Name: 冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展贝氏柯克斯体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解使用冻干环介导等温扩增试剂检测贝氏柯克斯体的简便方法。该技术无需特殊储存条件，适用于资源有限地区的Q热诊断，为传染病检测提供可靠解决方案。

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本研究由海军医学研究中心（Naval Medical Research Center）研究项目编号 6000.RAD1.J.A0310 资助。本文所表达的观点仅为作者观点，并不一定反映美国海军部、国防部或美国政府的官方政策或立场。Wei-Mei Ching 是美国政府雇员，本工作系其履行官方职责期间完成。根据美国《版权法》第17编第105条（Title 17 U.S.C. §105）规定：“美国政府作品不享有本法规定的版权保护。” 第17编第101条（Title 17 U.S.C. §101）将美国政府作品定义为：由美国政府军事人员或雇员在其官方职责范围内完成的作品。

1. 准备质粒DNA稀释液作为LAMP反应的标准品
<ol>
	<li>使用分光光度计在 260 nm 处测量光密度（O.D.），以确定质粒（含有 C. burnetii RSA 493 的目标基因 IS1111a）DNA 浓度。O.D.260 为 1 时相当于 50 µg/µl 的 DNA。</li>
	<li>将质粒 DNA 量换算为拷贝数。由于该质粒大小为 6,330 bp，其分子量为 4.1 × 106 g（6,330 bp × 649 g/bp）。质粒的 DNA 浓度为 34.2 ng/µl（根据步骤 1.1 测定结果）。每 1 µl 该 DNA 样品含有 34.2 ng 质粒 DNA，相当于 5 × 109 拷贝（34.2 × 10-9 g / 4.1 × 106 g × 6.02 × 1023）的 DNA。</li>
	<li>将 10 µl 质粒 DNA（5 × 109 拷贝/µl）加入 90 µl 水中，进行 10 倍稀释，制备成浓度为 5 × 108 拷贝/µl 的 DNA 样品。</li>
	<li>重复步骤 1.3，制备浓度分别为 5 × 107、5 × 106、5 × 105、5 × 104、5 × 103、5 × 102、5 × 101 和 5 × 100 拷贝/µl 的 DNA 样品。</li>
</ol>
2. 为 LAMP 反应准备样品的 DNA 模板
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用商用DNA小量提取试剂盒从人血浆样本中提取DNA。提取时使用总共200 µl&#160;样本，并将提取的DNA洗脱于20 µl体积中。</li>
</ol>
3. 配制 2x&#160;LAMP 反应缓冲液
<ol>
	<li>取 200 µl 10x&#160;Pol 缓冲液、320 µl 5 M 甜菜碱、12 µl 1 M MgSO4、280 µl dNTP 混合液（各 10 mM）和 188 µl 水，配制成 1 ml 的 2x LAMP 缓冲液。涡旋振荡 10 秒以充分混匀。</li>
</ol>
4. 进行标准 LAMP 反应
<ol>
	<li>在0.2 ml PCR管中，加入12.5 µl 2x LAMP缓冲液（按步骤3配制；含40 mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM (NH4)2SO4、0.2% Triton X-100、1.6 M 甜菜碱、1.4 mM dNTP混合物）、1.2 µl 引物混合物、1 µl Bst DNA聚合酶（8 U/µl）和5.3 µl 水，配制成20 µl反应体系。</li>
	<li>向20 µl反应体系中加入5 µl DNA（来自步骤1或2），充分混匀。</li>
	<li>盖紧管盖，在水浴或加热块中于60 °C孵育60分钟。此温度为先前确定的最佳反应温度。</li>
	<li>加入5 µl 10x凝胶上样缓冲液以终止反应。</li>
	<li>取5 µl反应产物加入含核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶中进行电泳。</li>
	<li>在1x TBE缓冲液中以100 V电压电泳35分钟。</li>
	<li>通过紫外光观察结果。</li>
</ol>
5. 使用重组试剂进行LAMP反应
<ol>
	<li>取125 µl 10x Pol Buffer、200 µl 5 M 甜菜碱、7.5 µl 1 M MgSO4 和667.5 µl 水，配制成1 ml 重建缓冲液。涡旋振荡10秒以充分混匀。</li>
	<li>从密封的铝箔袋中取出含有冻干试剂的离心管。若铝箔袋未密封或已破损，请勿使用管内试剂。</li>
	<li>向每根离心管中加入20 µl 重建缓冲液，以重悬冻干试剂。</li>
	<li>用移液器反复吹打5次进行混匀。观察确认冻干试剂已完全重悬，管内白色粉末应完全消失。</li>
	<li>向重悬后的试剂中加入5 µl DNA模板（来自步骤1或2），充分混匀。</li>
	<li>盖紧管盖，在水浴或加热块中于60 °C孵育60分钟。</li>
	<li>加入5 µl 10x上样缓冲液以终止反应。</li>
	<li>取5 µl反应产物，上样至含核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶。</li>
	<li>在1x TBE缓冲液中，以100 V电压电泳35分钟。</li>
	<li>使用紫外光观察结果。</li>
</ol>
6. 使用含有 HNB 或荧光嵌入染料的重建缓冲液进行 LAMP 反应
<ol>
	<li>取125 µl 10x Pol缓冲液、200 µl 5 M三甲基甘氨酸、7.5 µl 1 M MgSO4、7.5 µl 20 mM HNB（或12.5 µl 100x荧光嵌入染料）以及660 µl（或655 µl）水，混合配制成1 ml的重建缓冲液。涡旋振荡10秒以充分混匀。</li>
	<li>使用第6节中配制的重建缓冲液，重复步骤5.2–5.6。</li>
	<li>通过肉眼（含HNB的反应）或紫外灯（含荧光嵌入染料的反应）观察结果。</li>
</ol>
7. 使用管式扫描仪进行实时 LAMP 反应
<ol>
	<li>将 5 µl DNA 加入含有荧光嵌入染料的重组试剂中，盖紧管盖后插入管式扫描仪。</li>
	<li>设置孵育温度为 60 °C，在 60 分钟内于 520 nm 处检测荧光信号。</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
<li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li>
<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
<li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N+Y+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li>
<li>Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+E+%22J.+Med.+Microb.+Diagn%22">J. Med. Microb. Diagn</a>. 1 (112), (2012).</li>
<li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此前，我们开发了一种针对插入元件IS1111a14的高灵敏度和高特异性的LAMP检测方法。IS1111元件被选为靶标，是因为它在不同株系的C. burnetii中高度保守，并且在该细菌中拷贝数较高（7至110个）（Klee 2006）。我们的结果表明，LAMP可检测约25个IS1111元件拷贝，这可能相当于仅一个Coxiella DNA染色体拷贝。在本研究中，Bst DNA聚合酶、LAMP引物和dNTPs被冻干后封装于带封口的铝箔袋中。这些冻干试剂的检测灵敏度仍为25个拷贝，在室温下保存至少一个月时，其性能与新鲜配制的试剂相当。在打开铝箔袋前，必须确保其密封完好。若铝箔袋未密封或已破损，则不得使用管内试剂，因为这可能导致冻干试剂吸潮，从而丧失反应活性。另一个关键步骤是使用重建缓冲液充分重悬冻干试剂。若试剂未完全重悬，LAMP反应将无法正常进行。由于反应缓冲液中盐浓度较高，且甜菜碱（trimethylglycine）溶液黏度较大，这些成分无法与Bst DNA聚合酶、LAMP引物和dNTPs共同...

小型革兰氏阴性菌 Coxiella burnetii是Q热的病原体，Q热是一种全球流行的动物源性传染病。由于Q热在全球范围内分布广泛，且C. burnetii具有高传染性，因此派驻海外的美国军事和民事人员在流行地区存在感染风险。
Q热表现为两种形式：急性感染和慢性感染。急性Q热的症状包括流感样表现、肝炎或肺炎，通常为自限性疾病，死亡率较低。慢性Q热虽然较少见，但常导致心内膜炎，若不及时治疗，死亡率显著升高1,2。因此，早期诊断以指导适当治疗对患者管理至关重要。已有针对细胞培养物和临床样本中C. burnetii DNA检测的聚合酶链式反应（PCR）和实时定量PCR（qPCR）检测方法3-5。然而，PCR和qPCR成本较高，且在资源有限地区通常难以常规开展。
环介导等温扩增技术（LAMP）最初由Notomi6描述，是一种替代性的DNA扩增方法。LAMP利用Bst DNA聚合酶进行链置换DNA合成，并结合特异性设计的引物组，这些引物可识别靶基因至少六个独立区域。LAMP最显著的优势在于扩增过程在等温条件下进行，因此仅需水浴锅、加热块或培养箱即可完成。该方法已被用于检测多种立克次体病原体7-9。通过琼脂糖凝胶电泳对扩增后的DNA产物进行可视化分析是最准确的方法，可有效区分因非特异性扩增导致的假阳性结果。然而，凝胶电泳操作在资源有限的地区并不实用。为此，已开发出多种替代方法用于检测反应产物。这些替代方法，例如通过焦磷酸镁沉淀引起的浊度变化10，或使用荧光嵌入染料在紫外光下观察11,12，比进行凝胶电泳更为便捷。LAMP试剂在25 °C和37 °C下储存时稳定性可达一个月，而这些温度正是Q热病流行地区常见的热带和亚热带环境温度13。
我们实验室开发了一种LAMP检测方法，用于检测血浆样本中是否存在C. burnetii14。本文介绍了一种从冻干试剂配制LAMP反应混合液的简单方案。冻干试剂在室温下保存可稳定一个月。结合简便的可视化检测方法，该方法非常适合在资源有限的条件下用于检测C. burnetii。

<table><tbody><tr><td>LAMP 引物</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol，无盐</td><td>序列由客户设计</td></tr><tr><td>Bst DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 单位/毫升</td></tr><tr><td>10x 热稳定聚合酶缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>每种 10 mM</td></tr><tr><td>甜菜碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M，三甲基甘氨酸</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>上样缓冲液</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000 倍稀释，用于在试管中观察产物</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000 倍稀释，用于在凝胶中观察产物</td></tr><tr><td>冻干试剂</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羟基萘酚蓝</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant 管式扫描仪</td><td>Qiagen</td><td></td><td>实时检测</td></tr></tbody></table>

冻干环介导等温扩增试剂的开发及其在检测中的应用 coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii 是引起Q热的病原体，是一种专性细胞内寄生细菌。目前已开发出基于PCR的诊断检测方法，用于检测细胞培养物和临床样本中的 C. burnetii DNA。PCR检测需要专用设备以及对最终使用者进行 extensive 培训，因此不适合常规使用，尤其是在资源有限的地区。我们开发了一种环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于检测患者样本中 C. burnetii 的存在。该方法在约60 °C的恒定温度下进行，可使用水浴或加热块完成。该LAMP检测方法的灵敏度与PCR非常相似，检测下限约为每反应25个拷贝。本报告描述了使用冻干试剂配制反应体系，以及通过羟基萘酚蓝（HNB）显色或在反应体系中加入荧光嵌入染料后使用紫外灯观察结果的方法。LAMP试剂经冻干后可在室温（RT）下保存一个月，检测灵敏度未发生下降。该LAMP检测方法具有较强的稳健性，因为反应体系的配制不涉及复杂步骤。该方法特别适用于Q热流行且资源有限的地区使用。

0.2 ml 管内的冻干 LAMP 试剂含有 Bst DNA 聚合酶、引物和 dNTPs。使用 20 µl 复溶缓冲液重新溶解冻干试剂。图 1展示了使用新配制试剂和冻干试剂进行 LAMP 反应后在琼脂糖凝胶上的结果。冻干试剂未降低其活性，两种试剂配制的 LAMP 反应均可检测到 25 个拷贝的 DNA 模板。图 2展示了在反应体系中加入 HNB 或荧光嵌入染料后对反应产物的检测结果。在反应中加入 HNB 后，当 DNA 模板拷贝数为 25、50 和 100 时，溶液颜色由紫色变为蓝色。在反应中加入荧光嵌入染料后，当 DNA 模板拷贝数为 25、50 和 100 时，紫外光下可观察到强烈的荧光信号。本研究使用了管式扫描仪进行实时检测，该设备可同时运行 8 个反应。图 3展示了利用管式扫描仪在荧光嵌入染料存在下实时监测荧光信号的变化。当反应中 DNA 模板拷贝数分别为 106、104、103 ...

本文介绍了一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体（C. burnetii）的简单环介导等温扩增（LAMP）方法。

冻干环介导等温扩增试剂的开发及其在检测中的应用 Coxiella burnetii

引起Q热的病原体贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是一种专性细胞内寄生细菌。目前已开发出基于PCR的诊断检测方法，用于检测C. ...

本实验的总体目标是建立一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体（C. burnetii）的简单LAMP方法。该方案的主要优势在于试剂储存无需冷链运输和保存。此方法非常适合在Q热流行且资源有限的地区使用。本实验操作将由本实验室的技术员 Tatiana 演示。首先，从贝氏柯克斯体 RSA493 的目标基因 IS1111a 的 DNA 开始，使用分光光度计在 260 纳米处测定质粒 DNA 的浓度。利用以下计算公式将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数，其中 6330 为质粒的碱基对长度，34.2 纳克/微升为通过分光光度计刚刚测定得到的质粒浓度。然后对质粒进行8至10倍的系列稀释，以获得每微升中以下数量的拷贝数。为准备LAMP反应的DNA模板，取200微升人血浆样本，使用DNA小量提取试剂盒，按照制造商提供的方案提取DNA。将最终样本稀释至20微升体积。通过混合以下试剂制备1毫升2倍LAMP反应缓冲液，短暂涡旋振荡10秒以混匀。进行标准LAMP反应时，在0.2毫升PCR管中加入12.5微升2倍LAMP缓冲液、1.2微升引物混合物、1微升Bst DNA聚合酶和5.3微升水。接下来，向20微升反应体系中加入5微升DNA，充分混匀，然后在60摄氏度的水浴或加热块中孵育60分钟。孵育结束后，向反应管中加入5微升10x上样缓冲液以终止反应。随后，取5微升反应产物上样至含有核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶中。 在1×TBE缓冲液中以100伏电压电泳35分钟，然后使用紫外光观察结果。使用重组试剂进行LAMP反应时，通过混合以下试剂制备1毫升重建缓冲液。脉冲涡旋振荡10秒以混匀。接下来，从密封的铝箔袋中取出装有冻干试剂的试管。在进行步骤 4.2 时，打开铝箔袋前必须确保其已正确密封。如果铝箔袋未密封或已破损，则不得使用其中的试管。向每管试剂中加入 20 微升复溶缓冲液，通过上下吹打五次混匀。确保冻干试剂完全重悬。然后，向重悬的试剂中加入 5 微升 DNA 模板，并充分混匀。在60摄氏度的水浴或加热块中孵育60分钟。孵育结束后，加入5 µL的10x上样缓冲液以终止反应，然后将5 µL反应产物上样至含有嵌入式核酸染料的2%琼脂糖凝胶。在1x TBE缓冲液中以100伏电压电泳35分钟，随后通过紫外光观察结果。使用羟基萘酚蓝（HNB）或嵌入性染料进行LAMP反应时，通过混合以下包含HNB或荧光嵌入染料的试剂配制1毫升的复溶缓冲液。脉冲涡旋混匀10秒。按照前述方法进行LAMP反应，并使用紫外光或肉眼观察结果。使用管式扫描仪进行LAMP反应时，将5微升DNA加入含有荧光嵌入染料的重组试剂中，然后将封闭的反应管插入管式扫描仪。设置孵育温度为60摄氏度，并在60分钟内于520纳米处检测荧光信号。该图显示了使用新鲜配制试剂和冻干试剂进行LAMP反应后在琼脂糖凝胶上的结果。观察冻干试剂保持其活性。使用两种试剂制备的LAMP反应均检测到25个拷贝的DNA模板。本图显示了通过HNB或荧光嵌入染料对反应产物进行检测的结果。在反应中加入HNB可产生明显的颜色变化，当反应体系中存在25、50和100个DNA模板拷贝时，颜色由紫色变为蓝色。此外，当DNA拷贝数相近时，反应中加入荧光嵌入染料可在紫外光照射下显示出强烈的荧光信号。图中所示为使用试管扫描仪实时监测含荧光嵌入染料反应体系中荧光信号的结果。在反应中含有 10^6、10^4、10^3 和 100 拷贝 DNA 模板的情况下，荧光信号分别在 14、18、21 和 23 分钟后高于基线。掌握该方法后，可在 90 分钟内完成操作。该检测方法一经建立，便为资源有限地区快速诊断贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）感染铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何重悬冻干的 LAMP 试剂。请务必注意，患者样本可能具有传染性，因此在进行此操作时应始终采取安全防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展<em&gt;贝氏柯克斯体</em

来源： Domesle, K. J., 等环介导等温扩增用于筛查 沙门氏菌 动物饲料中的检测与确认 沙门氏菌 从培养分离。 视频实验杂志.

环介导等温扩增技术用于细菌基因检测

本视频展示了一种评估GFP标记的Coxiella突变株在培养的上皮细胞内生长能力的方法。通过免疫染色和落射荧光显微镜观察突变表型，从而研究突变对细胞内生长的影响。...

真核细胞内Coxiella突变株胞内生长能力的评估

鸡球虫（Eimeria）感染的诊断仍然具有挑战性。基于寄生虫形态学和宿主病理学的方法通常无法得出明确结论，而基于PCR的分子检测方法则在成本和专业技术方面要求较高。本实验方案旨在建立环介导等温扩增（LAMP）技术，作为一种简便的球虫感染分子诊断方法。...

环介导等温扩增（LAMP）检测法用于特异性检测感染鸡的Eimeria物种

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。...

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

Coxiella burnetii 转座子突变体的构建及多表型高内涵筛选

本文介绍了一种用于检测和定量马呼吸道分泌物中EHV-2 DNA的定量PCR方法的建立与验证方案。EHV-2...

马疱疹病毒2型呼吸道样本诊断定量PCR方法的开发与验证

研究细菌病原体与其宿主之间的相互作用是生物学研究的重要领域。本文介绍了利用BlaM底物在siRNA基因沉默过程中检测贝氏柯克斯体（Coxiella...

应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测siRNA沉默期间Coxiella burnetii效应蛋白转位效率

本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。...

毛细管阵列中多种核酸的可视化检测

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种等温核酸扩增检测技术（iNAAT），在病原体检测领域已引起广泛关注。本文介绍一种经多家实验室验证的 沙门氏菌 LAMP 协议作为一种快速、可靠且稳健的筛查方法 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认疑似阳性样本 沙门氏菌...

环介导等温扩增技术用于筛查 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认 沙门氏菌 从培养物分离

本研究描述了制备可用于直接检测T. cruzi...

即用型 qPCR 用于检测 DNA 克氏锥虫 或其他病原生物

多种细菌性病原体可引起呼吸道感染，若未能准确检测并及时治疗，可能导致严重的健康问题。通过环介导等温扩增技术 对这些病原体进行快速且准确的检测，有助于在临床环境中有效管理和控制呼吸道感染。...

基于微流控芯片的环介导等温扩增技术快速检测引起下呼吸道感染的细菌性病原体

了解使用冻干环介导等温扩增试剂检测贝氏柯克斯体的简便方法。该技术无需特殊储存条件，适用于资源有限地区的Q热诊断，为传染病检测提供可靠解决方案。

冻干环介导等温扩增试剂的开发及其在检测中的应用 Coxiella burnetii

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