Name: 逆转录病毒整合位点的扩增，新一代测序和基因组DNA制图 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解逆转录病毒整合位点的PCR扩增与新一代测序技术，使用HEK293T细胞进行转染和基因组DNA分析。该方法可精确绘制整合位点图谱，助力基础与临床逆转录病毒学研究。

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我们感谢同事 Stephen Hughes 和 Henry Levin 提供的关键建议，这些建议对于在 Engelman 实验室建立用于逆转录病毒整合位点测序的下一代测序（NGS）方案至关重要。本研究工作由美国国立卫生研究院基金 AI039394 和 AI052014（资助 A.N.E.）以及 AI060354（哈佛大学艾滋病研究中心）资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种从初始病毒感染步骤到基因组整合位点分布图谱绘制的逆转录病毒整合位点分析方案。该方案适用于任何逆转录病毒及可感染的细胞类型。此外，该检测流程具有较高的灵敏度，能够从相当于以感染复数（MOI）为 6.4 × 10-5 启动感染所获得的基因组 DNA 系列稀释样本中，回收到足够数量的唯一整合位点。这种高灵敏度使得该方案在应用于病毒载量较低的感染者样本时尤为有用，因为在这些样本中仅有少数细胞含有整合的前病毒。与本领域先前的方法学文献一致36,38,41-43，本方案中生物信息学部分的多个步骤将受益于开发定制化脚本以处理大规模序列数据文件。尽管本方案中采用的序列比对工具为 BLAT58，但用户可能会发现 Bowtie67（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）是一个合适的替代选择。
最近报道了一种用于确定莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）整合位点的替代性生物信息学分析流程19。该流程的优势在于已被开发为公开可用的独立软...

病毒DNA（vDNA）整合到宿主细胞基因组中是逆转录病毒生命周期中的关键步骤。该过程由病毒编码的整合酶（IN）完成，此酶通过两种不同的催化反应，最终形成稳定插入的前病毒1。IN亚基结合由逆转录生成的线性vDNA末端，形成一种高级结构的整合体（intasome），其中vDNA末端通过IN多聚体相互连接并稳定2-4。IN在保守的5'-CA-3'序列下游对vDNA的3'端进行切割，这一过程称为3'-加工，使每个vDNA末端暴露出带有活性羟基的凹陷3'端5-8。随后，整合体作为包含多种宿主与病毒蛋白的大分子复合物——前整合复合物（preintegration complex, PIC）的一部分被转运至细胞核内9-11。当整合体接触到细胞内的靶DNA（tDNA）后，IN利用vDNA 3'端的羟基，以交错方式切割tDNA的上下两条链，并通过链转移反应将vDNA的3'端与tDNA的5'磷酸基团共价连接12,13。
逆转录病毒在局部和全局尺度上均表现出整合位点偏好性。在局部，共识整合位点包含弱保守的回文结构tDNA序列，这些序列从vDNA插入位点上下游约5至10个碱基对（bp）范围内延伸14,15。在全局层面，逆转录病毒靶向特定的染色质注释区域16。目前已知有七种不同的逆转录病毒属——α至ε、lenti（慢病毒属）和spuma（泡沫病毒属）。其中，包括HIV-1在内的慢病毒倾向于在活跃转录基因的基因体内部进行整合17，而γ-逆转录病毒则优先整合至转录起始位点（TSSs）和活跃增强子区域18-20。与此形成鲜明对比的是，泡沫病毒强烈偏向于整合到异染色质区域，例如基因贫乏的核纤层相关结构域21。局部tDNA碱基偏好性在很大程度上由整合酶（IN）与tDNA之间特定的核蛋白相互作用网络所决定13,22,23。对于慢病毒和γ-逆转录病毒而言，其相对于基因组注释的整合位点选择在很大程度上受IN与相应宿主细胞因子之间相互作用的调控24-27。已有研究证实，改变IN与tDNA相互作用网络的具体特征13,22,23,28，以及破坏或重新设计IN与宿主因子之间的相互作用25-27,29-32，分别是实现局部和全局水平上重定向整合的有效策略。
用于鉴定逆转录病毒整合位点的DNA测序技术在过去几十年中取得了巨大进展。在早期研究中，研究人员通过繁琐的纯化和手动克隆技术，每次研究仅能获得少数几个独特的整合位点33,34。随着利用LM-PCR扩增LTR-宿主DNA连接区域，并结合将单个整合位点定位至人和小鼠草图基因组的能力，该领域发生了变革，从外源性体外培养细胞感染中回收的整合位点数量增加至数百到数千个17,18。近年来，LM-PCR与高通量测序（NGS）技术的结合使文库深度急剧提升。具体而言，焦磷酸测序可获得数万个独特的整合位点30,35-38，而利用DNA簇生成技术进行测序的文库则可产生数百万条独特的序列19-21,39。本文描述了一种优化的LM-PCR实验方案，用于通过DNA簇生成NGS技术扩增并测序逆转录病毒整合位点。该方法将必需的接头序列直接整合到PCR引物中，从而使其直接引入扩增后的DNA分子，因此无需在测序前额外进行接头连接步骤40。同时，本文也概述了生物信息学分析流程，从原始测序数据中解析LTR-宿主DNA连接区域，到将唯一的整合位点映射至相关的基因组特征。根据该领域先前方法学方案所确立的惯例36,38,41-43，可开发定制脚本来辅助完成生物信息学流程中的特定步骤。本实验方案的有效性和灵敏度通过代表性数据加以展示：对感染复数（MOI）约为1.0的体外培养细胞中的HIV-1整合位点进行扩增、测序和定位，并将该DNA样本以5倍梯度逐步稀释至未感染细胞DNA中，最大稀释比例达到1:15,625，相当于MOI约为6.4 × 10-5。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>适用于HEK293T细胞的标准细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH 30088.03</td><td>不同批次的血清可能需要预先筛选，以获得最佳的病毒产量</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002-Cl</td><td>添加至DMEM的抗生素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA</td><td>康宁</td><td>25-053-CI</td><td>用于从组织培养板上解离贴壁细胞</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA转染试剂</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 滤光片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-740-35B</td><td>用于过滤含有病毒颗粒的细胞培养基</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>用于降解病毒储备液中的残留质粒DNA</td></tr><tr><td>HIV-1 p24抗原捕获检测</td><td>ABL公司</td><td>5447</td><td>用于定量病毒生产的产量</td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>用于从细胞中纯化基因组DNA</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>使用该型号超声波破碎仪进行两轮处理，工作周期为5%，强度为3，每脉冲周期数为200，时间为80秒</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>建议使用市售水以降低样品交叉污染的可能性</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>用于文库构建过程中纯化 DNA</td></tr><tr><td>End-It DNA末端修复试剂盒</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>用于修复经超声处理的DNA样本的DNA末端</td></tr><tr><td>Klenow片段（3'-5'外切酶）&amp;ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>与 dATP 一起用于对修复后的 DNA 片段进行 A 尾修饰</td></tr><tr><td>dATP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0141</td><td>脱氧腺苷三磷酸</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>基因组DNA切割用限制性内切酶</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>限制性内切酶抑制上游HIV-1 U5序列的扩增</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>用于共价连接相容性DNA末端的酶</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制</td><td>让公司对寡核苷酸进行纯化。DNA 的纯化采用 HPLC 纯化即可 &amp;lt;30 个核苷酸；长链 DNA 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 聚合酶混合液</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>含PCR用DNA聚合酶的商用混合液</td></tr><tr><td>dNTPs（100 mM 溶液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0181</td><td>在冰上用无菌水将四种化学物质稀释，使其每种dNTP的中间工作浓度均为2.5 mM</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NanoDrop 2000</td><td>用于测定DNA浓度的分光光度计</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&amp;reg; 3.0</td><td>用于确认整合位点文库DNA浓度的荧光计</td></tr><tr><td>2200 TapeStation 系统</td><td>安捷伦</td><td>G2964AA</td><td>基于胶带的检测法以确认整合位点文库DNA片段大小分布</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>用于NGS</td></tr></tbody></table>

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组dna定位

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

逆转录病毒在局部和全局尺度上均表现出特征性的整合偏好。本文详细介绍了一种实验方案：（1）利用连接介导的PCR（LM-PCR）扩增结合高通量测序（NGS）技术，构建多样化的逆转录病毒整合位点文库；（2）使用BEDTools比对每个病毒-宿主连接位点的基因组位置；（3）对数据进行统计学分析。从感染细胞中提取基因组DNA后，通过限制性内切酶消化或超声处理将其片段化。经过适当的DNA末端修复后，将双链接头连接至DNA末端，并使用与病毒长末端重复序列（LTR）及连接接头DNA互补的引物进行半巢式PCR扩增。PCR引物携带NGS过程中DNA簇生成所需的序列，因此无需额外进行接头连接。在进行NGS之前，需进行质量控制（QC），以评估DNA片段大小分布及接头DNA的连接情况。对测序输出文件筛选含有LTR的读段，并去除定义LTR和接头的序列。将修剪后的宿主细胞序列使用BLAT比对至参考基因组，并筛选与参考基因组中唯一位置具有至少97%序列一致性的结果。对唯一的整合位点进一步分析其邻近核苷酸（nt）序列以及相对于各类基因组特征的分布情况。采用本方案，可在三天内从基因组DNA构建出复杂度高的整合位点文库。因此，从易感细胞的外源性病毒感染到整合位点分析的完整流程可在约一至两周内完成。该技术的近期应用包括对HIV感染患者整合位点的纵向分析。

表4列出了一个代表性实验的结果，用以说明NGS在从感染细胞培养物中回收整合位点时的灵敏度。实验中使用未感染的细胞DNA对感染样本的基因组DNA进行系列稀释，该感染样本中平均每细胞含有一个整合事件40。稀释过程以5倍为梯度，最高稀释至1:15,625。随后，对该滴定系列中的基因组DNA通过超声处理或使用限制性内切酶MseI和BglII进行消化，再进行片段化，接着进行LM-PCR。根据上述方案，计算出唯一整合位点的数量，以及映射到选定基因组注释区域附近的位点数量。数据分析显示，从理论上仅有1/15,625细胞被感染的细胞所构建的文库中，仍可回收数十个唯一的整合位点（约为纯基因组DNA回收数量的1-2%）。
在分析整合位点数据集时，必须将数据与一组匹配的随机基因组位点进行比较，该组位点称为匹配随机对照（matched random control, MRC）。由于代表性实验结果分别通过限制性酶切或超声处...

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

逆转录病毒在局部和全局尺度上均表现出特征性的整合偏好。本文中，我们提供了一种详细的实验方案，用于（1）生成……

本实验的总体目标是从大量基因组DNA中通过PCR扩增逆转录病毒整合位点，并对所得的DNA文库进行测序，从而将精确的整合位置比对至参考基因组。该方法可通过分析整合位点在整个宿主基因组中的分布情况，帮助回答基础与临床逆转录病毒学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于其DNA测序深度，以及能够在一次测序运行中对多个样本进行多重检测。 转染前一天，将3.3 × 10⁶个HEK293T细胞接种于五块100毫米培养皿中，每皿加入10毫升添加补剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基。次日，使用 commercially available transfection reagents 或磷酸钙法，将携带全长逆转录病毒分子克隆的10微克质粒，或9微克包膜缺失的单周期载体加1微克VSV-G表达质粒共转染细胞。将转染混合物逐滴加入细胞培养基中。转染后，将细胞置于含5%二氧化碳的湿润化细胞培养箱中，于37摄氏度孵育。约48小时后，使用刻度移液管收集含病毒的细胞培养基，并通过重力流经0.45微米滤器过滤。接着，在4摄氏度下以200,000 ×g超速离心1小时，浓缩病毒。离心后，弃去上清液，保留约 500 微升含病毒的 DMEM FPS，重悬病毒沉淀。加入 20 个单位的 DNase，在 37 摄氏度下孵育 1 小时。根据生产商说明书，使用 HIV-1 p24 抗原捕获试剂盒测定 p24 浓度。感染前一天，在6孔板中每孔接种3.0 × 10⁵个HEK293T细胞，加入2.5毫升含胎牛血清的DMEM培养基，置于组织培养箱中过夜培养。用新鲜DMEM完全培养基将病毒p24浓度调整为500纳克/毫升，每孔加入500微升进行感染。在组织培养箱中孵育2小时。2小时后，向每个孔中加入2毫升预热至37摄氏度的含血清DMEM培养基，并将培养板放回培养箱中。感染后48小时，移除培养基，并用2毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。通过加入0.5毫升预热至37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，数秒后在显微镜下观察各孔中细胞是否脱落。接着加入2 mL预热的DMEM FPS，用刻度移液管轻轻吹打10次以重悬细胞。将悬液转移至含有18 mL预热DMEM FPS的75 cm²组织培养瓶中，放回组织培养孵箱。感染后至少五天，按前述方法收集细胞，并用移液管将其重悬于5 mL预热的DMEM FPS中。在室温下以 2,500 ×g 离心溶液 5 分钟，然后吸除并弃去上清液。最后，使用市售试剂盒从细胞沉淀中提取基因组 DNA。用 200 微升 pH 8.5 的毫摩尔 Tris-HCl 洗脱试剂盒提供的离子交换柱中的 DNA。基因组DNA超声处理后，使用PCR纯化试剂盒纯化超声处理的DNA。接着，使用末端修复试剂盒对DNA进行修复。DNA再次纯化后，用Klenow Exo-Minus酶对DNA进行A尾修饰。或者，通过限制性内切酶消化进行片段

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逆转录病毒整合位点的扩增，新一代测序和基因组DNA制图

线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本文介绍一种在人类细胞中对基于莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录病毒载体整合位点进行全基因组定位的实验方案。...

逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

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