机械刺激传入输出和神经末梢标签联合录制在小鼠毛囊披针形结局

提出了一种简单而新颖的技术，用于记录由于机械刺激支配小鼠耳朵皮肤毛囊的栅栏末端的披针形末端而引起的传入放电。

该程序的总体目标是展示一种快速简单的方法，将活细胞想象和电生理记录相结合，在众所周知难以接近、机械敏感的神经元末梢中。这种方法可以帮助解决机械感觉中的关键问题。例如，突触样囊泡的作用或候选机械换能通道在完全分化的末端的药理学，原位。

这种技术的主要优点是它非常简单，但可以直观地访问完全差异化的终端以进行生理研究。虽然这种方法侧重于毛囊传入，但它也可以深入了解其他较低阈值的机械感觉系统，例如肌梭、默克尔感觉末梢和压力感受器。这项技术的影响延伸到开发新的药物靶点来调节机械传感器，包括治疗异常血压调节。

将一只年轻的成年小鼠斩首后，将头部背侧朝上，放入加气的 Liley 溶液中，放入 50 厘米宽的底部培养皿中，在立体解剖显微镜下。大约每 10 分钟用硅烷气体彻底冲洗解剖区域。现在，使用弹簧弓剪和三号镊子小心地切开并分离耳廓底部的皮肤。

暴露外耳道的神经支配和软骨。识别三叉神经和耳大神经的下颌分支，因为它们从下颌关节裂隙的颅骨中出现。这两个神经分支穿过软骨，支配耳廓皮肤的凹凸方面。

然后，在下颌和乳突之间的凹槽中，确定三叉神经分支的出口位置。轻轻地将耳廓从头骨上拉开，露出它们的长度。一旦暴露出来，尽可能靠近颅骨切开神经。

接下来，用弹簧弓剪从头上取下耳廓。避免剪掉分裂神经的远端残端，并尽量减少浓密的毛发数量。将耳廓转移到一个衬有硅橡胶的培养皿中，培养皿中装满了加气的 Liley 溶液。

现在，通过在最窄处分开外耳道来打开它。然后，将耳廓压平，凹面朝下，并用规则间隔的、非常细的昆虫针沿着边缘固定该侧。接下来，用剪刀钝器解剖，从耳廓和下划线软骨上完全去除裸露的背侧皮肤。

在此步骤中不要损伤前皮肤。然后，使用镊子握住一根细昆虫针，轻轻伸展在皮肤和外耳道软骨之间向后出现的下颌骨分支的横断分支。用尽可能细的针将这些神经分支固定在板上。

刺穿结缔组织，毗邻它们的切割端，而不是神经块本身。通过从神经分支周围去除大部分周围结缔组织来完成组织准备，但不要因过度拉扯或切割而损伤神经。为了用重要的染料或药物治疗毛囊机械感应末端，请沿着耳廓边缘的 5 毫米小心地剥离皮下脂肪层的泡沫状纤维弹性软骨。

因此，打开一个方形窗口，露出真皮和毛囊的基部。使用年轻的小鼠可以最大限度地减少前后皮肤层之间的粘附以及去除底层软骨的难度。这两者都增加了成功染色的可能性。

通过将制剂转移到录音室的硅衬里底座上。使用细昆虫针，将耳朵固定在边缘周围，将耳根部干净的神经放在两个吸力电极附近。一个用于记录，另一个是冷漠电极，用于向差分放大器提供中性信号。

对于记录电极，请仔细将开口的孔径和内径与选择用于记录的神经的厚度相匹配。完成后，这通常对于任何系列的实验都是恒定的。一段长的神经需要紧贴内部。

要将神经吸入电极，请从通过硅胶管连接的 2 毫升注射器中轻轻抽吸。在记录电极中，通过在抽吸过程中用细昆虫针轻轻地撤回并重新插入神经，确保神经是笔直的，而不是折叠或加倍的。现在，吸入一些周围的结缔组织或柔软、柔韧的脂肪组织，在电极孔中形成水密密封。

在电极之间形成平衡的阻抗对于高质量、尊重的记录至关重要。关键是在神经周围形成高阻力、防水的密封。接下来，如果尚未通过自发毛细管作用填充盐水，则通过抽吸用盐水填充无差别的电极。

然后，将相同的银记录线放入记录和无差别电极的内孔中。在另一端，电线应连接到两芯屏蔽电缆的不同芯线。确保记录电极中的电线接触盐水并靠近神经，但不要破坏密封。

将电线插入无关紧要的电极的末端。接下来，将接地电极（一种银-氯化银颗粒）放入浴中。将此电极连接到连接到记录电极的两芯电缆的屏幕上。

在示波器上查看它们的各个信号，以检查两个通道的电噪声水平是否相似。在两个电极平衡之前，记录电极中的自发动作电位可能不可见。为了校正背景噪声差异，通过将脂肪结缔组织进一步吸入电极来增加一个通道的阻抗。

一旦电极具有平衡的背景，切换到差分记录并寻找自发动作电位，或通过用火焰抛光玻璃棒抚摸耳廓边缘的毛发来调用动作电位。接下来，通过计算机界面记录神经电图。并通过音响系统馈送神经图，使尖峰的声音刚好高于基线噪声。

这种听觉反馈继电器在进行实验时非常有用。接下来，通过手动刺激毛发来确认清除区域附近毛囊的神经支配完好无损。现在，在脂肪清除窗口的水平折叠一到两毫米的耳皮边缘，露出下面的毛发。

在相对的皮肤层之间留出充满盐水的间隙。仔细聆听时，用玻璃棒轻轻抚摸沿折叠边缘突出的毛发。请勿触摸皮肤。

根据需要，检查示波器以评估输出。为了对刺激诱发的动作电位进行受控记录，请使用连接到陶瓷压电致动器的 10 厘米硼硅酸盐微电极玻璃的机械探针。放置探头，使其平行于皮肤褶皱移动并接触毛发，而不是皮肤。

将其放在皮肤表面上方约半毫米到 1 毫米处。然后，通过在探头移动时监听音频输出来手动验证刺激。现在，设置软件以驱动对一小块头发的机械刺激。

例如，以每 10 秒 5 赫兹正弦波对 3 秒模拟进行编程。这需要探针位移在 200 到 2， 000 微米之间。然后继续使用重复的自动刺激来检查神经中记录的反应的一致性。

可重复的结果应该是可实现的。当结果一致时，将重复频率降低到每 30 秒一次。文本协议中提供了进一步的说明。

为了研究机械感觉通道的特性并标记毛囊周围的机械感觉末端，向溶液中加入 10 微摩尔 FM1-43，静置 60 分钟。同时继续用振荡探头刺激毛发。这种染料阻断了培养物和耳蜗毛细胞中的候选转导通道和感觉神经元。

然而，它不会阻止成熟毛囊原位传入的放电。末端的标记显示染料进入末端，这些末端在整个染料暴露过程中继续对机械刺激做出反应。使用所述方案制作的神经电图通常显示持续的动作电位活动，即使没有手动刺激，包括最大尺寸的动作电位。

自发活动以每秒约 10-20 个尖峰的速度发生，没有结构或张力的迹象。刺激期之间间隔的自相关总是相当平坦的。在对毛干进行 5 赫兹、500 微米的机械刺激期间，总输出通常会上升到每秒 50 个尖峰左右。

周期直方图的构建揭示了反应的强烈夹带，每个正弦周期有 4 到 10 个尖峰。当然，这是相当可重复的，响应被锁定的波形相位取决于振动探头接触头发的位置及其在该点的运动方向。然后探索毛囊披针形神经末梢通道药理学。

即使暴露于 FM1-43，这些通道仍会继续响应，FM1-43 可以阻断一些机械感觉通道，例如培养物中的感觉神经元或体外耳蜗毛细胞中的通道。一旦掌握了这项技术，直到开始记录神经电图，可以在 60 到 90 分钟内完成。在尝试此程序时，重要的是在电极中产生高电阻电收缩，如果与可视化卵泡结合使用，则使用小小鼠来提高染料渗透和光学清晰度。

我们采用了这种方法的想法，最初由一位亲密的同事、现已退休的教授 Clarke Slater 和他的硕士生 Nakul Kain 提出，当时我们告诉他们突触样囊泡在肌梭机械感觉中的可能作用，以及需要一种更好的方法来用 FM1-43 可视化它们。遵循此程序，可以使用药理学和活性染料等方法进行标记，以回答诸如哪些是机械换能器通道和原位分化末端以及机械刺激是否可以通过调节突触样囊泡循环来调节染料摄取和释放等问题。不要忘记 FM1-43 尚未对其进行毒性评估，应将其视为危险性。