冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展贝氏柯克斯体
April 18th, 2016
我们在这里描述了一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体的简单环介导等温扩增 （LAMP） 方法。
本实验的总体目标是开发一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体的简单 LAMP 方法。该方案的主要优点是不需要对试剂的储存进行指导。这种方法非常适合在 Q 热流行的资源有限环境中使用。
演示该程序的是我们实验室的技术人员 Tatiana。从来自贝氏柯斯体 RSA493 的靶基因 IS1111a 的 DNA 开始，用分光光度计测定 260 纳米的质粒浓度。使用以下计算将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数，其中 6330 等于质粒的长度和碱基对，34.2 ng/μL 是质粒的浓度，刚刚使用分光光度计测定。
然后制备 8 至 10 倍连续稀释的质粒，以达到以下每微升拷贝数。要制备用于 LAMP 反应的 DNA 模板，请从 200 μL 人血浆样品开始，然后使用 DNA 小量制备试剂盒，根据制造商的方案提取 DNA。将最终样品稀释成 20 μL 体积。
通过混合以下试剂制备 1 毫升 2x LAMP 反应缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。为了进行标准 LAMP 反应，在 0.2 mL PCR 管中，混合 12.5 μL 2x LAMP 缓冲液、1.2 μL 引物混合物、1 μL Bst DNA 聚合酶和 5.3 μL 水。
接下来，向 20 μL 反应中加入 5 μL DNA 并充分混合，然后在 60 摄氏度下在水浴或加热块中孵育 60 分钟。孵育后，向试管中加入 5 μL 10x 凝胶上样缓冲液终止反应。然后将 5 μL 反应产物加载到用嵌入核酸染色剂染色的 2% 琼脂糖凝胶上。
将凝胶在 1x TBE 中以 100 伏电压电泳 35 分钟，然后使用紫外光观察结果。要使用复溶试剂进行 LAMP 反应，请混合以下试剂制备 1 mL 复溶缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。
接下来，从密封的铝箔袋中取出装有冻干试剂的试管。对于步骤 4.2，在打开铝箔袋之前确保铝箔袋正确密封非常重要。如果铝袋未密封或损坏，请勿使用管子。
向每管试剂中加入 20 μL 重构缓冲液，并通过上下吹打 5 次进行混合。确保冻干试剂完全重新悬浮。然后，向复溶的试剂中加入 5 μL DNA 模板并充分混合。
在 60 摄氏度下在水浴或加热块中孵育 60 分钟。为了在孵育后终止反应，加入 5 μL 的 10x 凝胶上样缓冲液，然后将 5 μL 的反应产物加入到用嵌入核酸染色剂染色的 2% 琼脂糖凝胶上。在 1x TBE 缓冲液中以 100 伏电压运行凝胶 35 分钟，然后通过紫外光观察结果。
要使用羟基萘酚蓝 （HNB） 或嵌入染料进行 LAMP 反应，通过混合以下试剂（包括 HNB 或荧光嵌入染料）来制备 1 mL 重构缓冲液。通过脉冲涡旋混合 10 秒钟。按照刚才描述的方式进行 LAMP 反应，并使用紫外光或肉眼可视化结果。
要使用试管扫描仪进行 LAMP 反应，将 5 μL DNA 添加到含有荧光嵌入染料的复溶试剂中，然后将封闭的试管插入试管扫描仪中。将孵育温度设置为 60 摄氏度，并在 520 纳米处测量荧光 60 分钟。该图显示了使用新鲜制备的试剂和冻干试剂在琼脂糖凝胶上的 LAMP 反应结果。
观察冻干试剂保持其活性。两种试剂制备的 LAMP 反应体系检测到 25 拷贝的 DNA 模板。在该图中，显示了反应中用 HNB 或荧光嵌入染料检测反应产物的过程。
在反应中加入 HNB 会产生从紫色到蓝色的视觉颜色变化，反应中存在 25、50 和 100 个拷贝的 DNA 模板。此外，当存在相似的 DNA 拷贝数时，在反应中加入荧光嵌入染料在紫外光下显示出强烈的荧光信号。这里显示的是使用 Tube 扫描仪通过荧光嵌入染料实时监测荧光信号的结果。
14、18、21 和 23 分钟后荧光信号高于基线，反应中有 10^6、10^4、10^3 和 100 个拷贝的 DNA 模板。一旦掌握，这个过程可以在 90 分钟内完成。开发后，该检测为资源有限地区快速诊断贝氏柯克斯体感染铺平了道路。
看完这个视频，您应该对如何重构冻干 LAMP 试剂有了很好的了解。不要忘记患者样本可能具有传染性，因此在执行此程序时应始终采取安全预防措施。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种利用冻干试剂的简单环介导等温扩增（LAMP）方法，用于检测患者样本中的C. burnetii。该方法特别适用于Q型发热盛行的资源有限的环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 诊断方法
- 传染病
背景
- C. burnetii是Q型发热的病原体。
- 传统的检测方法可能需要复杂的储存条件。
- 冻干试剂简化了过程。
- 这种方法适用于流行地区。
研究目的
- 开发一种LAMP方法来检测C. burnetii。
- 提高低资源环境中诊断方法的可及性。
- 证明冻干试剂的有效性。
使用的方法
- LAMP冻干试剂的制备。
- 使用分光光度计测定质粒浓度。
- 计算质粒DNA拷贝数。
- 实验室技术员展示程序。
主要结果
- LAMP方法成功检测C. burnetii。
- 冻干试剂在不需要特殊储存的情况下保持稳定。
- 该方法在资源有限的环境中有效。
- 演示确认了该协议的可用性。
结论
- LAMP方法是检测C. burnetii的可行替代方案。
- 冻干试剂简化了诊断过程。
- 这种方法可以改善流行地区的疾病管理。
常见问题
Executive Industry Relevance
Lyophilized LAMP reagents for Coxiella burnetii detection address the need for robust, field-deployable molecular diagnostics in infectious disease surveillance and outbreak response. This approach enables sensitive nucleic acid detection without cold chain requirements, supporting rapid decision-making in resource-limited and decentralized settings. The method enhances portfolio flexibility for biopharma teams developing diagnostic platforms targeting emerging and neglected pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in clinical and environmental samples.
- Supports functional validation of nucleic acid targets through direct amplification and detection.
- Facilitates biological de-risking by confirming assay sensitivity and specificity at low copy numbers.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, lyophilized reagent format for reproducible assay setup across sites.
- Delivers quantitative outputs via fluorescence or colorimetric readouts for reliable sample comparison.
- Enables scalable screening workflows by simplifying reagent handling and storage logistics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by supporting detection of pathogen DNA in patient-derived matrices.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through robust, field-ready assay formats.
- Reduces operational risk in deploying diagnostics for emerging infectious threats.
Pipeline & Workflow Integration
This lyophilized LAMP platform integrates from early discovery through translational research, supporting rapid pathogen detection and assay deployment in diverse settings.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and target confirmation for infectious agents.
- Screening: Standardizes assay conditions and enables reproducible, quantitative detection across sample types.
- Analytics: Provides clear visual or fluorescent outputs for comparative analysis of sample positivity and assay sensitivity.
- Translational Research: Bridges laboratory and field diagnostics, supporting biomarker-driven surveillance and intervention studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, lyophilized reagent system adaptable to other pathogen targets and diagnostic platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection and reduces ambiguity in diagnostic workflows.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and logistical simplicity for global deployment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for diagnostic development and supports rapid response to infectious disease outbreaks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for emerging and endemic pathogens.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise for assay setup and interpretation.
- Needs basic laboratory instrumentation such as heating blocks, pipettes, and fluorescence or colorimetric readers.
- Demands cross-team standardization of reagent handling and result interpretation protocols.
- Adaptable to various sample matrices with appropriate DNA extraction methods.
- Stability and performance validated for at least one month at room temperature as supported by source data.
