Name: 分离和斑马鱼胚胎单细胞的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解如何从斑马鱼胚胎中分离单细胞，并使用微流控系统进行基因表达分析。该方法揭示传统群体分析中隐藏的细胞异质性，为发育生物学研究提供无偏见的单细胞转录组数据。

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我们感谢 C. Geoffrey Burns 博士提供的鱼类品系。作者感谢北卡罗来纳大学（UNC）流式细胞术核心设施、UNC-CGIBD AAC 核心为本项目提供的资源支持，以及 ZAC 设施在动物护理方面的帮助。L.S. 由美国国立卫生研究院（NIH）T32 基金 HL069768-13（项目负责人：Nobuyo Maeda）资助。N.F. 由美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金 NSF-DGE-1144081 资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）P30DK034987 基金（资助对象：UNC 高级分析核心）、美国心脏协会科学家发展基金 13SDG17060010、艾略特医学基金会新学者基金 AG-NS-1064-13（授予 Qian 博士）以及美国国立卫生研究院（NIH）R00 HL109079 基金（授予 Liu 博士）资助。

本方案需要使用活体成年斑马鱼以产生胚胎。收集胚胎用于组织取材。开展本实验前，必须获得相关伦理审查委员会的批准。
1. 获取特定发育阶段的胚胎
<ol>
	<li>实验前一天，准备健康的成年斑马鱼用于繁殖。将一条雄鱼和一条雌鱼分别放置于繁殖缸中透明隔板的两侧。</li>
	<li>根据下游应用所需的足够胚胎数量，对必要数量的繁殖缸重复步骤1.1。从野生型鱼和在目标细胞类型中表达荧光蛋白的转基因鱼中获取胚胎。 &#160; 
	注意：步骤 2-8 中下游应用所需的胚胎数量取决于目标时间点目标细胞的相对丰度。尽管该数量可能因细胞类型而异，但当目标细胞占比为 &#60;受精后24小时（hpf）时占总细胞的1.0%。</li>
	<li>次日早晨，将鱼转移到新的繁殖缸中以更换育苗缸内的水，并移除隔板。倾斜繁殖缸以促进鱼类交配。</li>
	<li>收集处于特定发育阶段的胚胎。
	<ol>
		<li>每15分钟收集一次胚胎，方法是将成鱼转移至新的繁殖缸中，然后将留下的卵通过茶漏过滤收集。 
		注意：当斑马鱼胚胎在相似密度和温度条件下培养时，其发育是同步的。</li>
		<li>用卵水（1 L 双蒸水中含 0.21 g/L Instant Ocean 盐）冲洗卵，并转移至培养皿中。将培养皿置于 28.5 ℃ 的湿润培养箱中 &#176;C，带空气循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次收集后 2 小时，将受精的多细胞胚胎分选至 10 cm 培养皿中，并将密度调整为每皿 50 个胚胎。为后续实验应用，选择在单一 15 分钟收集时间窗口内获得的胚胎。将胚胎在 28.5 °C 下孵育&#176;C. &#160; 
	注意：例如，在上午8:30、8:45、9:00、9:15、9:30、9:45、10:00和10:15收集胚胎。比较各时间点的数据，若9:00收集的产卵批次中受精胚胎数量最多，则仅使用该批次胚胎进行后续实验。</li>
</ol>
2. 单细胞分离的准备工作
<ol>
	<li>在目标时间点（18 hpf）前约30分钟，使用精细镊子手动去除胚胎的卵膜。</li>
	<li>为每种实验条件准备并标记以下物品：两个2 ml 微量离心管、一个40 µm 细胞筛、一个35 mm 细胞培养皿，以及两个顶部装有35 µm 细胞筛的FACS管。</li>
	<li>将以下试剂置于冰上预冷：含0.21g/L Instant Ocean盐的卵水（溶于1L双蒸水中）；去卵黄缓冲液（含55 mM NaCl、1.8 mM KCl和1.25 mM NaHCO3）；FACS缓冲液（Leibovitz's L-15培养基，添加5%热灭活胎牛血清）。</li>
	<li>将每份样品1 ml的细胞解离试剂1恢复至室温。将每份样品1 ml的细胞解离试剂2在冰上解冻，并在使用前立即恢复至室温。</li>
</ol>
3. 单细胞解离
<ol>
	<li>使用宽口玻璃移液管，将100–300枚胚胎转移至2 ml微量离心管中，尽量减少卵水体积。</li>
	<li>用1 ml冰冻的Egg Water替换水，将管子浸入冰中20分钟以处死胚胎。 
	警告！ 必须获得相关机构动物护理监督委员会对该安乐死方法（冰上冷藏后进行细胞解离作为二次安乐死）的批准。标准的安乐死通常要求胚胎 &#60;受精后3天的胚胎在冷藏后进行漂白，这种方法不适合获取有活力的细胞。</li>
	<li>用1 ml冰冻的Egg Water将胚胎清洗两次。清洗时，使用宽口玻璃移液管去除Egg Water，并用P1000移液器加入Egg Water。</li>
	<li>用1 ml 去卵黄缓冲液替换胚胎中的水，然后用P1000吸头吹打8–12次，或直至卵黄溶解，仅可见胚胎体。</li>
	<li>以 300 × g 离心 1 分钟收集组织。用移液器轻轻吸除上清液，避免扰动组织沉淀。用 1 ml Egg Water 重悬。</li>
	<li>重复步骤 3.5，共进行三次洗涤，但在最后一次洗涤时，用 1 ml 室温细胞解离试剂 1 重悬细胞。</li>
	<li>在细胞解离试剂1中于室温下孵育10分钟，将离心管水平放置。每2-3分钟用P1000移液器轻轻吹打，以防止结团。 
	注意：在吹打步骤中需轻柔处理样品。有时胚胎组织会缠绕形成一个较大的团块，附着于管壁。通过温和吹打辅助进一步消化，可使该团块分散。切勿涡旋振荡。</li>
	<li>300 × g 离心 3 分钟收集组织。弃上清，加入 1 ml 细胞解离试剂 2 重悬。</li>
	<li>在室温下孵育5-15分钟。将试管水平放置。每2-3分钟轻轻吹打以防止结块。每5分钟评估一次消化进程。
	<ol>
		<li>为评估消化进程，稀释2 &#181;l 上清液转移至 18 &#181;l FACS 缓冲液，并以液滴形式移取至细胞培养皿中。</li>
		<li>将盖玻片盖在样品上，在组织培养显微镜下以10倍和20倍放大倍数进行观察。 
		注意：制备物中应包含单细胞、小细胞簇、大细胞簇以及偶尔出现的大部分完整的胚胎体。</li>
		<li>目视评估单细胞和小细胞团在样品中的比例。 &#160; 
		注意：消化过度会降低细胞活性；消化不足会减少单细胞得率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞悬液。弃去上清液，加入 1 ml 冷的 FACS 缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>润湿一个40 &#181;m 细胞滤网，使用 FACS 缓冲液。将细胞悬液通过 40 &#181;将细胞筛置于35 mm细胞培养皿上，用1 ml FACS分选缓冲液冲洗细胞筛一次。</li>
	<li>将流穿液转移至一个 2 ml 微量离心管中。在 300 x g 离心 5 分钟以收集细胞，并重悬于 100 &#181;l FACS 缓冲液。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞产量。将样品进一步稀释至5×106 每毫升细胞数，或根据所选流式细胞仪推荐的最佳浓度。可选步骤：使用血细胞计数板计数细胞得率时，可用台盼蓝对死细胞进行复染，以在流式细胞分选前确认细胞悬液的活性。 &#160; 
	注意：样本浓度过低会导致分选耗时过长；样本浓度过高则容易形成多聚体，不利于纯细胞群体的分选。</li>
	<li>保留每个样本的10–20%作为未染色对照。对于其余样本，通过向每个样本中加入荧光性活/死（L/D）鉴别染料来标记死细胞。切勿洗涤。 &#160; 
	注意：任何能够穿透细胞膜受损细胞并染色核酸的荧光染料均可作为活/死（L/D）染料使用，前提是其荧光光谱与所选的流式细胞分选仪（FACS）及用于标记目标细胞的荧光染料相兼容。
	<ol>
		<li>加入染料后不要洗涤样品，因为部分细胞在转运至流式细胞分选纯化过程中会死亡，这些死细胞应从分选后的细胞群体中排除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>润湿35 &#181;m 细胞滤网封口的 FACS 管，内含 20 &#181;l FACS 缓冲液。将细胞加入滤器中，依靠重力收集。置于冰上保存。</li>
</ol>
4. FACS 富集
<ol>
	<li>使用流式细胞分选（FACS）富集表达荧光标记的单个活细胞。
	<ol>
		<li>在前向散射光（FSC-A）幅度与侧向散射光（SSC-A）幅度的散点图上（两者均采用线性刻度），设置门控以区分细胞与碎片。 
		注意！ 斑马鱼细胞通常比小鼠或人类细胞更小，这反映在细胞与碎片之间的基础分离度较低。</li>
		<li>基于步骤4.1.1设置的门控，利用前向散射光高度（FSC-H）与侧向散射光高度（SSC-H）的散点图（两者均采用线性刻度），设置门控以富集单细胞并排除多聚体。 
		注：FSC-H显著偏高而SSC-H偏低的细胞很可能是多聚体，应在分选中排除。</li>
		<li>基于步骤4.1.2设置的门控，使用单色对照，通过FSA-A（线性刻度）与用于检测L/D染料通道幅度（对数刻度）的散点图设置门控，仅纳入L/D阴性细胞。</li>
		<li>基于步骤4.1.3设置的门控，使用单色对照，通过FSA-A（线性刻度）与用于检测荧光蛋白细胞标记物通道幅度（对数刻度）的散点图设置门控，仅纳入荧光阳性活细胞。</li>
		<li>如有必要，设置补偿对照，以消除L/D染料与荧光蛋白光谱之间的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分选逻辑设定为仅收集符合步骤4.1中所有门控条件的细胞。
	<ol>
		<li>使用双标记细胞验证细胞分选的门控策略。&#160; 
		注：用于分选的细胞应为细胞而非碎片、单细胞而非多聚体、L/D阴性且荧光阳性的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将目标细胞群中的2,000–4,000个细胞分选至预冷的微量离心管中，管内含5 µl冰上保存的FACS缓冲液。为尽量减少分选过程中对细胞的剪切力和机械损伤，应使用细胞分选仪可允许的最低压力。&#160; 
	注：5 µl的FACS缓冲液液滴可作为细胞从FACS仪器流出时的缓冲层。将2,000–4,000个细胞直接收集至FACS缓冲液中，可避免在加载至IFC芯片前进行离心步骤。推荐该策略，因为离心可能导致细胞在沉淀中相互黏附，从而形成多聚体。</li>
	<li>评估分选后细胞的存活率。
	<ol>
		<li>取1 µl分选后的细胞转移至含有100 µl FACS分选缓冲液和1:1,000稀释L/D染料的新鲜FACS管中。将细胞通过FACS分选仪，采用步骤4.1的门控策略进行分析。根据L/D阴性与阳性细胞的比例估算分选细胞的存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将细胞加载到微流控芯片上
<ol>
	<li>使用血细胞计数板测量分选后细胞的浓度和大小。
	<ol>
		<li>将分选后的细胞稀释至至少 10 µl。取 5 µl 细胞悬液与 5 µl 台盼蓝混合稀释。将混合液加载到血细胞计数板上，并盖上盖玻片。</li>
		<li>采集血细胞计数板上 4 × 4 网格中所有细胞的明场图像。计数活细胞数量，并计算每毫升中的活细胞数。活细胞不会摄取台盼蓝。&#160; 
		注意：使用任何标准图像分析软件测量所有活细胞的直径。计算细胞大小的平均值和标准差，并选择适用于目标细胞大小范围的 IFC 芯片板。如果细胞大小范围跨越 IFC 芯片板的适用范围，可使用多个芯片板以捕获目标细胞的完整大小范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明将细胞加载至 IFC 芯片板（参见材料部分）。
	<ol>
		<li>将细胞稀释至 1×106 个细胞/ml，并按照制造商说明进行浮力优化。&#160; 
		注意：浮力优化可确保细胞在加载过程中既不沉到底部也不浮到加样孔顶部，从而实现最佳加载效果。缓冲液与细胞的比例可能因细胞类型而异，但通常细胞与缓冲液的比例为 6:4 至 7:3。</li>
		<li>将细胞加入已预处理的 IFC 芯片板中。将芯片板装入兼容的流体系统仪器，并运行细胞加载程序，使细胞通过微流控回路进入捕获通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认细胞已成功固定在 IFC 芯片板的捕获位点。
	<ol>
		<li>从流体系统仪器中取出 IFC 芯片板。将芯片板安装在配备板适配器的显微镜上。</li>
		<li>在 10 倍放大倍数下，对每个捕获位点采集明场和荧光图像快照。&#160; 
		注意：明场图像的曝光时间可能在 10–50 ms 之间，具体取决于光源强度；荧光图像的曝光时间可能在 250–750 ms 之间，具体取决于荧光染料的亮度。应避免过度曝光，以防止光损伤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. cDNA 合成
<ol>
	<li>进行细胞裂解 原位 根据IFC芯片制造商的说明。
	<ol>
		<li>向IFC板的孔中加入裂解缓冲液。将板加载到匹配的流体系统仪器上，并按照制造商说明运行细胞裂解程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据IFC板制造商的说明进行逆转录。
	<ol>
		<li>向IFC板中加入逆转录试剂。将板加载到兼容的流体系统仪器上。运行逆转录程序。样品循环条件：25℃下1个循环&#176;C，10 分钟，42 循环 1 次&#176;C孵育1小时，然后在85℃进行1个循环&#176;C，5 分钟</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据IFC板制造商的说明，使用基因特异性探针进行预扩增。 
	注意：由于低拷贝数下具有更高的特异性，应使用荧光标记探针，而非适用于嵌入染料的探针。
	<ol>
		<li>将引物混合并稀释至终浓度各为 180 nM。将混合后的引物加入 IFC 板中。将板放入兼容的流体系统仪器。运行预扩增程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下循环条件进行预扩增：95℃ 1个循环&#176;C 下 10 分钟，随后进行 18 个循环，每个循环包括 95&#176;C，15 秒，然后在 60 °C 下退火和延伸&#176;C 反应 4 分钟。将预扩增的 cDNA 储存于 4&#176;C，直至收集。根据制造商说明书从微流控板中收集 cDNA，并于 -20 ℃ 保存&#730;C，直至使用。</li>
</ol>
7. 从单细胞中选择 cDNA 进行单靶标 qRT-PCR
<ol>
	<li>根据制造商说明书，用25 µl稀释试剂稀释cDNA。&#160; 
	注意：每细胞预扩增cDNA的预计最终产量约为28 µl。保留一部分稀释剂，用于qRT-PCR中的无模板对照。
	<ol>
		<li>参考步骤5.3.2中记录的明场和荧光图像，对每个捕获位点进行评分。手动计数并记录细胞数量。评估并记录每个细胞是否具有荧光。&#160; 
		注意：每个单独位点可能包含0个、1个或&gt;1个细胞，其中&gt;1个细胞包括含有多个细胞和/或无法识别的碎片的捕获位点。如果图像质量足够高，也可分配像素值以量化荧光信号的强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择用于qRT-PCR分析的样品。
	<ol>
		<li>从步骤7.2中确定的捕获位点中选择含有恰好1个荧光阳性细胞的cDNA样品。将每个样品的1 µl等分试样混合。 
		注意：此为“混合”阳性对照，用于确定目的基因是否在所选细胞中的任意一个中表达。</li>
		<li>选择至少一个含有恰好0个细胞的捕获位点的cDNA作为阴性对照。使用步骤7.1.2中的稀释剂作为无模板对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行qRT-PCR检测。
	<ol>
		<li>仅使用步骤6.4.1中用于预扩增的探针。所有样品均设三个重复。在384孔板上进行10 µl反应体系的扩增循环条件如下：50°C 2分钟1个循环，95°C 10分钟1个循环，随后进行40个循环（95°C变性15秒，60°C退火和延伸1分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>通过标准凝胶电泳验证qRT-PCR产物。确认产物为预期分子量的单一条带（因探针不同而异）。&#160; 
	注意：若探针产生多条条带或单一条带但大小不符，则特异性存疑，该基因应排除在分析之外。</li>
	<li>检查所有扩增曲线，并记录任何异常情况14。计算每个样本/基因组合的平均CT值15。&#160; 
	注意：阳性对照的CT值通常在10–30之间。阴性对照的CT值通常在35–40之间（无扩增）。CT值在30–35之间的表达水平极低，解释时应谨慎14。</li>
	<li>报告数据
	<ol>
		<li>若样本的CT值落在10–30范围内，数据也可表示为相对于对照样本的转录本丰度的倍数变化。 
		注意：倍数变化等于2^(-ΔΔCT)，其中ΔCT是相对于看家基因的值，通过从目标基因的平均CT值中减去看家基因的平均CT值得到；ΔΔCT是样本与阳性对照之间ΔCT的差值15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法利用在细胞类型特异性启动子控制下的荧光蛋白表达，从斑马鱼胚胎中富集一群心脏前体细胞，用于微流控辅助的单细胞捕获系统，以检测单个细胞中部分心脏基因的表达情况。只要FACS激光激发和发射波长与所选荧光染料兼容，该方法可适用于任何荧光报告基因品系。目前已存在多种斑马鱼报告基因品系，且携带新型报告基因的转基因鱼可在短短3个月内构建完成。此外，该实验流程还可进行调整，用于从全转录组生成单细胞cDNA，以进行单细胞RNA测序。为此，需对步骤5-7进行轻微修改，以适配专为RNA测序文库构建而优化的cDNA制备化学体系。然而，在开展高通量测序应用之前，建议先使用本文所述方法验证细胞群体的异质性。
需要注意的是，所述方法存在一些局限性。首先，集成微流控回路（IFC）板的使用需要专用且昂贵的设备。然而，与传统的96孔和384孔板格式相比，微流控芯片在单细胞检测方面具有显著优势。通过在微米级通道中流动细胞和试剂，可将单个细胞定位至独立的捕获位点，并可直接观察以确认其为健康状态的单细胞。随后进行RNA提取与cDNA合成 原位 在IFC芯片上使用极低细胞量进行单个细胞操作。截至...

目前大多数细胞与分子生物学研究均基于群体平均值。然而，这些传统的基于群体的分析可能会掩盖重要的生物学事件，因为少数细胞群体在生物过程和疾病结局中可能发挥关键作用。在单细胞水平上理解异质性群体中的基因表达，能够（且已经）带来相关的生物学和临床见解1,2。在胚胎发育研究中值得关注的是，在较大的细胞群体中，前体细胞往往所占比例较低，这使得检测最终启动细胞命运决定的基因表达细微变化变得困难3。同样，同一种细胞类型在不同微环境刺激下可能表现出不同的表达谱4。例如，尽管具有共同的形态学和功能特征，同一器官或不同器官（例如，主动脉或肾脏）中的定居内皮细胞仍表现出显著的异质性5。此外，同一肿瘤中的癌细胞在单细胞水平上也可能具有不同的分子表达谱或突变6。
在模式系统中，单细胞转录组学已成功鉴定出新的细胞群体，表征了细胞分化过程中出现的中间状态，并揭示了细胞对刺激的不同响应7,8,9。这些发现若采用传统的基于细胞群体的研究方法则会被掩盖。斑马鱼胚胎是研究发育过程中单细胞异质性及细胞身份分子调控机制时被严重低估的干细胞、前体细胞和分化中细胞的来源。其高度保守的体外（ex vivo）发育过程以及易于进行遗传操作的特点，使其成为该研究策略的理想模型系统10,11。具体而言，解读单细胞基因表达数据的一个主要限制在于，要可靠地鉴定发育过程中新的中间细胞状态，必须极为精确地控制组织采集的时间点9。这是为了确保所捕获细胞之间的异质性反映的是同一时间点组织内部的真实异质性，而非由年龄依赖性细胞分化所导致的基因表达差异。与小鼠相比，斑马鱼胚胎的发育可在大量个体间实现精确同步12。此外，由于产卵量大，斑马鱼胚胎可作为丰富的干细胞和前体细胞来源。
本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离细胞，并利用 commercially available 的集成微流控回路（IFC）芯片和自动制备系统捕获单个细胞，以进行 qRT-PCR 基因表达分析的方法。该方案可快速拓展至任何高通量多重检测，包括全转录组测序，从而实现对细胞异质性更全面的分析13。与传统基因表达检测方法相比，本方案具有多项优势。单细胞分离方案在 FACS 分选后可获得较高的细胞活力，从而减少下游应用中受损细胞所占的比例。通过使用 IFC 芯片，可直接观察被捕获的细胞，以评估捕获效率并从形态学角度判断细胞健康状况。此外，本方案广泛适用于斑马鱼研究领域，仅需一条带有标记的转基因鱼系以及微流控细胞捕获技术的使用权限即可实施。
作为原理验证，从心脏前体细胞中分离并捕获单个细胞于IFC芯片上，随后通过qRT-PCR检测心脏分化标志物的相对丰度。单细胞水平的基因表达分析表明，心脏前体细胞与其正在分化的子代细胞共存。对心脏前体细胞进行单细胞谱型分析所获得的见解，可能揭示在脊椎动物发育过程中心脏前体细胞间基因表达模式的异质性，而这种异质性可能在传统的基于细胞群体的分析中被掩盖。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>用于去除胚胎的卵膜</td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 µm 细胞筛</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>顶部带 35 µm 细胞筛的 FACS 管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器及吸头</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器及吸头</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC 芯片制造商的操作规程</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>代表性实验中使用版本 100-6117 E1</td></tr><tr><td>宽口巴斯德玻璃移液管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>用于转移胚胎</td></tr><tr><td>成年野生型斑马鱼</td><td>N/A</td><td></td><td>我们使用了 AB 品系</td></tr><tr><td>成年转基因斑马鱼</td><td>N/A</td><td></td><td>我们使用了 Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞解离试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液</td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>用水配制储备液，用于去卵黄缓冲液</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>热灭活；任何品牌的 FBS 均可使用</td></tr><tr><td>细胞解离试剂 1 - TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>细胞解离试剂 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>-20°C 保存；冰上解冻；使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>蛋白酶（可选）</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>死活染料 - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>任何适用于流式细胞术的活/死染料均可使用</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于 IFC 板和 qRT-PCR 的试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基因特异性探针</td><td></td><td></td><td>探针根据实验而异</td></tr><tr><td>TaqMan 探针 ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 探针 gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 探针 nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 探针 myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 探针 vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 探针 isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>IFC 制造商操作规程中列出的试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>用于将细胞加载到 IFC 板上</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CT&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>用于逆转录和预扩增步骤的试剂</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC 预扩增板（5-10 µm）</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>适用于小细胞的 IFC 板</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep 仪器</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>用于 IFC 板操作</td></tr><tr><td>血细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>用于细胞计数和评估细胞大小</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>用于从卵膜中取出胚胎</td></tr><tr><td>组织培养显微镜</td><td></td><td></td><td>用于评估单细胞消化情况</td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td></td><td></td><td>用于分离目标细胞</td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

斑马鱼（Danio rerio）是研究脊椎动物发育的有力模式生物。尽管斑马鱼胚胎发育的许多方面已在形态学层面得到描述，但对生物体发育过程中发生的细胞变化的分子基础仍知之甚少。随着微流控和多重检测技术的最新进展，现在可以对单个细胞中的基因表达进行表征。这使得研究人员能够探究特定细胞群体中单个细胞之间的异质性，以鉴定和分类细胞亚型，表征细胞分化过程中出现的中间状态，并探索细胞对刺激的不同反应。本研究描述了一种从斑马鱼胚胎中分离出有活力的单细胞的实验方案，用于高通量多重检测分析。该方法可快速应用于任何带有荧光标记的斑马鱼胚胎细胞类型。该方法的扩展版本还可与高通量测序技术结合使用，以全面表征单细胞的转录组。作为原理验证，本研究检测了来自 nkx2.5 阳性心脏前体细胞的分离单细胞中心脏分化标志物的相对丰度。通过对单细胞水平及单一时间点的基因表达进行分析，研究结果支持一种模型，即心脏前体细胞与其正在分化的子代细胞共存。本文所述的方法和工作流程可广泛适用于斑马鱼研究领域，仅需一种带有标记的转基因鱼系以及微流控技术的使用权限。

作为概念验证，通过检测基因表达来探究心脏发育过程中的分化动态。在斑马鱼中，心脏前体细胞起源于中胚层细胞群体，这些细胞迁移至前外侧板中胚层并融合形成线性心脏管。在融合之前，心脏前体细胞开始表达转录因子 nkx2.5 （NK2同源框5），被认为是心脏前体细胞最早的特异性标志物16,17此处，一种先前已描述的BAC转基因鱼 Tg(nkx2.5:ZsYellow)18, 简写 nkx2.5:ZsY 用于在受精后18小时（hpf）、18体节阶段对单细胞中的心脏分化标志物进行检测12这是首次可肉眼观察到ZsYellow信号的时间点。如先前对该转基因品系所述，ZsYellow标记心脏前体细胞，以及少数心外细胞，这些心外细胞在28 hpf时发育为咽弓内皮细胞。19 (图1A-B，数据未显示）。在18 hpf时， nkx2.5:ZsY 胚胎被解离为单细胞悬液，随后用Sytox Bl...

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。

斑马鱼（Danio rerio）是研究脊椎动物发育的有力模式生物。尽管斑马鱼胚胎发育的许多方面已有研究……

本实验的总体目标是从早期斑马鱼胚胎中分离单个细胞，并利用基于微流控的单细胞多重分析系统捕获这些细胞，以评估单个细胞的基因表达情况。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如细胞在命运决定和分化过程中经历了哪些转录变化。该技术的主要优势在于，它是一种无偏倚的方法，能够揭示传统基于群体的分析技术中被掩盖的细胞异质性。通常，初次接触该技术的研究人员会面临困难，因为制备可存活的单细胞样本在技术上具有挑战性，但对后续分析至关重要。一旦掌握该技术，若操作步骤正确，可在六小时内完成将整个胚胎样本处理成单个裂解细胞并加载至集成化微流控芯片的过程。在进行该操作时，需特别注意确保仅有单个细胞被微流控装置捕获。在繁殖野生型和转基因斑马鱼成鱼后，根据机构批准的标准操作程序，每隔15分钟收集一次胚胎。至少两小时后，将同一时间点的100至300个受精胚胎转移至含有新鲜卵水的新培养皿中。然后使用精细镊子手动去除每个胚胎的绒毛膜。接下来，使用宽口玻璃移液管将胚胎转移至含有最少体积卵水的2毫升微量离心管中。当所有胚胎均转移完毕后，弃去原有液体，加入1毫升冰冻卵水，并将离心管浸入冰中静置20分钟。安乐死后，使用宽口玻璃移液管吸除上清液。使用 P-1000 移液器向胚胎中加入新鲜的卵水，洗涤两次。第二次洗涤后，将卵水替换为 1 毫升去卵黄缓冲液，用 P-1000 移液器吹打胚胎 8 到 12 次，直至卵黄溶解，仅可见胚胎体。通过离心收集组织。然后，使用移液器轻轻吸除上清液，注意不要扰动组织沉淀，将细胞重悬于 1 毫升新鲜的卵水溶液中。再将胚胎洗涤两次后，将沉淀重悬于 1 毫升室温的细胞解离试剂-1 中。随后将离心管平放，于室温孵育 10 分钟。每2至3分钟轻柔吹打一次，以防止结块。孵育结束后，再次离心细胞，并将沉淀重悬于1毫升细胞解离试剂-2中。将细胞在室温下水平孵育5至15分钟，每2至3分钟轻柔吹打一次。每五分钟，取 2 微升上清液与 18 微升 FACS 缓冲液稀释，将细胞以液滴形式接种至细胞培养皿中。在样本上覆盖盖玻片，使用组织培养显微镜在 10 倍和 20 倍放大倍数下评估消化进程。当观察到细胞悬液主要为单细胞，伴有少量小细胞团簇和大细胞团簇，以及少数基本完整的胚胎样结构时，离心收集细胞，并将沉淀重悬于 1 毫升预冷的 FACS 缓冲液中。接下来，用FACS缓冲液润湿40微米细胞筛。将细胞通过筛网过滤至35毫米细胞培养皿中。再次离心细胞后，用100微升FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并通过台盼蓝染色排除法计数活细胞数量。接下来，将样品稀释至每毫升5 × 10⁶个细胞。保留10%至20%的细胞作为未染色对照。用荧光活/死细胞鉴别染料对剩余细胞进行染色。然后用20微升FACS缓冲液润湿带有盖子的35微米细胞筛网FACS管，将细胞加入筛网中，依靠重力收集细胞。根据所示的设门策略，分选表达荧光标记的单个活细胞，并使用双标记细胞验证设门准确性。将目标细胞群体中的 2,000 至 4,000 个细胞分选到预冷的微量离心管中，管内含 5 微升冰上放置的 FACS 缓冲液。随后，取 1 微升分选后的细胞转移至新的 FACS 管中，加入 100 微升 FACS 分选缓冲液以及 1:1,000 稀释的活/死细胞染料。然后使用分选门控程序运行细胞样品，以评估分选后的细胞活力。接下来，将用9微升FACS缓冲液稀释后的1微升细胞悬液加入血细胞计数板，以测定细胞浓度和平均直径。然后根据样品的平均细胞直径选择合适尺寸的集成微流控芯片（IFC芯片），并按照制造商的说明对微流控系统进行预处理。按照制造商的说明将细胞加载到芯片上，并将芯片放入兼容的微流控仪器中。然后运行适用于IFC芯片的细胞加载程序，将细胞推入捕获通道。为确认细胞已固定在捕获位点，将芯片置于配备板适配器的显微镜下，以10倍放大倍数获取每个捕获位点的明场和荧光图像。随后可对细胞进行下游目标基因表达的定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）分析。在18体节期，可使用荧光显微镜验证胚胎的ZsYellow表达。分选后，可获得一系列不同直径的细胞。可使用IFC芯片捕获特定直径的细胞。例如，在本实验中，细胞直径为5至10微米。如预期所示，从受精后18小时胚胎中分选并捕获的细胞表达了ZsYellow荧光标记。此处采用定量反转录PCR（QRT-PCR）来评估在IFC板的细胞捕获位点上获得的40个单细胞中特定目标基因的相对表达水平。由于看家基因的循环阈值范围过宽，无法用于样本间基因表达的比较，且许多循环阈值超过30，因此将这些值以热图形式可视化。在不同样本间进行比较时，本实验观察到基因表达存在显著异质性，并根据基因表达模式将细胞分为1至5型。一旦掌握该技术，若操作得当，可在六小时内将整个胚胎样品在集成式微流控芯片上处理成单个裂解细胞。在进行此操作时，需注意仅有单个细胞会被捕获在微流控芯片上。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如高通量单细胞测序）对单个细胞的转录组进行完整表征。该技术问世后，为发育生物学领域的研究人员探索早期胚胎发育过程中的细胞异质性奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从斑马鱼胚胎中分离单个细胞，如何利用基于微流控的单细胞多重系统捕获单个细胞，以及如何分析单个细胞的基因表达情况。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

分离和斑马鱼胚胎单细胞的表征

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从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞及其RNA提取

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。...

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本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本方案描述了从成年、幼年、幼虫期及胚胎期斑马鱼（Danio...

用于电生理研究的成年、幼年、幼虫及胚胎斑马鱼心脏和血管平滑肌细胞的分离

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斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

了解如何从斑马鱼胚胎中分离单细胞，并使用微流控系统进行基因表达分析。该方法揭示传统群体分析中隐藏的细胞异质性，为发育生物学研究提供无偏见的单细胞转录组数据。

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

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