Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos
2016年3月12日
该方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单细胞、富集目标细胞、在基于微流体的单细胞多路系统中捕获斑马鱼细胞以及评估单细胞基因表达的方法。
本实验的总体目标是从早期斑马鱼胚胎中分离单细胞，以便在基于微流体的单细胞多路复用系统中捕获它们，以评估单个细胞的基因表达。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如细胞在分化和分化过程中经历哪些转录变化。这种技术的主要优点是它是一种无偏见的方法，可以揭示传统基于群体的技术中掩盖的异质性。
通常，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为生成单细胞的活菌制剂在技术上具有挑战性，但对于下游分析至关重要。一旦掌握，如果步骤执行得当，可以在六个小时内在集成的微流控芯片上将整个胚胎样本处理成单个裂解细胞。在尝试此过程时，请务必记住确保在微流体设备上仅捕获单个细胞。
在培育成年野生型和转基因斑马鱼后，根据设施和机构批准的标准作程序，每隔 15 分钟收集一次胚胎。至少两个小时后，将 100 到 300 个受精胚胎从一个时间点转移到装有新鲜鸡蛋水的新培养皿中。并使用细镊子手动从每个胚胎中取出绒毛膜。
接下来，使用大口径玻璃移液器将胚胎转移到 2 毫升微量离心管中，其中含有最小体积的鸡蛋水。移植完所有胚胎后，用 1 毫升冰冷的鸡蛋水代替水，然后将试管浸入冰中 20 分钟。安乐死后，使用大口径玻璃移液器去除上清液。
和 P-1000 移液器向胚胎中加入新鲜鸡蛋水两次。第二次洗涤后，用 1 毫升去离子缓冲液代替蛋水，并使用 P-1000 移液器研磨胚胎 8 到 12 次，直到蛋黄溶解，只看到胚胎的身体。通过离心收集组织。
然后，使用移液管轻轻去除上清液，不要干扰组织沉淀，并将细胞重新悬浮在 1 毫升新鲜鸡蛋水中。再洗涤胚胎两次后，将沉淀重悬于 1 毫升室温细胞解离试剂-1 中。然后将试管侧放，在室温下孵育 10 分钟。
每 2 到 3 分钟轻轻研磨一次，以防止结块。在孵育结束时，再次旋转细胞并将沉淀重悬于 1 毫升细胞解离试剂-2 中。在室温下将细胞水平孵育 5 至 15 分钟，每 2 至 3 分钟轻轻研磨一次。
每 5 分钟在 18 μL FACS 缓冲液中稀释 2 μL 上清液，然后将细胞以液滴形式分配到细胞培养皿中。将盖玻片盖在样品上，并使用组织培养显微镜以 10 倍和 20 倍放大倍数评估消化进程。当制剂似乎主要是单细胞与一些小细胞和大细胞簇以及一些基本完整的胚胎体的混合物时，将细胞旋转并将沉淀重新悬浮在 1 毫升冷 FACS 缓冲液中。
接下来，用 FACS 缓冲液润湿 40 微米的细胞过滤器。并通过过滤器将细胞过滤到 35 毫米的细胞培养皿中。再次旋转细胞后，将沉淀重悬于 100 微升 FACS 缓冲液中，并通过台盼蓝排除计数活细胞的数量。
接下来，将样品稀释至每毫升 10 至 6 个细胞的 5 倍。并保留 10% 至 20% 的细胞用于未染色的对照。用荧光活/死鉴别染料对其余细胞进行染色。
然后用 20 微升 FACS 缓冲液润湿 35 微米细胞过滤器盖的 FACS 管，并将细胞添加到过滤器中，通过重力收集它们。使用图示的设门策略，对表达荧光标记物的单个活细胞进行分类。用双标签单元验证门控。
将 2， 000 至 4， 000 个细胞从感兴趣的群体中分选到冰上微量离心管中的 5 微升冷 FACS 缓冲液中。然后将 1 微升分选的细胞转移到含有 100 微升 FACS 分选缓冲液和 1 至 1， 000 稀释的活/死染色剂的新 FACS 管中。并使用分选门运行细胞样品，以评估分选后的活力。
接下来，将 1 微升用 9 微升 FACS 缓冲液稀释的细胞加载到血细胞计数器上，以确定细胞浓度和平均直径。现在选择适合样品平均细胞直径尺寸的集成微流体电路或 IFC 芯片，并根据制造商的说明灌注液流。根据制造商的说明将细胞加载到板上，然后将板加载到兼容的流体机器中。
然后为 IFC 芯片运行适当的细胞加载脚本，将细胞推入捕获泳道。为了确认细胞是否位于捕获位点，将板安装在配备有板适配器的显微镜上，并以 10 倍放大倍率获得每个捕获位点的明场和荧光图像。然后可以处理细胞，通过 QRT-PCR 进行靶基因表达的下游评估。
在 18 体节阶段，荧光显微镜可用于验证胚胎的 ZsYellow 表达。分选后，获得具有一定直径范围的细胞。IFC 板可用于捕获目标直径的细胞。
例如，在这个实验中，细胞直径为 5 到 10 微米。正如预期的那样，从受精后 18 小时胚胎中分选和捕获的细胞表达 ZsYellow 荧光标记。在这里，使用 QRT-PCR 评估 IFC 板上细胞捕获位点的 40 个单细胞中特定目标基因的相对基因表达。
由于管家基因的循环阈值范围太宽，无法比较样品之间的基因表达，并且许多循环阈值超过 30，因此这些值被可视化为热图。通过比较不同样本，在该实验中观察到基因表达存在显著的异质性。根据基因表达模式将细胞分为 1 至 5 型。
一旦掌握了，如果步骤执行得当，可以在六个小时内在集成的微流控芯片上将整个胚胎样本处理成单个裂解细胞。在尝试此过程时，重要的是要记住，微流控芯片上仅捕获单个细胞。按照此程序，可以执行其他方法（如高通量单细胞测序）来充分表征单细胞的转录组。
开发后，这项技术为发育生物学领域的研究人员探索早期发育胚胎中的细胞异质性铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何从斑马鱼胚胎中分离单细胞、在微流控基础单细胞多路系统中捕获单细胞以及评估单个细胞的基因表达有一个很好的了解。
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概述
本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞，并利用基于微流控的系统对单细胞进行基因表达分析的方法。该技术能够揭示在传统基于细胞群体的方法中常被掩盖的细胞异质性。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 基因表达分析
背景
- 从胚胎中分离单个细胞在技术上具有挑战性。
- 该方法可实现对转录变化的无偏评估。
- 理解细胞命运决定与分化在发育生物学中至关重要。
- 微流控系统可提高单细胞分析的效率。
研究目的
- 从早期斑马鱼胚胎中分离单个细胞。
- 捕获这些细胞以进行基因表达分析。
- 研究细胞分化过程中的转录变化。
使用的方法
- 从斑马鱼胚胎中分离单个细胞。
- 特异性细胞类型的富集。
- 利用基于微流控的系统进行细胞捕获。
- 对单个细胞的基因表达进行评估。
主要结果
- 成功分离出有活力的单个细胞。
- 鉴定细胞间的转录异质性。
- 展示该方法在样本处理中的高效性。
- 通过基因表达分析揭示发育过程的机制。
结论
- 该方法为研究细胞分化提供了一种可靠的途径。
- 它有助于深入理解发育生物学。
- 掌握该技术可实现样本的快速处理。
常见问题
行业重要性概述
从斑马鱼胚胎中进行单细胞分离和基因表达谱分析，能够实现对脊椎动物早期发育过程中细胞异质性的高分辨率解析。该技术通过揭示转录多样性及中间分化状态，支持机制层面的风险评估与靶点验证。在发现阶段整合此类工作流程，可提高后续项目决策的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单细胞水平上研究发育相关基因表达，有助于阐明信号通路。
- 通过区分前体细胞与正在分化的细胞群体，支持生物学风险评估。
- 通过无偏倚地检测细胞异质性，促进功能靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 为高通量多重分析和测序实验制备经过验证的单细胞悬液。
- 标准化细胞分离和活力评估，确保下游实验流程的可重复性。
- 实现定量基因表达检测，支持稳健的实验开发。
转化与临床前研究
- 与疾病相关的发育模型相一致，有助于转化性生物标志物的发现。
- 通过实现对特定细胞类型的转录组分析，为从早期发现到临床前验证提供连续性支持。
- 通过阐明细胞对遗传或化学扰动的响应，支持基于风险评估的推进策略。
流程与工作流整合
该方法将单细胞分析置于早期发现与先导物识别的交汇点，支持在脊椎动物模型中进行假设验证和机制性风险排除。
- 发现生物学：揭示谱系特化与分化过程中的转录变化，用于通路分析。
- 筛选：提供标准化且具有活力的单细胞样本，适用于多重基因表达检测。
- 分析：提供定量的基因表达数据及异质性指标，用于比较分析。
- 转化研究：实现发育过程中基因表达特征与疾病模型的关联分析。
- 企业级复用：提供一种广泛适用的工作流程，可用于斑马鱼中多种细胞类型和遗传背景的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高发育研究中预测的可信度，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化单细胞分离与分析流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过阐明细胞异质性及分化轨迹，为“推进/终止”决策提供依据。
- 项目组合影响：支持根据风险调整对靶点和模型进行优先级排序，推动后续开发。
实施注意事项
- 需要具备斑马鱼操作、细胞解离和微流控技术方面的专业技术知识。
- 需要能够使用荧光激活细胞分选和微流控捕获平台。
- 要求各团队之间在细胞活力和设门策略方面进行严格的标准统一。
- 可根据适当的标记物，适用于多种转基因品系和不同发育阶段。
- 依赖于精细的优化，以确保单细胞捕获并尽量减少技术变异。
