Name: 制造和Acoustofluidic设备的运营支撑体声波驻波的聚焦鞘颗粒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习制造声流控器件的方法，利用体声波驻波实现微米级颗粒的无接触聚焦与分离。该技术采用标准光刻和深反应离子刻蚀工艺，适用于片上细胞术和细胞分选研究。

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本工作得到了美国国家科学基金会（通过授予 C.W.S.、D.F.C. 和 K.A.O. 的资助 DMR-1121107、CMMI-1363483 以及研究生研究奖学金 GRF-1106401）和美国国立卫生研究院（R21GM111584）的支持。作者无利益冲突。

1. 光刻
<ol>
	<li>使用合适的软件包设计光刻掩模，并将设计提交给合格的光刻掩模制造商。21</li>
	<li>在洁净室环境中，用6&#34; 单面抛光硅片，用稳定的丙酮流（≥99.5%；参见 表 1）随后用甲醇（99.8%；见 表 1）。用 N₂ 喷吹使晶圆干燥2 气体，并将晶圆置于95℃的热板上 &#176;C，持续 2 分钟。 
	注意：晶圆的掺杂分布和晶体取向不影响以下操作步骤。</li>
	<li>用铝箔覆盖旋涂机外部的凹槽（在标准旋涂罩内）以进行保护，并将洁净的硅片放置在旋涂机真空吸盘的中心位置，以固定硅片。</li>
	<li>将正性光刻胶小心倾倒至晶圆中心，直至光刻胶覆盖晶圆大部分区域。注意避免光刻胶中产生气泡。 
	注意：步骤 1.5-1.10 中的具体操作对应于所示的光刻胶 表1；不同光刻胶可能需要不同的操作步骤。</li>
	<li>通过执行以下步骤启动离心程序：
	<ol>
		<li>设定转速为300 rpm，加速度为100 rpm/sec，旋转时间为5秒，以开始旋转循环。</li>
		<li>设置转速为1,800 rpm，加速度为1,000 rpm/sec，旋转时间为60秒，以均匀涂布光刻胶。</li>
		<li>设定程序转速为 0 rpm，加速度为 1,000 rpm/sec，旋涂时间为 0 sec，以结束旋涂过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>释放卡盘上的真空，使用晶圆镊子从卡盘上取下晶圆。然后将晶圆置于热板上，在110 °C下烘烤 &#176;C，持续165秒。 
	注意：此步骤称为 &#34;软烘&#34;.</li>
	<li>将光掩模装入掩模对准仪/光刻机的掩模 holder 中。</li>
	<li>调整光刻机的参数，使能量剂量为 1,400 mJ/cm²2 (例如，输出强度为13.5 mW/cm2，使用曝光时间为 &#8764;103.7 秒</li>
	<li>从夹具上取下光刻后的晶圆，并将其放入相应显影液中（参见 表1）5 分钟。</li>
	<li>将晶圆从显影液中取出，用稳定的去离子水水流冲洗晶圆2O并用N₂吹干2 气体 
	注意：显影过度可能导致图案膨胀，而显影不足则可能导致光刻胶在光刻图案区域去除不完全。</li>
	<li>在显微镜下检查晶圆，以确认光掩模上的图案已成功转移至光刻胶。</li>
</ol>
2. 深度反应离子刻蚀
<ol>
	<li>将光刻图案化的硅片装入深反应离子刻蚀仪的腔室中，并按照标准刻蚀程序将流体通道刻蚀至硅片的预定深度。22</li>
	<li>刻蚀过程完成后，小心地将样品从腔室中取出。</li>
	<li>为去除硅片上的过量光刻胶，在专用于溶剂操作的通风橱中准备一个大烧杯，加入光刻胶去除剂溶液（见表1），并将烧杯置于65 °C的加热板上。</li>
	<li>将硅片浸入光刻胶去除剂溶液中，浸泡1小时。 
	注意：可使用不同的溶液去除光刻胶（例如，使用丙酮溶液（≥99.5%；见表1）浸泡过夜即可去除光刻胶）。</li>
	<li>将硅片从烧杯中取出，用交替流动的丙酮（≥99.5%；见表1）和异丙醇（≥99.7%；见表1）冲洗。用N2气体吹干硅片。</li>
</ol>
3. piranha 清洗
<ol>
	<li>在通风良好的通风橱内（专用于酸类操作），通过将 H2O2（30.0 wt.% 水溶液；见表1）与 H2SO4（95.0–98.0%；见表1）按 1:3 的比例加入洁净的大烧杯中，配制 piranha 溶液。 
	警告：Piranha 溶液具有强腐蚀性，是强氧化剂，极其危险。操作时须格外小心，并穿戴适当的个人安全防护装备。</li>
	<li>将离子刻蚀后的晶圆刻蚀面朝上浸入 piranha 溶液中，静置 5 分钟。小心取出晶圆，并用去离子 H2O 彻底冲洗。</li>
	<li>再次将晶圆浸入 piranha 溶液中 2 分钟。小心取出晶圆，并用大量去离子 H2O 彻底冲洗。</li>
	<li>在另一个专用于有机溶剂操作的通风良好的通风橱内，先用持续流动的丙酮（≥99.5%；见表1）冲洗晶圆，再用持续流动的甲醇（99.8%；见表1）冲洗，随后用 N2 气体吹干晶圆。按照适当的安全规程处理废弃的 piranha 溶液。</li>
</ol>
4. 准备硼硅酸盐玻璃盖片
<ol>
	<li>使用刻划工具在硼硅酸盐玻璃上刻出直线，以形成矩形片状结构（例如，8 x 4 厘米2小心地折断玻璃以回收矩形片段。</li>
	<li>取其中一块玻璃片，将其覆盖在所需设计（带实际尺寸）的打印件上，用黑色记号笔在玻璃上标记进出口的位置。</li>
	<li>在硼硅酸盐玻璃上钻出入口和出口孔。 
	注意：应始终佩戴适当的防护设备。
	<ol>
		<li>固定 1/8&#34; 将钻头插入钻床的钻夹头中。将带有标记的矩形玻璃片放置在已钻孔的铝板上方，使玻璃片上的标记对准铝板上的孔。用胶带将玻璃片固定在铝板上。</li>
		<li>小心降低进给手柄，开始在玻璃上钻小孔，并继续降低手柄直至钻穿玻璃。钻孔完成后，撕去胶带，缓慢抬起玻璃以清除玻璃粉末。将玻璃粉末放入盛有水的烧杯中，按照适当的安全规程处理废弃。</li>
		<li>使用不掉毛的吸水布小心擦干玻璃，并按照相同的步骤（4.3.1–4.3.2）钻制其余的进样口和出样口孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照上述第3节的相同步骤，使用芬顿溶液清洗矩形玻璃片。 
	警告：Piranha 溶液具有强腐蚀性，是强氧化剂，极其危险。操作 Piranha 溶液时须格外小心，并穿戴适当的防护装备。</li>
</ol>
5. 阳极键合
<ol>
	<li>使用刻划工具，在硅晶圆上围绕微流控芯片的周边刻出直线，使其略小于矩形玻璃片的尺寸（例如，7 × 3 厘米2沿刻蚀线小心地将晶圆掰断。</li>
	<li>用稳定流动的丙酮（≥99.5%；参见 表1）随后用甲醇（99.8%；见 表 1）。将晶圆置于95℃的加热板上 &#176;C下干燥2分钟。</li>
	<li>将玻璃片清洁后，小心地放置在硅片段上方，确保硅片段上刻蚀的特征面朝上，且孔位对齐。</li>
	<li>小心翻转各段，同时确保孔位保持对齐。由于玻璃段大于硅段，使用双面胶带将两段固定，胶带的一半粘贴硅段的垂直边缘，另一半粘贴悬空的玻璃部分。然后再次翻转各段，使玻璃段位于上方，并将各段放置于加热板上的金属板表面。</li>
	<li>小心地添加第二块金属板（例如，钢）具有足够质量（即，至少5 kg）直接施加到组装好的玻璃和硅片上。 
	注意：该金属板不应与硅段或导电胶带接触。</li>
	<li>使用高压电源，将一根导线（电源）连接至组装好的玻璃和硅片段顶部的金属板，另一根导线（接地）连接至底部的金属板。</li>
	<li>将底部加热板的电压调至 1,000 V。使用万用表检测施加的电压；将一个探针压在底板上，另一个探针压在顶板上。 
	警告：高电压极其危险；切勿触碰金属板或连接线。</li>
	<li>将热板保持在 450 &#176;C 下 2 小时，以使玻璃 &#34;盖子&#34; 阳极键合至硅基底。2小时后返回，关闭加热板，关闭直流电源，并从金属板上取下器件。 
	警告：金属板在键合过程中及结束后会非常烫，请在关闭加热板后至少等待1小时，待材料充分冷却。</li>
</ol>
6. 完成声流控装置的制备
<ol>
	<li>用剃刀刮擦玻璃表面，去除阳极键合产生的污垢，并用丙酮清洁玻璃表面。</li>
	<li>准备一块厚度约为 5 mm 的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材，并切割出若干尺寸约为 10 × 10 mm2 的小方块（见表 1）。23</li>
	<li>使用 3 mm 活检打孔器在每块 PDMS 方块中心打一个孔，以便插入硅胶管。将方块直接放置在玻璃基板的孔上方，并用环氧树脂将方块粘牢。 
	注意：注意不要使用过多胶水，以免堵塞装置的孔道。</li>
	<li>小心地将锆钛酸铅（PZT）换能器粘接到装置背面的硅段上，使其位于微通道正下方的中心位置。</li>
	<li>将两根导线焊接到 PZT 换能器的两个导电区域上。注意确保导线牢固连接在 PZT 换能器上。将硅胶管穿过 PDMS 方块上的孔，并在方块和管子周围添加额外胶水，以固定其连接。</li>
</ol>
7. 操作声流控装置
<ol>
	<li>将装置牢固地安装在显微镜载物台上，使微通道正对物镜下方。 
	注意：在装置下方放置一个小垫片，以确保 PZT 换能器不与载物台接触。</li>
	<li>使用标准接头，将设备出口的硅胶管连接至固定在注射泵上的注射器。 
	注意：此配置旨在用于 &#34;撤回模式&#34;；也可使用注射泵将样品注入装置中。</li>
	<li>将通向装置入口的硅胶管放入装有流体样品的样品瓶中例如聚苯乙烯微球或细胞的悬浮液</li>
	<li>将含有流体样品的样品瓶置于搅拌器上，持续混合样品，以确保在整个实验过程中颗粒或细胞的浓度保持恒定。</li>
	<li>将PZT换能器的导线串联连接至功率放大器的输出端，并连接函数发生器。在函数发生器上设置参数（例如，峰-峰值电压和频率），并使用示波器监测放大器的输出信号。打开信号发生器和功率放大器，以开始驱动PZT换能器。6
	<ol>
		<li>为估算器件的共振频率，请使用以下公式 c = &#955; * &#402;, 其中 c 是介质的声速（即，水） &#955; 是声波波长，且 &#402; 是PZT换能器的频率。在半波长谐波的情况下（如代表性结果部分所示），微通道的宽度应为驻波波长的一半。</li>
		<li>使用 0–50 V 峰峰值电压范围内的设置。 
		注意：增加施加的电压会导致更高的压力振幅，从而加快声致迁移速度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开显微镜，确保微流控通道清晰对焦。</li>
	<li>启动注射泵以施加流动，并将样品引入装置中。在荧光模式下使用显微镜监测流经装置的微粒。</li>
	<li>通过调节供给PZT换能器的峰-峰电压以改变压力振幅，并在预期共振频率附近进行频率扫描以确定实际共振频率，从而确保装置高效地聚焦颗粒。</li>
</ol>

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<li>Au, A. K., Lee, W., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mail-order+microfluidics%3A+evaluation+of+stereolithography+for+the+production+of+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mail-order microfluidics: evaluation of stereolithography for the production of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 14 (7), 1294-1301 (2014).</li>
<li>Piyasena, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinode+acoustic+focusing+for+parallel+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multinode acoustic focusing for parallel flow cytometry.</a> Anal Chem. 84 (4), 1831-1839 (2012).</li>
<li>Lenshof, A., Evander, M., Laurell, T., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+5%3A+Building+microfluidic+acoustic+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 5: Building microfluidic acoustic resonators.</a> Lab Chip. 12 (4), 684-695 (2012).</li>
<li>Evander, M., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+PMMA+interfaces+for+rectangular+glass+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic PMMA interfaces for rectangular glass capillaries.</a> J Micromech Microeng. 24 (2), 027003(2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

声致迁移提供了一种简单且快速的方法，可在微流控微通道内精确排列微小实体，而无需使用流体动力聚焦方法中所需的鞘液。24 由于声致迁移装置能够处理不具有高磁化率、高电极化性或粒径分布狭窄的实体，因此相较于其他颗粒或细胞操控方法（例如，磁致迁移25,26、介电电泳27或惯性力操控28）具有多项优势。此外，声驻波的聚焦节点可位于激励源较远的位置，而根据恩绍定理（Earnshaw's theorem），静态磁场或电场无法实现这一点。29 另一个优势在于，声学装置可在较宽范围的施加流速下实现颗粒聚焦，且不受流动方向影响，而依赖惯性力进行聚焦的装置则无法做到这一点。28 这为颗粒或细胞的高效输送提供了手段，从而增强颗粒检测性能，适用于流式细胞术和颗粒尺寸分析等应用。30,31 装置制备与操作的简便性可直接促进类似装置在流体中悬浮物的聚焦、浓缩、分级和分选等方面的广泛应用。32
我们已证明，由声驻波产生的主要辐射力（即最强的力）1，可在单孔设计下，以超过10 ml/hr的流速将流经微流控通道的微粒聚焦。在固定流速为100 µl/min时，我们表明，本装置可在低至20 V峰峰值电压下，无需任何鞘液，将微粒聚焦成一条狭窄的流线（即，横截面约50 µm），从而实现对高浓度溶液（例如，6 × 108 个微粒/ml）进行批量微粒聚焦的低功耗方法，处理速率达每分钟1000万个微粒。此外，通过制备多孔声流控芯片或通道，并利用更高阶谐波激励以形成多组平行节点，可显著提高该通量33。
尽管本文所示装置仅需使用传统微加工中所用的材料与方法，但我们强调，尚有其他若干技术可用于构建类似装置。19,34,35 该方法的优势包括操作简便以及最终装置的耐用性。
制造这些器件的关键步骤包括：采用光刻技术定义微通道的几何结构，通过反应离子刻蚀在硅材料中形成通道，以及采用阳极键合技术将硅与透明的&#34;盖板&#34;封装，以便通过荧光显微镜进行观察。所有这些步骤均需在洁净室环境中进行，以避免器件内部积聚灰尘或碎屑。然而，一旦完成上述步骤，压电陶瓷（PZT）换能器的键合以及流体端口的连接则相对简单，可在洁净室外完成。
然而，正确处理该设备对其使用寿命至关重要。这包括：（1）用钝化试剂孵育设备例如，聚（乙烯基）硅烷）以防止通道内残留物积聚，并在每次实验后用洗涤剂冲洗装置。碎屑积聚可能影响声驻波的保真度，降低装置内颗粒或细胞高效聚焦的能力。我们还注意到，这些装置不适用于高度多分散的样品，或含有接近驻波波长一半尺寸颗粒的样品。
声流控设备在从胶体组装到细胞分离及流式细胞术等多种应用中具有巨大实用价值。以高流速精确处理生物样本的能力，可提高这些微流控设备的通量，同时减少因过量试剂、大体积样本或用于输送鞘液的笨重设备所带来的成本。制造声流控设备所需的方法简单直接，其操作流程也易于使用。我们希望这些操作步骤能够推动类似设备的广泛开发，从而促进材料科学、生物技术和医学等领域新研究方向的发展。

声流控器件可用于对微小实体（例如，颗粒或细胞）施加定向力，从而在静止液体或层流中实现其浓缩、排列、组装、限域或分离。1 在这类器件中，力可来源于体声驻波、表面声驻波（SSAWs）2 或声行波。3 尽管本文重点介绍支持体声驻波的器件的制备与操作，但近年来支持表面声驻波的器件也受到广泛关注，因其能够在表面精确操控细胞4，并在连续流动通道中快速分选细胞。5 然而，支持体声驻波的器件通过压电换能器激发器件壁面的机械振动，进而在微流控腔室内以几何定义的共振频率激发驻波，从而实现对颗粒的重新排列。与表面声驻波器件相比，该方法有望产生更高的声压幅值，因而可实现更快速的声致泳微粒输运。6
这些驻波由在空间上呈周期性分布的压力波节和波腹组成，当压力随时间振荡时，这些波节和波腹的位置保持固定。颗粒会根据其相对于流体的力学特性，向压力波节或波腹迁移，这种行为由声学对比因子描述：
<img alt="静态平衡；公式：Φ=(5ρp-2ρf)/(2ρp+ρf)-(βp/βf)；方程分析；物理学概念。" src="/files/ftp_upload/53861/53861equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1">
其中变量 ρ 和 β 分别表示密度和压缩率，下标 p 和 ƒ 分别表示悬浮物体（例如，颗粒或细胞）和流体。7 具有正声学对比因子（即，ɸ &gt; 0）的实体将迁移至声压波节处；而具有负声学对比因子（即，ɸ &lt; 0）的实体则迁移至声压波腹处。7 尽管大多数合成材料（例如，聚苯乙烯微球）和细胞在水中表现出正声学对比特性，但由硅基材料制成的弹性体颗粒8、脂肪分子9或其他高弹性组分则表现出负声学对比特性。在声流控器件中，弹性体颗粒可用于分离小分子10，以及作为限制合成颗粒11或细胞12的手段，以实现选择性分选13。
声流控器件通常由标准材料（例如，硅和玻璃）制造而成，这些材料具有足够的刚性以支撑声学驻波。在许多声流控器件（包括本文所示的器件）中，机械波被设计为在最低谐波模式下共振，该模式由跨越微通道宽度的半波长驻波构成。这种构型在通道中心形成一个压力波节，在通道边缘形成压力波腹。先前的研究已表明，这些系统可用于基于芯片的细胞计数应用14-16，以及从细胞捕获到细胞富集等多种应用17,18。
我们描述了一种支持体声驻波的声流控器件的制备过程、使用方法及典型性能表现。该器件的制备需经过一次光刻、一次刻蚀和一次熔接步骤，以将玻璃“盖板”永久键合至刻蚀后的硅基底上。需指出的是，其他支持体声驻波的声流控器件也可由玻璃或石英毛细管与压电换能器结合制得，相关内容在别处已有描述19,20。基于硅的器件具有结构坚固和流道几何形状可控的优势，从而可适用于含有颗粒和细胞悬浮液样本的多种处理方式。只要在使用后进行适当的清洗（即，用缓冲液和去污剂冲洗器件），这些器件便可重复使用。

<table><tbody><tr><td>硅片</td><td>Addison Engineering, Inc.</td><td>3P1</td><td>6&amp;rdquo;机械级硅片 &amp;lt;111&gt;</td></tr><tr><td>AZ 9260 光刻胶</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td>AZ9260-Q</td><td>正性光刻胶</td></tr><tr><td>AZ 400K 显影液</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td>AZ400K CONC-CS</td><td>将1份AZ 400K与4份去离子H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O混合稀释</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30 wt.% 水溶液（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320501</td><td>ACS级试剂，95.0–98.0%</td></tr><tr><td>1165 光刻胶去除剂</td><td>Dow Chemical, Co.</td><td>DEM-10018073</td><td>以1-甲基-2-吡咯烷酮为基础</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>W292907</td><td>&amp;ge;99.7%，FCC，FG</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>322415</td><td>无水，99.8%</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃&amp;nbsp;（Nexterion 玻璃 B）</td><td>Schott AG&amp;nbsp;</td><td>2098576</td><td>&lt;p&gt;尺寸：120 × 60 &amp;plusmn;0.1 mm；厚度：1 &amp;plusmn;0.005 mm&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>玻璃和陶瓷钻头&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr, Inc.</td><td>2954A1</td><td>钻头尺寸：1/8&amp;rdquo;；总长度：2 3/16&amp;rdquo;；柄径：7/64&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）试剂盒</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>761036</td><td>Dow Corning, Co.；Sylgard 184&amp;reg;；10 g 夹装包装</td></tr><tr><td>活检打孔器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.&amp;nbsp;</td><td>15078</td><td>Harris uni-core 尖端内径：3.0 mm&amp;nbsp;尖端外径：3.40 mm</td></tr><tr><td>锆钛酸铅（PZT）换能器</td><td>APC International, Ltd.</td><td>定制订单（841 WFB）</td><td>长度：30.0 mm，宽度：5.0 mm，频率：2.46 MHz，导线端部包裹2.0 mm</td></tr><tr><td>硅胶管&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer Instrument, Co.</td><td>07625-22</td><td>内径：0.6 mm</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Thermo Fischer Scientific, Inc.</td><td>F-8836</td><td>10 &amp;micro;m 黄绿色荧光</td></tr></tbody></table>

用于无鞘聚焦颗粒的体声驻波声流控器件的制备与操作

Fabrication and Operation of Acoustofluidic Devices Supporting Bulk Acoustic Standing Waves for Sheathless Focusing of Particles

声致迁移是指悬浮物体在声能产生的定向力作用下发生位移的现象。由于悬浮物体的尺寸必须小于入射声波的波长，且微流通道的宽度通常为数十至数百微米，因此声流控装置通常采用压电换能器产生的高频超声波（频率在兆赫兹范围内）。当频率达到由装置几何结构决定的特征频率时，可激发出驻波，从而将颗粒聚焦到主体流动中特定的流线上。本文介绍了一种利用常见材料和洁净室设备制备声致迁移装置的方法。我们展示了具有正或负声学对比因子的颗粒聚焦的代表性结果，这些颗粒分别向驻波的压力波节或波腹移动。这类装置在精确操控大量微观实体（例如，细胞）方面具有极高的实用价值，可用于静止或流动液体中的细胞分析、组装等多种应用。

我们设计的声流控装置包含一个三分支入口，以及一条宽度为 300 µm 三分叉出口（图1A-B）。我们注意到，本研究中的所有实验仅使用了一个进样口（即，通过使用可移除的堵头封闭其他入口，以利用声辐射力实现无鞘聚焦颗粒。按照上述步骤，我们构建了一个具有特定通道宽度的芯片 313 µm，由于微加工过程中存在的缺陷，误差约为 ∼4%图1C-D我们以 2.366 MHz 的驱动频率运行该装置，以激发半波长谐振驻波。
我们使用信号发生器连接功率放大器，以产生高频正弦波形来驱动PZT换能器。我们使用示波器测量功率放大器输出的峰峰值电压（Vpp），以验证信号波形和幅度的保真度。利用注射泵，我们首先以100 µl/min的流速注入绿色荧光聚苯乙烯微球悬浮液，同时不启动PZT换能器，作为阴性对照（图2A）。随后，我们以2.366 MHz频率驱动装置，在微通道宽度方向上形成半波长的驻波（Vpp = 40 V；图2B）。我们发现，具有正声学对比因子的这些微球如预期般聚焦于压力波节处。6 我们还注入了具有负声学对比因子的红色荧光微粒（即，ɸ ≈ −0.88，由先前描述的方法合成）8，以验证本装置可使其在压力波腹处富集（图2C）。
最后，我们研究了在不同流速（即，由注射泵调节的 0 至 1,000 µl/min）和电压（即，0 至 50 Vpp）条件下，具有正声学对比因子的颗粒聚焦程度。每种条件下采集包含 15 帧的视频。使用 ImageJ 软件在微通道宽度方向上采集五条荧光强度分布曲线。通过数值计算程序对每种条件下的强度分布曲线进行平均，并利用内置滤波程序对平均数据进行平滑处理。与预期一致，颗粒聚焦程度（即，由荧光峰宽度定义，对应于颗粒流的宽度）随流速增加而减小（图 3A）。我们还发现，颗粒聚焦程度随施加电压的增加而增大（图 3B）。
<img alt="芯片装置中的硅胶管和PDMS块；压电换能器；顶部/底部示意图。" src="/files/ftp_upload/53861/53861fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：支持体声驻波的声流控装置。 该装置由刻蚀的硅基底与硼硅酸盐玻璃“盖板”键合而成，PDMS块连接硅胶管，底部粘接焊有导线的压电换能器。图中展示了装置顶部（A）和底部（B）的示意图，以及装置顶部（C）和底部（D）的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53861/53861fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光激发示意图，显示PZT状态、绿色荧光、发射分析和显微镜比例尺。" src="/files/ftp_upload/53861/53861fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：具有正负声学对比因子的粒子的声聚焦。（A）在锆钛酸铅（PZT）换能器未激活前，具有正声学对比因子的粒子（10 µm，黄绿色聚苯乙烯微球）以100 µl/min流速流经微通道，占据整个通道宽度。（B）激活PZT换能器后（Vpp = 40 V，ƒ = 2.366 MHz），（A）中的粒子沿驻波的压力波节聚焦。（C）具有负声学对比因子的粒子在无流动条件下沿驻波的压力波腹聚焦（Vpp = 40 V，ƒ = 2.366 MHz）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53861/53861fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度图；微通道流速与电压关系，分析测量比较。" src="/files/ftp_upload/53861/53861fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：声流控器件的聚焦性能。 聚苯乙烯微球的荧光强度曲线（见图2A-B）分别显示了（A）在固定峰-峰值电压为40 V时，不同流速（范围为0至1,000 μl/min）下的聚焦效果，以及（B）在固定流速为100 µl/min时，不同施加电压（范围为0至50 Vpp）下的聚焦效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53861/53861fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

声流控器件利用微流控通道内的超声波来操控、富集和分离悬浮的微米及纳米级微粒。本方案描述了一种支持体声驻波的此类器件的制备与操作方法，可在无需鞘流液辅助的情况下将颗粒聚焦于中心流线。

声泳是指悬浮物体在声能产生的定向力作用下发生位移的现象。由于悬浮物体必须……

本制备方法的总体目标是创建一种多功能且稳定的声流控器件，利用体声驻波以非接触方式操控微米级胶体颗粒。我们的目标是通过展示如何使用常规设备和标准流程制备支持体声驻波的声流控工具，提供一种简便的方法，以期使这一实用技术更易于推广。声流控技术的主要优势在于，它能够简便、快速地聚焦或分离微小颗粒，这一特性在芯片上细胞计数和细胞分选领域具有广泛的应用前景。该技术能够在便捷的微型化平台上，以温和且精准的方式，根据多种流速对颗粒进行排列。在洁净室设施中，将一片洁净的六英寸单面抛光硅片放置于旋涂仪上，抛光面朝上。通过小心倾倒，将正性光刻胶直接滴加至硅片中心，直至光刻胶覆盖大部分硅片表面。然后，旋转样品以形成均匀的光刻胶层。完成后，释放卡盘上的真空，并使用晶圆镊子取出晶圆。接着，将晶圆放置在加热板上，按照光刻胶供应商规定的时长进行前烘（软烘）。在光刻胶烘烤的同时，将光掩模（如图所示）装入掩模对准仪的掩模 holder 中。然后，将硅片装入并用紫外光照射，曝光能量需按照光刻胶供应商规定的剂量进行。接着，将完成光刻图形的硅片从 holder 中取出，并放入其对应的显影液中。完成后，将晶圆从显影液中取出，用稳定的去离子水水流冲洗，并用氮气吹干。将光刻后的晶圆装入深反应离子刻蚀仪的腔室中，按照标准刻蚀程序将流体通道刻蚀至所需深度。刻蚀过程结束后，将样品从腔室中取出，放入盛有光刻胶去除剂溶液的大烧杯中。确保晶圆完全浸没在溶液中，并在65摄氏度下浸泡一小时。将晶圆从烧杯中取出，用丙酮和异丙醇交替冲洗。随后用氮气吹干晶圆。在通风良好且适用于酸类操作的通风橱中，将30%过氧化氢与硫酸按1:3的比例加入一个洁净的大烧杯中，配制Piranha溶液。将离子刻蚀后的晶圆刻蚀面朝上浸入Piranha溶液中，静置五分钟。随后取出晶圆，用去离子水充分冲洗。将晶圆再次浸入piranha溶液中额外两分钟，然后用大量去离子水再次冲洗。在另一个专用于溶剂操作且通风良好的通风橱中，先用持续流动的丙酮冲洗晶圆，再用持续流动的甲醇冲洗，最后用氮气将晶圆吹干。使用刻划工具，在晶圆上围绕微流控芯片的外围刻出直线，使其尺寸小于带预钻孔的矩形玻璃片的尺寸。沿刻蚀线小心折断晶圆。先用稳定的丙酮流冲洗硅片片段，再用稳定的甲醇流冲洗。随后将晶圆置于95摄氏度的加热板上干燥两分钟。接下来，小心地将洁净的玻璃片放置在硅胶段上，确保刻蚀面朝上，并使孔位准确对齐。然后，在保持孔位对齐的前提下，小心翻转各片段。用双面导电胶带固定两个片段，其中胶带的一半固定硅胶片段的垂直边缘，另一半固定悬空的玻璃。然后再次翻转这两个片段，使玻璃片段位于上方。将这两个片段放置在加热板上温度为450摄氏度的钢块表面。然后，小心地将第二块质量至少为五公斤的钢块直接放置在组装好的玻璃和硅片组件的顶部。该钢块不应与硅片或导电胶带接触。使用高压电源，将火线连接到玻璃和硅片组件上方的钢块上，将接地线连接到下方的钢块上。将下方加热板的电压调至1,000伏。使用万用表检测施加的电压，将一根探针接触底板，另一根探针接触顶板。两小时后返回，关闭加热板和直流电源，从金属板上取下装置。用刀片刮擦玻璃表面，去除阳极键合过程中产生的污垢，然后用丙酮清洁玻璃表面。接着，将聚二甲基硅氧烷切成若干块约10毫米×10毫米的小方块，制备厚度约为5毫米的片材。使用3毫米活检打孔器在每块方块的中心打一个孔。然后，使用环氧树脂将切片直接粘合在玻璃基底的孔洞上方。将两根导线焊接到换能器的两个导电区域。小心地将锆钛酸铅换能器粘合在装置背面微通道正下方的硅片区域中心位置。最后，将硅胶管穿过聚二甲基硅氧烷切片上的孔洞，并在切片与管子周围添加额外的胶水以固定其位置。将装置牢固地安装在显微镜载物台上，使微通道正好位于物镜下方。注意确保换能器不与载物台接触。接下来，将装置出口处的硅胶管连接至固定在注射泵上的注射器。将通向装置入口的硅胶管放入含有聚苯乙烯微球或目标细胞悬浮液的小瓶中。然后，将装有样品的小瓶置于搅拌台上，持续搅拌，以确保在整个实验过程中保持恒定的浓度。将换能器与功率放大器的输出端连接，功率放大器需与函数发生器串联。在函数发生器上设置参数，并通过示波器监测输出信号。然后，开启函数发生器和功率放大器，开始驱动换能器工作。接下来，打开显微镜并确保微流控通道清晰对焦。同时，启动注射泵以将样品引入装置。在整个实验过程中，使用荧光显微镜监测流经装置的实体。此处使用注射泵以每分钟100 µL的流速将绿色荧光聚苯乙烯微球悬浮液注入微流控腔室。当锆钛酸铅换能器被激活并调节至2.366 MHz频率时，在该微通道（宽度为313 µm）的横向上形成半个波长的驻波，从而将微球流聚焦于压力波节处。当注入具有负声学对比因子的红色荧光硅酮颗粒时，这些颗粒会在压力波腹处富集。该系统对颗粒的聚焦能力取决于流速和施加的电压。随着流速增加，颗粒在微通道内的分布会变得更加分散。同时，提高施加的电压可增强颗粒聚焦的程度。该装置一旦运行，即可用于操控颗粒和细胞，适用于多种需要精细空间或时间控制的基于微流控的生物分析和实验。需要注意的是，在操作过程中务必保持耐心并仔细对待每一步骤，因为任何步骤中的仓促都可能在最终装置中引入缺陷。只要在每次使用后使用适当的清洁剂和洗涤缓冲液对装置进行正确清洗，该装置便可多次重复使用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备由硅和玻璃构成、用于支持体声驻波的声流控装置。请务必注意，实验过程中涉及强腐蚀性化学试剂（如Piranha混合液），若操作不当，可能造成严重危害。在处理这些液体时，请务必小心谨慎，以确保所有制备工作的化学操作安全。

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