冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展贝氏柯克斯体

本实验的总体目标是开发一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体的简单 LAMP 方法。该方案的主要优点是不需要对试剂的储存进行指导。这种方法非常适合在 Q 热流行的资源有限环境中使用。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Tatiana。从来自贝氏柯斯体 RSA493 的靶基因 IS1111a 的 DNA 开始，用分光光度计测定 260 纳米的质粒浓度。使用以下计算将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数，其中 6330 等于质粒的长度和碱基对，34.2 ng/μL 是质粒的浓度，刚刚使用分光光度计测定。

然后制备 8 至 10 倍连续稀释的质粒，以达到以下每微升拷贝数。要制备用于 LAMP 反应的 DNA 模板，请从 200 μL 人血浆样品开始，然后使用 DNA 小量制备试剂盒，根据制造商的方案提取 DNA。将最终样品稀释成 20 μL 体积。

通过混合以下试剂制备 1 毫升 2x LAMP 反应缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。为了进行标准 LAMP 反应，在 0.2 mL PCR 管中，混合 12.5 μL 2x LAMP 缓冲液、1.2 μL 引物混合物、1 μL Bst DNA 聚合酶和 5.3 μL 水。

接下来，向 20 μL 反应中加入 5 μL DNA 并充分混合，然后在 60 摄氏度下在水浴或加热块中孵育 60 分钟。孵育后，向试管中加入 5 μL 10x 凝胶上样缓冲液终止反应。然后将 5 μL 反应产物加载到用嵌入核酸染色剂染色的 2% 琼脂糖凝胶上。

将凝胶在 1x TBE 中以 100 伏电压电泳 35 分钟，然后使用紫外光观察结果。要使用复溶试剂进行 LAMP 反应，请混合以下试剂制备 1 mL 复溶缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。

接下来，从密封的铝箔袋中取出装有冻干试剂的试管。对于步骤 4.2，在打开铝箔袋之前确保铝箔袋正确密封非常重要。如果铝袋未密封或损坏，请勿使用管子。

向每管试剂中加入 20 μL 重构缓冲液，并通过上下吹打 5 次进行混合。确保冻干试剂完全重新悬浮。然后，向复溶的试剂中加入 5 μL DNA 模板并充分混合。

在 60 摄氏度下在水浴或加热块中孵育 60 分钟。为了在孵育后终止反应，加入 5 μL 的 10x 凝胶上样缓冲液，然后将 5 μL 的反应产物加入到用嵌入核酸染色剂染色的 2% 琼脂糖凝胶上。在 1x TBE 缓冲液中以 100 伏电压运行凝胶 35 分钟，然后通过紫外光观察结果。

要使用羟基萘酚蓝 （HNB） 或嵌入染料进行 LAMP 反应，通过混合以下试剂（包括 HNB 或荧光嵌入染料）来制备 1 mL 重构缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。按照刚才描述的方式进行 LAMP 反应，并使用紫外光或肉眼可视化结果。

要使用试管扫描仪进行 LAMP 反应，将 5 μL DNA 添加到含有荧光嵌入染料的复溶试剂中，然后将封闭的试管插入试管扫描仪中。将孵育温度设置为 60 摄氏度，并在 520 纳米处测量荧光 60 分钟。该图显示了使用新鲜制备的试剂和冻干试剂在琼脂糖凝胶上的 LAMP 反应结果。

观察冻干试剂保持其活性。两种试剂制备的 LAMP 反应体系检测到 25 拷贝的 DNA 模板。在该图中，显示了反应中用 HNB 或荧光嵌入染料检测反应产物的过程。

在反应中加入 HNB 会产生从紫色到蓝色的视觉颜色变化，反应中存在 25、50 和 100 个拷贝的 DNA 模板。此外，当存在相似的 DNA 拷贝数时，在反应中加入荧光嵌入染料在紫外光下显示出强烈的荧光信号。这里显示的是使用 Tube 扫描仪通过荧光嵌入染料实时监测荧光信号的结果。

14、18、21 和 23 分钟后荧光信号高于基线，反应中有 10^6、10^4、10^3 和 100 个拷贝的 DNA 模板。一旦掌握，这个过程可以在 90 分钟内完成。开发后，该检测为资源有限地区快速诊断贝氏柯克斯体感染铺平了道路。

看完这个视频，您应该对如何重构冻干 LAMP 试剂有了很好的了解。不要忘记患者样本可能具有传染性，因此在执行此程序时应始终采取安全预防措施。