管理局资助。我们承认 CPA 研究的原始出版物由爱思唯尔有限公司发表：Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG。醋酸环丙孕酮处理的 F344 大鼠基因毒性性别特异性剂量反应分析。《突变研究》774: 1-7, 2014（PMID: 25440904）

伦理声明：涉及动物的实验程序已获得美国食品药品监督管理局/国家毒理学研究中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
注意：此处所述的研究设计基于日本替代方法验证中心（JaCVAM）为其验证工作所制定的方案 在体 啮齿类动物碱性彗星试验18，并根据经合组织指南TG489中的建议进行了进一步修改19.
1. 准备
<ol>
	<li>载玻片制备
	<ol>
		<li>将普通熔点琼脂糖用磷酸盐缓冲液（不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）配制成 1%（w/v）溶液，在微波炉中加热溶解。</li>
		<li>将熔化的 1% 标准琼脂糖溶液置于 55 °C 水浴中，使其温度与水浴平衡。将玻璃载玻片浸入琼脂糖溶液中，取出后沥去多余琼脂糖，并用纸巾擦净载玻片背面。将载玻片垂直放置于平坦表面上，在室温下干燥；干燥后储存于干燥处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>彗星试验溶液的制备
	<ol>
		<li>制备 0.5% 低熔点琼脂糖溶液。将低熔点琼脂糖用磷酸盐缓冲液（不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）在微波炉中加热溶解。在制备彗星载玻片期间，保持溶液温度在 37–45 °C；使用后废弃剩余琼脂糖溶液。</li>
		<li>配制裂解缓冲液。将乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA 二钠，Mr 372.24 g/mol）配制成 100 mM 溶液，加入氯化钠（NaCl，Mr 58.44 g/mol）至终浓度 2.5 M，三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱，Mr 121.14 g/mol）至终浓度 10 mM，溶于纯水中，并用 10 N 氢氧化钠溶液（NaOH，Mr 40 g/mol）调节 pH 至 10。在使用当天，向溶液中加入 Triton X-100 和二甲基亚砜（DMSO，Mr 78.13 g/mol），使其终浓度分别为 1% 和 10%，并在 4–10 °C 下搅拌至少 30 分钟后使用。</li>
		<li>在使用当天新鲜配制酶反应缓冲液。将 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES，Mr 238.3 g/mol）配制成 40 mM 溶液，加入氯化钾（KCl，Mr 74.55 g/mol）至终浓度 100 mM，EDTA 二钠至终浓度 0.5 mM，牛血清白蛋白（BSA，Mr 66,463 g/mol）至终浓度 0.2%，溶于纯水中。用 10 N 氢氧化钾溶液（KOH，56.1 g/mol）调节 pH 至 8.0。在室温下搅拌，并在使用前确认所有成分完全溶解。</li>
		<li>配制碱性缓冲液：将氢氧化钠（NaOH）配制成 300 mM 溶液，EDTA 二钠配制成 1 mM 溶液，溶于纯水中。在使用前于 4–10 °C 下搅拌至少 30 分钟。使用前测量溶液 pH，确保 pH &#62;13。</li>
		<li>将 Tris 碱配制成 0.4 M 溶液，溶于纯水中，用盐酸（HCl，Mr 36.46）调节 pH 至 7.5。将溶液储存于 4–10 °C。此为中和缓冲液。</li>
		<li>在使用当天新鲜配制剪切缓冲液。将 EDTA 二钠配制成 20 mM 溶液，DMSO 至终浓度 10%，溶于汉克氏平衡盐溶液（HBSS，不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）中。使用前置于冰上保存。</li>
		<li>配制染色液时，将核酸荧光染料原液用 Tris-硼酸-EDTA 缓冲液（TBE 缓冲液）按 1:10,000（v/v）稀释。用铝箔包裹避光保存。储存于 2–8 °C，并在 24 小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠肝脏单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>按照《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》20 推荐的方法，使用 CO2 气体对大鼠实施安乐死。
	<ol>
		<li>将 CO2 气体流速设定为 2.75。将大鼠放入安乐死舱（例如，干燥器罐、带通气盖的鼠笼），打开气瓶阀门通入 CO2。等待 1.5 至 2.5 分钟，直至大鼠失去意识。随后将 CO2 流速调至最大。在呼吸停止后，继续将大鼠留在舱内约 1 分钟，以确保安乐死完成。通过触诊确认大鼠无心跳，并通过夹捏脚趾观察其是否出现肢体回缩，以验证安乐死效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 70% 乙醇对带毛皮肤进行消毒。切开腹腔，用手术剪完整取出肝脏。取出肝脏后，再用手术剪从剩余肝脏上分离出左侧叶。将左侧叶置于切板上，使用一次性单刃剃须刀片切割出两个相邻的、厚度为 3–4 mm 的横切面。</li>
	<li>将其中一个横切面放置于滤纸上（防止切面卷曲），然后将其浸入 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中。确保 10% NBF 与组织的体积比达到 10:1 或更高。固定时间至少 72 小时后，进行组织病理学处理（见下文第 7 节）。</li>
	<li>将第二个肝脏横切面放入盛有 5 ml 冰冷剪碎缓冲液（见第 1.2.6 节）的 6 cm 培养皿中，清洗 3 次以去除残留血液。</li>
	<li>将肝脏切片转移至含有 1 ml 冰冷剪碎缓冲液的新 2 ml 离心管中。用精细剪刀充分剪碎已清洗过的肝脏组织以释放细胞。将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤，去除组织团块。</li>
	<li>将单细胞悬液置于冰上，并在 1 小时内用于制片。通过细胞计数（例如，使用血细胞计数板或电子细胞计数器）确认细胞浓度，确保其浓度约为 2 × 106 个细胞/ml。</li>
</ol>
3. 凝胶电泳载玻片的制备
<ol>
	<li>取一份体积的单细胞悬液与十份体积的熔融状态、37 °C、0.5%低熔点琼脂糖溶液（见第1.2.1节）混合。立即吸取100 µl混合液滴加至预先涂有普通熔点琼脂糖的载玻片上（见第1.1节）。立即在细胞-琼脂糖混合物上加盖盖玻片。每个样本至少制备8张载玻片。 
	注意：所有载玻片均应以数字或类似编码标识，并记录其对应信息，以便后续进行盲法分析（见下文6.2.2节）。</li>
	<li>将载玻片平放，于4 °C冷却30分钟。</li>
	<li>待凝胶完全凝固后，轻轻移去盖玻片，将载玻片浸入预冷的裂解缓冲液中（见第1.2.2节）。避光保存，并于4 °C在裂解缓冲液中孵育1小时（最短时间）至过夜（最长时间）。</li>
</ol>
4. 星状胶质细胞电泳载玻片的酶处理
<ol>
	<li>从每份组织样本制备的8张载玻片中取出6张，移出裂解缓冲液，然后在室温下用酶缓冲液（见1.2.3节）清洗3次，每次5分钟。剩余的2张载玻片用于不加酶处理的碱性彗星实验（见下文5.1节）。清洗后，通过倾倒并用纸巾轻压载玻片以去除多余液体。</li>
	<li>将hOGG1和Endo III酶贮存液用酶缓冲液按1:1,000（v/v）稀释，置于冰上保存，待用。</li>
	<li>向每个处理组制备的载玻片分别加入200 µl以下溶液：仅200 µl酶缓冲液（使用2张载玻片作为对照载玻片）、200 µl hOGG1溶液（2张载玻片）或200 µl Endo III溶液（2张载玻片）。</li>
	<li>将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，用Parafilm封盖，37 °C孵育：Endo III处理组和对照组载玻片孵育45分钟，hOGG1处理组载玻片孵育30分钟。</li>
	<li>孵育后，用蒸馏水冲洗载玻片，并按照下文5.2所述继续处理。</li>
</ol>
5. 解链与电泳
<ol>
	<li>对于未用酶处理的载玻片，从裂解缓冲液中取出载玻片，沥干后用冷中和缓冲液（第1.2.5节）冲洗一次，5分钟，以去除残留的去污剂和盐分。</li>
	<li>将步骤4.5和5.1中的载玻片随机放入水平凝胶电泳槽中，避免留有空隙。用新配制的pH &#62; 13的电泳缓冲液（第1.2.4节）充满电泳槽，直至液面刚好覆盖载玻片（避免在琼脂糖上产生气泡，并确保电泳槽水平）。记录DNA解旋开始时的缓冲液pH值和温度。</li>
	<li>让载玻片在碱性缓冲液中静置20分钟，以使DNA解旋并暴露碱性不稳定的损伤位点。</li>
	<li>在解旋过程中，设置电源输出，使电泳槽内达到0.7 V/cm的电压（V/cm = 电压除以正负电极之间的距离，单位为cm）。</li>
	<li>解旋结束后，按下电源的运行按钮。如有需要，通过调节缓冲液液面高度将电流调整至300 mA。保持缓冲液液面略高于载玻片表面。在4 °C条件下进行电泳20分钟。记录电泳开始和结束时载玻片的位置、缓冲液温度和电流（安培）。 
	注意：缓冲液过多会导致电压降低，可能影响DNA迁移。</li>
	<li>电泳结束后，轻轻将载玻片从电泳槽中取出，浸入中和缓冲液（第1.2.5节）中5分钟，以中和多余的碱。沥干载玻片，并重复此步骤两次。</li>
	<li>将载玻片浸入冷的100%乙醇中固定5分钟。让载玻片自然晾干，并置于干燥处保存。</li>
</ol>
6. DNA 染色、彗星图像观察与分析
<ol>
	<li>DNA 染色
	<ol>
		<li>将载玻片放置在纸板或金属托盘上，向每张载玻片加入 200 µl 核酸荧光染色工作液（见第 1.2.7 节），并加盖玻璃盖玻片。避光放置，使载玻片与染色液接触至少 30 分钟后再进行评分。每次染色最多处理 20 张载玻片。</li>
		<li>在读取每张载玻片前，轻轻吸去多余的染色液，注意不要扰动盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>彗星图像观察与评分
	<ol>
		<li>将连接于荧光显微镜的摄像机用于在计算机显示器上观察彗星载玻片的实时图像。</li>
		<li>随机选择一个含有细胞的显微镜视野。使用鼠标点击选中一个细胞，用鼠标左键点击&#34;彗星头部&#34;的中心。 
		注意：计算机软件将自动计算该细胞的所有测量参数，并将数据添加至数据文件中。</li>
		<li>对当前视野中的所有细胞进行评分（见步骤 6.2.4），然后使用显微镜载物台控制装置及屏幕上的视频图像寻找下一组细胞。按照 6.2.2 中所述方法对这些细胞进行评分。</li>
		<li>从右至左、从下至上对载玻片进行评分。随机选择约 10 个视野。在此过程中，任何出现在视野中的合适彗星细胞均应无偏倚地进行评分。 
		注意：若出现以下任一情况，则不应对此彗星进行评分：1）位于载玻片任一边缘；2）两个或多个彗星重叠；3）尾部存在碎片；4）软件无法区分头部与尾部；或 5）细胞核和/或尾部的染色强度与载玻片上其他彗星存在显著差异。 
		注意：几乎所有 DNA 荧光信号均位于尾部的彗星常被称为“刺猬状”（hedgehog）彗星。此类刺猬状彗星不应参与评分，但在载玻片评分过程中应记录所发现的刺猬状彗星数量，并以占总彗星数的百分比形式报告。</li>
		<li>每张载玻片至少分析 75 个彗星，每种器官/组织阅读两张载玻片，以确保每个样本总共获得至少 150 个彗星细胞。当一张载玻片所需的细胞数量评分完成后，结果将保存为电子表格文件，供后续数据分析使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 组织病理学分析
<ol>
	<li>在10%中性缓冲福尔马林中固定至少72小时后，进行组织修整21常规处理样本的左侧肝叶，并将其包埋于石蜡介质中22将样本切片至约5微米厚度，并收集于载玻片上。</li>
	<li>用苏木精对切片进行染色 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E)
	<ol>
		<li>将带有石蜡包埋组织切片的载玻片置于60 °C烘箱中加热2小时，然后再进行染色操作。</li>
		<li>使用二甲苯对切片进行脱蜡。用梯度乙醇（EtOH）水化切片，最后用流水冲洗。</li>
		<li>将切片置于450 ml苏木精中染色2分40秒。随后用酸液（2 ml冰醋酸加入450 ml去离子水中）冲洗4秒，再用流动的自来水冲洗5分钟。</li>
		<li>将切片置于含有1 ml氢氧化铵的450 ml 70%乙醇中处理2分钟，随后用流水冲洗2分30秒，再用70%乙醇冲洗1分钟。</li>
		<li>将载玻片置于含4 ml冰醋酸的450 ml伊红Y溶液中染色3分钟。</li>
		<li>用梯度乙醇脱水切片。用二甲苯透明切片（每次1分钟，共三次），并在加盖盖玻片前将切片置于二甲苯中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在光学显微镜下观察切片，记录结果，并根据严重程度对非肿瘤性病变进行分级：1级（极轻度）、2级（轻度）、3级（中度）或4级（显著）。 
	注意：特定病变的严重程度分级依据是肝脏中该病变所占的相对比例（轻度 = &#60;轻度 = 1–15%；轻度 = 16–35%；中度 = 36–60%；显著 = 61–100%。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>动物被视为统计分析的实验单位。DNA损伤以尾部DNA百分比（% DNA in tail）表示。</li>
	<li>氧化性DNA损伤的计算方法如下：对照组切片（未进行酶处理）可估算背景DNA链断裂（SB）水平。 
	注意：经酶处理的切片可测量链断裂和氧化碱基的总量（SB + OX）。假设尾部DNA百分比随DNA损伤呈线性剂量反应关系，则从SB + OX中减去SB，即可估算由氧化嘧啶/修饰嘌呤引起的DNA链断裂23。</li>
	<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析不同剂量下尾部DNA百分比与剂量的关系，随后使用Dunnett检验将处理组动物的反应与溶剂对照组进行成对比较。 
	注意：所有检验均为单侧检验，设定p值小于0.05作为统计学显著性的判断标准。</li>
</ol>

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<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。本材料中的信息并非美国食品药品监督管理局（FDA）的正式信息发布，不代表该机构的立场或政策。

本方案描述了在单细胞水平上同时检测大鼠肝脏中直接性和氧化性DNA损伤的方法。该通用方案适用于任何能够分离出单细胞或细胞核且在处理过程中产生最少人为诱导DNA损伤的组织。即，这种DNA损伤并非由测试试剂引起，而是由于动物组织的处理和加工过程所致。在我们的研究中，已对骨髓细胞进行了碱性彗星试验7,9，胃6，肾脏9，膀胱9，肺9心脏10乳腺5子宫5，睾丸5，以及血液5这些检测方法可为研究实验动物多个器官和组织中外源性物质诱导的DNA损伤提供一种快速、简便且经济的手段。此外，该方法还可用于人群生物监测研究，例如对临床或职业暴露个体的外周血、尿道脱落细胞或口腔及鼻腔上皮细胞进行检测。该基本方法也可用于评估培养细胞中的DNA损伤。 体外.
当彗星试验被整合到急性或亚慢性毒理学研究中时，取样时间、 即末次给药至组织采集的时间间...

碱性彗星试验在单细胞水平上检测DNA链断裂。将单细胞悬液包埋于载玻片上的琼脂糖中，裂解细胞以形成含有超螺旋DNA环的核样结构。在pH条件下进行电泳&#62;13 导致含有链断裂的 DNA 环中超级螺旋结构的丧失，游离的 DNA 链向阳极迁移，形成可通过荧光显微镜观察到的彗星样结构。断裂的 DNA 从 &#34;头部&#34; 彗星进入 &#34;尾部&#34; 根据片段大小，以及彗星尾部荧光强度相对于总强度（头部和尾部）的比例，可用于定量DNA断裂程度1,2该检测方法简单、灵敏、通用、快速，且相对经济。1由DNA损伤剂引起的DNA断裂检测被用作一种检测方法，用于量化经潜在遗传毒性物质处理的动物各组织中单个细胞或分离细胞核内的DNA损伤。由于其具有诸多优势，该方法 体内 彗星试验被推荐作为第二 体内 遗传毒性检测（与 体内 微核试验）用于在现行国际人用药品注册技术协调会（ICH）中进行产品安全性评价3 欧洲食品安全局（EFSA）4 监管指南。在我们的实验室中，我们已采用该检测方法用于评估 体内 由食品成分、药物和纳米材料引起的DNA损伤5-10本方案以大鼠肝脏为例，但只要能从组织中分离出完整的单细胞，彗星试验也可应用于实验动物的其他组织或器官。
某些类型的DNA损伤若不改进基本的碱性彗星实验，则难以作为DNA链断裂进行检测。对于氧化性DNA损伤，可通过使用修复酶（如人8-氧代鸟嘌呤-DNA-N-糖苷酶1（hOGG1））消化，在DNA的氧化损伤位点处产生链断裂，hOGG1可在8-氧代鸟嘌呤（8-oxoGua）和甲基-fapy-鸟嘌呤位点引入断裂11。此外，内切酶III（Endo III）主要在氧化的嘧啶位点产生断裂1。因此，增加酶消化步骤后，该实验成为一种特异且灵敏的体内氧化性DNA损伤检测方法in vivo12。利用这些实验方法，我们已证实外源毒性物质可诱导大鼠和小鼠肝脏中的氧化性DNA损伤6-8，以及大鼠心脏中的氧化性DNA损伤10。
碱性彗星试验在遗传毒理学和人类生物监测中具有多种应用：1）作为后续检测手段 体内 由敏感性检测鉴定的基因毒素检测方法 体外 测试3,13，2）评估外源性物质在多种组织中诱导DNA损伤的机制14，3）研究致癌物是否通过基因毒性或非基因毒性作用模式（MOA）发挥作用7，4）评估DNA损伤修复15，5）以研究人类疾病和职业暴露 16，以及作为器官特异性遗传毒性潜在的高通量筛选实验方法6）17.

<table><tbody><tr><td>盖玻片（1号，24 × 50 mm）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠（EDTA）</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（LMP）</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarose</td></tr><tr><td>普通熔点琼脂糖（NMA）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>pH试纸条（pH 7.5–14）</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>载玻片标签（0.94 × 0.5 英寸）</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&amp;trade; Gold&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网（40 &amp;micro;m）</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>内切核酸酶III（Nth）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>hOGG1&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr></tbody></table>

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的dna链断裂和氧化性dna损伤

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

未修复的DNA损伤可导致基因组不稳定，进而可能促进癌症的发生。因此，识别潜在的DNA损伤剂对于保护公众健康具有重要意义。 体内 碱性彗星试验，通过检测DNA链断裂来评估DNA损伤，对于评价外源性化学物质的遗传毒性危害尤为相关，因为其反应结果反映了 体内 吸收、组织分布、代谢和排泄（ADME）以及DNA修复过程。与其他方法相比 体内 DNA损伤检测，该检测方法快速、灵敏、直观且成本低廉；通过使用特异性修复酶将氧化性DNA损伤转化为链断裂，该方法能够高效且相对无假象地检测氧化性DNA损伤. 通过急性与亚慢性毒理学研究设计均可开展彗星试验以检测DNA损伤，将彗星试验与其他毒理学评估方法相结合，可最大限度地利用实验动物资源，从而满足动物福利要求。该试验的另一主要优势在于仅需少量细胞，且细胞来源无需局限于增殖细胞群体。此外，该试验还可应用于临床上或职业暴露个体所获取的多种人体样本。

的 体内 碱性彗星实验与酶修饰彗星实验联合用于检测醋酸环丙孕酮（CPA）处理大鼠肝脏中的直接和氧化性DNA损伤5CPA 是一种合成激素类药物，能以性别特异性的方式诱导大鼠肝肿瘤，其中诱导雄性大鼠肝肿瘤所需的剂量是雌性大鼠的五倍。24我们发现，环磷酰胺（CPA）在雄性和雌性大鼠肝脏中产生的直接DNA损伤与其肝肿瘤发生性具有相同的性别特异性模式：与雌性大鼠相比，雄性大鼠需要高出五倍剂量的CPA才能诱导肝脏DNA损伤出现显著增加图1).
我们假设，彗星试验结果的性别特异性是由于羟基类固醇磺基转移酶（HST）的活性所致，该酶在成年雌性大鼠中的活性比成年雄性高15倍。HST代谢是环磷酰胺（CPA）活化为DNA结合性代谢物的关键限速步骤。25相比之下，CPA诱导的氧化性DNA损伤在雄性大鼠肝脏中通常高于雌性，因此在肿瘤形成过程中较不可能成为限速步骤...

碱性彗星实验用于检测真核细胞中的DNA链断裂。通过添加内切核酸酶III或人8-氧代鸟嘌呤-DNA-糖基化酶消化步骤，该实验可有效检测氧化性DNA损伤。本文描述了利用这些实验方法检测大鼠肝脏中DNA损伤的技术流程。

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

未修复的DNA损伤可导致基因组不稳定，进而可能促进癌症的发生。因此，识别潜在的DNA损伤剂……

体内碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验的总体目标是在单细胞水平上同时检测直接DNA损伤和氧化性DNA损伤。该方法最初被提出作为FDA监管产品安全性分析的监管工具，可用于回答从监管安全性评价、分子流行病学到基础癌症研究等多个领域中的关键科学问题。该技术具有高灵敏度和广泛的适用性，且相对经济。它几乎能够检测任何动物组织中的DNA损伤。通常情况下，人们知道该方法在快速制备来自不同组织的单细胞悬液方面存在困难，这可能带来挑战。该方法的可视化演示至关重要，因其不仅需要科学性，还需要一定的技巧。根据文本方案，使用二氧化碳气体处死大鼠后，通过触诊确认大鼠无心跳，并夹捏脚趾以确认大鼠无肢体回缩反应。使用乙醇对皮肤进行消毒，然后用手术剪打开腹腔，再完整取出肝脏。用剪刀将左侧叶与器官其余部分分离，并置于切板上。接着，使用一次性单刃剃须刀片，切取两片相邻的、厚度为3至4毫米的横切面组织。将其中一片横切面组织先置于滤纸上，然后放入10%中性缓冲福尔马林（NBF）中。将第二份肝组织放入盛有5毫升冰冻切碎缓冲液的6厘米培养皿中，清洗三次以去除残留血液。然后，将肝组织转移至一个新的2毫升离心管中，管内含有1毫升冰冻切碎缓冲液。用精细剪刀剪碎组织以释放细胞，再使用40微米细胞筛过滤细胞悬液，去除任何组织团块。将单细胞悬液置于冰上，使用血细胞计数板确认细胞浓度约为每毫升 2 × 10⁶ 个细胞。制备彗星电泳载玻片时，取一份单细胞悬液与十份已熔化的 37 °C 0.5% 低熔点琼脂糖溶液混合。立即吸取 100 µL 混合液滴加至预先涂有琼脂糖的载玻片上，并用盖玻片覆盖琼脂糖-细胞混合物。将载玻片平放，在4 °C下冷却30分钟。待凝胶完全凝固后，轻轻取下盖玻片，并将载玻片浸入预冷的裂解缓冲液中。在4 °C避光孵育1小时至过夜。孵育结束后，从每种组织样本制备的八张载玻片中取出六张，移出裂解缓冲液，用室温的酶缓冲液冲洗三次，每次五分钟。然后用吸水纸吸去多余液体。接着，用酶缓冲液将hOGG1和Endo III酶储备液稀释至一比一千，并置于冰上。将载玻片放入垫有湿润纸巾的培养皿中，然后向各处理组的载玻片上分别加入 200 微升以下溶液：酶缓冲液加入两片载玻片，hOGG1 溶液加入两片载玻片，Endo III 溶液加入两片载玻片，并用 Parafilm 封口覆盖载玻片。随后将载玻片置于 37 摄氏度环境中，其中经 Endo III 处理的载玻片和对照载玻片孵育 45 分钟，经 hOGG1 处理的载玻片孵育 30 分钟。孵育结束后，倾去载玻片上的液体，对于对照载玻片，使用冷中和缓冲液去除残留的去污剂和盐分。然后用蒸馏水冲洗经酶处理的载玻片。将载玻片随机放入水平琼脂糖凝胶电泳槽中，避免留有间隙。然后将新配制的电泳缓冲液加入电泳槽中，避免产生气泡，直至缓冲液刚好浸没载玻片。将电源调至每厘米0.7伏，将载玻片在碱性缓冲液中孵育20分钟，以使DNA解链并暴露碱性敏感性损伤。记录载玻片的位置、缓冲液的温度以及电流值。孵育解旋后，将电泳槽置于4摄氏度环境中。然后按下电源上的运行按钮，必要时通过调节缓冲液液面高度将电流调整至300毫安，使液面略高于载玻片。电泳运行20分钟后，再次记录载玻片位置、缓冲液温度及电流值。电泳结束后，轻轻将载玻片从电泳槽中取出，浸入中和缓冲液中以中和多余的碱。然后沥干载玻片，并重复中和步骤两次。用冷的100%乙醇固定载玻片5分钟。将载玻片自然晾干，并置于干燥环境中保存。为染色DNA，将载玻片放置于纸板或金属托盘上，每张载玻片上加入200 µL核酸荧光染色工作液，然后加盖盖玻片。避光保护，孵育至少30分钟。然后读取载玻片时，轻轻吸去多余的染色液，注意不要扰动盖玻片。接着，将彗星电泳载玻片置于配备摄像机的荧光显微镜载物台上，随机选择一个含有细胞的视野。打开彗星分析软件后，使用鼠标选中一个细胞，然后左键单击该细胞彗星头部的中心位置。软件将计算细胞的参数，并将其添加到数据文件中。完成当前视野中所有细胞的评分后，移动至下一个视野，无偏倚地重复评分出现的任何合适的彗星细胞。每个载玻片需评分10个随机视野，每个视野至少包含75个彗星细胞。最后，将数据保存到电子表格中以供后续分析。如先前报道，CPA 是一种合成激素类药物，可按性别特异性方式诱导大鼠肝肿瘤，其中雄性大鼠所需诱导肝肿瘤的剂量是雌性大鼠的五倍。如本研究结果所示，体内碱性彗星试验及酶修饰彗子试验均表明，与雌性大鼠相比，雄性大鼠需要五倍剂量的 CPA 才能引起肝脏 DNA 损伤的显著增加。羟基类固醇硫酸转移酶（HST）在成年雌性大鼠体内的表达水平比成年雄性大鼠高15倍。HST代谢是环磷酰胺（CPA）活化为DNA结合性代谢物的限速步骤。如图所示，与雌性大鼠肝脏相比，雄性大鼠肝脏中CPA诱导的氧化性DNA损伤通常更为严重，因此在雄性大鼠的肿瘤形成过程中，该步骤较不可能成为限速因素。如这些表格中所报告的，对 CPA 处理大鼠肝脏的组织病理学评估未发现试剂诱导的细胞凋亡或坏死迹象，从而证实了先前的结论，即彗星试验结果呈阳性并非细胞毒性的继发效应。在进行该操作时，重要的是尽快收集单细胞悬液，并迅速制备彗星试验载玻片。该技术建立后，为遗传毒理学领域的研究人员提供了有力工具，使其能够对几乎所有动物组织以及人类样本中的 DNA 损伤与修复进行定量研究。观看本视频后，我们希望您能够更好地理解如何结合使用体内碱性彗星实验与酶修饰彗星实验，在动物组织的单细胞水平上同时检测烷基化损伤和氧化性DNA损伤。请注意，操作DNA损伤试剂可能具有极高危险性，进行这些实验操作时，请务必穿戴个人防护装备。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体内碱性彗星试验和酶修饰碱性彗星试验测量DNA链断裂和DNA氧化损伤大鼠肝

在本视频中，我们演示了一种碱性单细胞凝胶电泳实验方法，用于定量检测经阿霉素处理的细胞中单链和双链DNA断裂。在碱性条件下，DNA碱基对之间的氢键被破坏，导致DNA双链完全解旋和分离。在电泳过程中，未损伤和已损伤的DNA片段在琼脂糖凝胶中发生差异迁移，形成彗星状结构：迁移较慢的未损伤DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的损伤DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

碱性单细胞凝胶电泳：一种用于化疗后单个癌细胞DNA损伤定量检测的高灵敏度技术

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。...

用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

彗星试验是一种高效检测所有细胞（包括海马神经元）DNA中单链和双链断裂的方法，可检测碱性不稳定位点以及DNA-DNA/DNA-蛋白质交联。该方法利用不同DNA损伤程度导致DNA在电场中迁移率差异的原理进行检测。...

使用彗星试验法检测海马神经元中的DNA损伤

本文介绍了一种能够以前所未有的通量进行彗星实验检测DNA损伤的平台。该装置可将哺乳动物细胞排列成微阵列，并实现96个样品的并行处理。该方法有助于分析基础水平的DNA损伤、暴露诱导的DNA损伤以及DNA修复动力学。...

CometChip：一种用于在微阵列化人细胞中高通量检测DNA损伤的96孔平台

彗星试验用于检测由不同因素引起的DNA断裂。如果除氧化应激外的所有其他导致DNA损伤的因素均保持恒定，则DNA损伤程度可作为氧化应激的一个良好间接参数。本实验方案的目标是利用彗星试验对氧化应激进行间接测定。...

彗星试验作为系统性氧化应激的间接检测方法

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。...

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。...

使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

本文介绍了DNA纤维实验的两种改进方法，用于在诱导损伤后研究复制DNA中的单链DNA缺口。S1纤维实验利用特异性识别单链DNA的S1核酸内切酶来检测复制后缺口，而缺口填补实验则可用于可视化并定量分析缺口修复过程。...

利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

彗星试验是检测DNA损伤的常用方法。本研究介绍了一种用于运行彗星试验代表性变体的载玻片操作方法。该方法显著增加了样本数量，同时缩短了试验运行时间、减少了载玻片操作步骤以及凝胶损伤的风险。...

一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

学习体内碱性彗星试验和酶修饰碱性彗星试验，用于在大鼠肝脏中同时检测DNA链断裂和氧化损伤。该方法灵敏、经济，适用于监管安全评估和癌症研究。

体内碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

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