中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用
March 25th, 2016
中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文描述了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞以及人早幼粒细胞 （HL60） 细胞沿粒细胞途径的分化;测试它们对淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性的作用。
这些程序的总体目标是通过密度梯度离心从人血液样品中快速分离高度纯化的中性粒细胞，以使用两个 D 和三个 D 细胞培养模型研究它们在淋巴瘤细胞对癌症治疗敏感性中的作用。这些方法可以帮助回答有关先天免疫系统与癌症之间相互作用的关键问题，例如中性粒细胞介导的肿瘤细胞反应在癌症治疗中起什么作用。密度梯度分离的主要优点是能够在短时间内分离纯免疫细胞群，而不会使细胞暴露于改变功能的刺激下。
为了分离原代白血病细胞和中性粒细胞，首先将来自慢性淋巴细胞白血病患者样本的 15 毫升 EDTA 处理血液加入单独的无菌 50 毫升试管中。用 15 毫升 RPMI 稀释血液。然后小心缓慢地在血液下加入 15 毫升室温密度梯度溶液，注意不要混合各层。
通过离心分离细胞后，将可以看到四个不同的阶段。血小板和血浆在顶部，单核细胞的白色环，密度梯度溶液，以及底部的粒细胞和红细胞。使用塑料牧场移液器，首先将原代白血病细胞的白环转移到新的 50 毫升试管中。
用最多 50 毫升含钙和镁的 PBS 洗涤细胞。并将上颚重新悬浮在 5 毫升新鲜 PBS 中。然后，向细胞中再添加 45 毫升 PBS，并再次旋转细胞。
第二次洗涤后，将上颚重新悬浮在完整的 RPMI 培养基中。并计算活的原代白血病细胞的数量。接下来，去除血小板血浆和密度梯度层，并向粒细胞红细胞期添加 25 毫升 PBS 和 25 毫升氯化钠中的糊精。
倒置将试管混合十次。然后，让细胞在室温下静置 30 分钟。在平衡结束时，将上层红细胞贫中性粒细胞转移到无菌的 50 毫升试管中，然后离心细胞。
在 5 毫升 PBS 中重悬上颚，并用 45 毫升红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。在室温下避光 15 分钟后，再次旋转细胞，并在 50 毫升 PBS 中清洗上颚。洗涤结束时，将细胞重悬于完整的 RPMI 培养基中，并计数活的中性粒细胞的数量。
将两组细胞稀释至每 50 微升 RPMI 浓度 300， 000 个细胞，并将样品分装在适当数量的 5 毫升传真管中。离心后，将沉淀重悬于 50 微升补充有 FBS 的 PBS 中。为了确定分离的细胞亚群的纯度，用与 APC 偶联的抗人 CD19 抗体标记原代白血病细胞的等分量，以及用表中所列的抗人抗体混合物标记纯化的中性粒细胞的等分量，在 4 摄氏度下避光 30 分钟。
孵育结束时，在 500 微升补充有 FBS 的 PBS 中洗涤细胞，并在 200 微升新鲜 FBS PBS 中重悬上颚。然后，通过流式细胞术分析细胞群的纯度，注意对样品进行颜色补偿。要将原代白血病细胞与自体中性粒细胞共培养，请参阅每毫升 200， 000 个细胞的白血病细胞单独或与自体中性粒细胞一起在 RPMI 完全培养基中的 24 孔板中。
小心混合细胞。然后用 Brutton 酪氨酸激酶抑制剂在 37 摄氏度和 5% CO2 下处理细胞 24 小时。第二天，在 5 毫升塑料传真管中收集细胞的等分量。
然后，旋转细胞并在 1 毫升 FBS PBS 中洗涤沉淀。第二次离心后，根据制造商的说明在室温下避光标记细胞苯胺 5 和碘化丙啶 10 分钟。然后，使用图示的门控策略通过流式细胞术分析中性粒细胞和原代白血病细胞。
要建立 3D 共培养物，请单独添加 50， 000 个 RL 淋巴瘤 b 细胞，或在无菌 15 毫升试管中与 HL60 分化细胞混合。使用 1 毫米移液器吸头离心样品并将沉淀重悬于 300 微升基底膜基质中，开口切成 2 至 3 毫米。接下来，在 37 摄氏度和 5% CO2 的温度下，在 24 孔板的每个孔中孵育 30 微升细胞 30 分钟。
在孵育结束时，向每个孔中加入 1 毫升完全 RPMI 培养基，并将 3D 培养物放回培养箱中再放置 7 天，每两天更换一次培养基。第 5 天，向培养物中加入 10 纳摩尔的 incristine。培养一周后，吸出培养基，并用 1 毫升冰冷的 PBS 洗涤每个孔两次。
然后，向每个孔中加入 3 毫升含 EDTA 的冰冷 PBS，并用 200 微升移液器吸头刮擦孔底部以分离凝胶。在冰上轻轻摇晃板 30 分钟。然后，将细胞悬液转移到单独的无菌 15 ml 试管中，在冰上轻轻摇动 30 分钟。
确认均质细胞悬液的外观。然后，离心细胞，然后进行 PBS 洗涤，并将沉淀重悬于含 FBS 的新鲜 PBS 中。最后，如前所述，用适当的抗体和活力染料标记细胞，并使用图示的门控策略通过流式细胞术分析 RL 和 HL60 分化的细胞。
通过流式细胞术分析分离细胞群的所有事件表明，这种分离方法可产生高纯度的单峰 CD19 原代白血病细胞群。超过 90% 的纯中性粒细胞群对白细胞常见抗原 CD45 以及成熟中性粒细胞表达的 CD15 和 CD16 抗原呈阳性。对来自中性粒细胞共培养物的原代白血病细胞进行步态分析表明，与单独培养原代白血病细胞相比，中性粒细胞对酪氨酸抑制剂依鲁替尼的细胞存活发挥保护作用，活的原代白血病细胞数量显着增加。
分化的 HL60 细胞在三维培养物中比中性粒细胞更稳定。在诱导粒细胞发育后，这些细胞比未分化的 HL60 细胞小，并表达更高水平的 CD11B 和 CD38。分化的 HL60 细胞也表现出多叶核。
这些细胞对 RL 细胞表现出保护作用，与单独培养的长春蛋白处理的淋巴瘤细胞相比，长春蛋白处理后三种 D 共培养物中活的 RL 细胞数量显着增加。掌握后，密度梯度离心法可在 90 分钟内完成。经过开发，这些技术为癌症生物学领域的研究人员在临床前模型和患者样本中探索各种白细胞对肿瘤恶性肿瘤的影响铺平了道路。
看完这个视频，你应该对如何快速可靠地分离单核细胞和中性粒细胞有一个很好的了解，分析中性粒细胞对介导肿瘤细胞对抗癌药物反应的影响，并建立三维共培养物。
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概览
本文描述了使用密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞以及HL60细胞沿粒系分化的过程。该研究旨在探讨中性粒细胞在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。
- 它们在先天免疫反应中起着至关重要的作用。
- 了解它们与癌细胞的相互作用可以为治疗策略提供信息。
- 密度梯度离心法可以分离出纯净的免疫细胞群体。
研究目的
- 从人血样本中分离出高度纯化的中性粒细胞。
- 探索中性粒细胞在淋巴瘤细胞对癌症治疗敏感性中的作用。
- 利用二维和三维细胞培养模型进行研究。
使用的方法
- 密度梯度离心法用于中性粒细胞分离。
- 使用来自慢性淋巴细胞白血病患者的EDTA处理血液。
- 用RPMI稀释法准备血液样本。
- 分层密度梯度溶液以分离不同类型的细胞。
主要结果
- 成功分离中性粒细胞，而不改变其功能。
- 对中性粒细胞与淋巴瘤细胞之间的相互作用有了新的认识。
- 可能对提高癌症治疗效果有所启示。
- 为未来癌症免疫学研究建立了方法。
结论
- 中性粒细胞可能显著影响淋巴瘤细胞对治疗的反应。
- 密度梯度分离是一种有效的分离免疫细胞的方法。
- 需要进一步的研究来全面了解中性粒细胞在癌症治疗中的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding neutrophil-mediated modulation of lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents addresses a critical gap in tumor microenvironment research. This method enables rapid isolation of functional neutrophils from patient samples, supporting mechanistic de-risking in immuno-oncology target validation. The approach provides predictive confidence for evaluating how innate immune cells influence therapeutic response in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neutrophil-lymphoma interactions to clarify mechanistic hypotheses in cancer therapy resistance.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible method to isolate >90% pure neutrophils without functional alteration.
- Strategic Value: Supports target de-risking by quantifying neutrophil-mediated protection against agents like ibrutinib and vincristine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified neutrophil and lymphoma cell co-cultures for standardized compound sensitivity screening.
- Operational Value: Delivers quantitative viability readouts via flow cytometry to assess therapeutic agent effects in immune-cell-containing models.
- Strategic Value: Enables assay readiness for evaluating immunomodulatory compounds in 2D and 3D formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses differentiated HL60 cells as neutrophil surrogates to extend 3D co-culture stability beyond primary neutrophil limitations.
- Operational Value: Establishes a workflow compatible with patient-derived CLL samples and lymphoma cell lines for translational continuity.
- Strategic Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling tumor microenvironment influences on drug sensitivity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by enabling immune-contextualized drug sensitivity testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neutrophil-mediated tumor cell responses to tyrosine kinase inhibitors and chemotherapeutic agents.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative co-culture models for compound screening in physiologically relevant settings.
- Analytics: Provides flow cytometry-based readouts of cell viability and purity to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects isolation of primary leukemic cells with functional neutrophil assays to model patient-relevant interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying leukocyte-tumor interactions across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lymphoma therapy resistance by isolating neutrophil contributions to cell survival.
- Operational Value: Enables standardization of neutrophil isolation and co-culture across labs with defined purity and viability thresholds.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing microenvironment-driven resistance mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of agents based on their susceptibility to neutrophil-mediated protection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in density gradient centrifugation, sterile cell handling, and flow cytometry.
- Needs access to clinical blood samples, RPMI, PBS, Dextran, lysis buffer, and culture media.
- Demands standardization of neutrophil purity assessment via CD15/CD16/CD45 staining.
- Requires adaptation for 3D models using differentiated HL60 cells due to primary neutrophil short half-life.
- Limited by neutrophil viability decay in vitro, necessitating same-day use or surrogate models for extended assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Primary Leukemic Cell and Neutrophil Isolation
5:25
Primary Leukemic Cell and Neutrophil Purity and Co-culture Phenotype Analysis by Flow Cytometry
7:58
3D Culture Setup and Phenotype Analysis
10:59
Results: Analysis of the Role of Neutrophils in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents
13:09
Conclusion
