逆转录病毒整合位点的扩增，新一代测序和基因组DNA制图
2016年3月22日
我们描述了一种方案，用于从感染细胞的基因组 DNA 中扩增逆转录病毒整合位点，对扩增的病毒-宿主连接进行测序，然后将这些序列映射到参考基因组。我们还描述了使用 BEDTools 量化整合位点相对于各种基因组注释分布的技术。
该程序的总体目标是从大量基因组 DNA 中 PCR 扩增逆转录病毒整合位点，并对所得 DNA 文库进行测序，以便将精确的整合位点映射到参考基因组。该方法可以通过分析整个宿主基因组中整合位点的分布来帮助回答基础和临床逆转录病毒学中的关键问题。该技术的主要优点是 DNA 测序深度，并且一次测序运行中可以对许多样品进行多重检测。
转染前一天，将 3.3 倍 10 至 6 个HEK293T细胞放入 5 个 100 毫米培养皿中，每个培养皿中加入 10 毫升补充的 Dulbecco's 改良 Eagle 培养基中。第二天，使用市售的转染试剂或磷酸钙，用 10 μg 载有全长逆转录病毒分子克隆的质粒或 9 μg 包膜省略的单轮载体加上 1 μg VSV-G 表达构建体转染细胞。将混合物逐滴加入细胞培养基中。
转染后，将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿细胞培养箱中孵育。大约 48 小时后，使用容量移液管收获含病毒的细胞培养基，并通过重力流将其通过 0.45 微米过滤器。接下来，通过在 4 摄氏度下以 200， 000 G 超速离心 1 小时来浓缩病毒。
离心后，去除上清液，直到剩余约 500 μL DMEM FPS，然后重悬病毒沉淀。加入 20 单位的 DNase，在 37 摄氏度下孵育 1 小时。根据制造商的说明，使用 HIV-1 p24 抗原捕获试剂盒测定 p24 浓度。
感染前一天，在 6 孔板中每孔 2.5 毫升 DMEM FPS 中将 HEK293T 细胞接种 3.0 乘以 10 至第 5 个细胞，并在组织培养箱中孵育过夜。在 500 微升新鲜 DMEM FPS 中，用每毫升 500 纳克的最终病毒 p24 浓度感染细胞。在组织培养箱中孵育 2 小时。
两小时后，向每个孔中加入 2 毫升预热至 37 摄氏度的 DMEM FPS，然后将板放回培养箱中。感染后 48 小时，去除培养基并用 2 毫升磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。加入 0.5 毫升预热至 37 摄氏度的胰蛋白酶-EDTA 收获细胞，几秒钟后，目视检查孔中是否有细胞脱落。
接下来，加入 2 毫升预热的 DMEM FPS，并用容量移液管轻轻上下吹打 10 次，重悬细胞。将溶液转移至含有 18 mL 预热 DMEM FPS 的 75 平方厘米组织培养瓶中，然后放回组织培养箱中。感染后至少五天，像以前一样收获细胞，并通过移液重悬于 5 毫升预热的 DMEM FPS 中。
在室温下以 2， 500 Gs 的速度离心溶液 5 分钟，然后吸出并弃去上清液。最后，使用市售试剂盒从细胞沉淀中提取基因组 DNA。在 pH 值为 8.5 的条件下，用 200 μL 毫摩尔 Tris-HCL 从提供的离子交换柱中洗脱 DNA。
对基因组 DNA 进行超声处理后，使用 PCR 纯化试剂盒纯化超声处理的 DNA。接下来，使用末端修复试剂盒修复 DNA。像以前一样纯化 DNA 后，使用 Klenow Exo-Minus 酶对 DNA 进行尾部处理。
或者，对于限制性核酸内切酶消化的片段化，使用产生 5'TA 突出端的酶混合物以及从上游病毒 LTR 下游裂解的不相容酶（如 BglII）切割基因组 DNA。切割 10 μg 基因组 DNA，最终体积为 100 μL。在 37 摄氏度下孵育过夜。
确保使用 PCR 纯化试剂盒纯化最终的 DNA。用于超声处理 DNA 的连接子必须包含相容的 T 3' 突出端，而用于 MseI 消化 DNA 的连接子必须包含相容的 5'TA 突出端。首先在 35 微升 Tris-HCL EDTA 缓冲液中对 10 微摩尔的短接头链和长接头链进行退火，加热至 90 摄氏度，然后以每分钟 1 摄氏度的速度缓慢冷却至室温。
接下来，每个基因组 DNA 样品至少准备 4 个平行连接反应，其中包含 1.5 微摩尔连接的接头、1 微克片段化 DNA 和 800 单位的 T4 DNA 连接酶，最终体积为 50 μL。在 12 摄氏度下结扎过夜。对于通过超声处理制备的样品，使用从上游 LTR 下游裂解的限制性内切酶消化纯化的连接反应。
在制造商推荐的条件下使用 100 单位的适当酶过夜。确保使用 PCR 纯化试剂盒纯化最终产物。使用此处显示的试剂制备第一轮 PCR。
使用以下参数运行第一轮 PCR：94 摄氏度 2 分钟，然后是 30 个 94 摄氏度 15 秒、55 摄氏度 30 秒、68 摄氏度 45 秒的循环。在 68 摄氏度下完成 10 分钟。汇集第一轮反应并像以前一样纯化 DNA。
然后准备包含此处所示试剂的第二轮 PCR。使用与第一轮 PCR 相同的循环参数。从第二轮反应中汇集和纯化 DNA 后，进行质量控制和下一代测序，并使用方案书面部分中的详细说明分析整合位点。
使用网络徽标软件对齐通过限制性内切酶消化制备的文库的整合位点（如左图所示）或超声处理（如右图所示）。描绘了滴定系列中的每种稀释度，从图顶部的纯 DNA 到底部的最大稀释度 1 到 15， 625。确定性程度随着感染细胞 DNA 稀释的增加而降低。
该图显示了 50， 000 个独特基因组位点的匹配随机对照的序列徽标。请注意，相比之下，从 MRC 数据集对齐的随机位点未能产生明显水平的基础偏好。一旦掌握，就可以在 3 天内从基因组 DNA 制备整合位点文库。
因此，从初始感染到完成生物信息学的整合位点映射可以在大约两周内完成。按照此程序，可以对数千甚至数百万个独特的逆转录病毒整合位点进行编目，并且可以进行各种分析以量化插入位点和基因组注释之间的关联。
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概览
该协议概述了从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点，随后进行测序和映射到参考基因组的过程。它还包括使用BEDTools定量分析整合位点分布的技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 逆转录病毒学
- 基因组学
- 生物信息学
背景
- 理解逆转录病毒整合对基础和临床研究都至关重要。
- 映射整合位点有助于阐明病毒在宿主基因组中的行为。
- 高测序深度允许对多个样本进行详细分析。
- 在测序运行中多重化样本可以提高效率。
研究目的
- 从基因组DNA中PCR扩增逆转录病毒整合位点。
- 对扩增的DNA进行测序以精确映射到参考基因组。
- 分析整合位点在宿主基因组中的分布。
使用的方法
- 用逆转录病毒质粒转染HEK293T细胞。
- 使用PCR扩增整合位点。
- 对所得DNA文库进行测序。
- 使用生物信息学工具将序列映射到参考基因组。
主要结果
- 成功扩增和测序逆转录病毒整合位点。
- 准确地将整合位置映射到参考基因组。
- 定量分析整合位点分布。
- 对逆转录病毒在宿主基因组中的行为有了深入了解。
结论
- 该方法为研究逆转录病毒整合提供了可靠的方法。
- 它增强了我们对病毒与宿主基因组相互作用的理解。
- 该协议可以适用于各种逆转录病毒研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput mapping of retroviral integration sites using LM-PCR and next-generation sequencing enables precise characterization of virus-host genomic interactions. This capability is critical for de-risking gene therapy vectors, understanding insertional mutagenesis, and supporting translational research in retrovirology. The protocol's scalability and quantitative outputs position it as a foundational tool for early discovery and preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of retroviral integration patterns to clarify insertional preferences and genomic risk loci.
- Supports biological de-risking by mapping integration events at nucleotide resolution.
- Facilitates predictive confidence in vector safety and mechanistic understanding of host-virus interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated integration site libraries for downstream comparative analyses.
- Standardizes workflows for reproducible, quantitative mapping of integration events.
- Enables multiplexed sample processing, increasing throughput and assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns integration site data with genomic features relevant to disease models and biomarker discovery.
- Provides continuity from in vitro infection studies to preclinical vector safety assessments.
- Supports risk-adjusted advancement of gene-modified cell therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting both mechanistic studies and translational safety assessments.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on integration site selection and host genomic impact.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative integration site data for comparative evaluation.
- Analytics: Provides high-complexity datasets for statistical analysis of insertional patterns and genomic feature associations.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical safety and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for diverse retroviral and gene therapy applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector safety and target validation.
- Operational Value: Standardizes integration site mapping for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for gene therapy and retroviral vector programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on integration site profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, NGS library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to high-throughput sequencing platforms and computational infrastructure for mapping and statistical analysis.
- Demands rigorous quality control for DNA fragmentation, linker ligation, and PCR amplification steps.
- Adaptable to different retroviral systems and restriction/sonication fragmentation strategies.
- Dependent on robust reference genomes and annotation databases for accurate site mapping.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Generation of Retroviral Stock
2:20
Viral Infection of HEK293T Cells
4:30
Genomic DNA Fragmentation
5:33
Ligation of Linker Oligonucleotide to Fragmented Genomic DNA
6:58
Amplification of Viral LTR-host Genomic DNA Junctions by Semi-nested PCR
8:02
Results: Sequence Logos Depicting HIV-1 Base Preferences from Representative Experiment Libraries
8:52
Conclusion
