Name: TRUE基因沉默:一个七聚物型小导RNA库的筛选潜在的癌症治疗药 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 了解七聚物型sgRNA文库筛选方法，用于血液癌症治疗药物研发。本方案通过靶向基因编辑技术识别潜在候选药物，为肿瘤学研究提供高效筛选工具。

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本工作由“以目标为导向的可适应与无缝技术转移计划”（Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R）资助。&amp;日本科学技术振兴机构（Japan Science and Technology Agency）、日本私立学校振兴与共济事业团科学研究促进基金，以及日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号24300342和15H04313。

1. 七聚体类型sgRNA文库的构建
<ol>
	<li>除非需要构建全规模文库，否则从 16,384（47）种 7-nt 序列中选择一个子集。 
	注意：这些序列可以是随机的，也可以设计为靶向特定的细胞 RNA。对于后者，可借助适当的计算机程序和/或目视方法，在靶标 RNA 中寻找类似 tRNA T 臂的发夹结构，并选择与这些发夹结构下游紧邻的 7-nt 序列互补的序列4,10,17,18。</li>
	<li>使用 DNA/RNA 合成仪，将每个选定的七聚体合成为完全 2′-O-甲基化、5′-和 3′-磷酸化的 RNA。采用亚磷酰胺法在可控孔径玻璃（CPG）载体上进行合成，并在合成的最后一个循环（即添加 5′ 磷酸基团）中保留 5′-末端的 4,4′-二甲氧基三苯甲基（DMT）保护基23。 
	注意：也可从寡核苷酸供应商处定制合成 RNA。</li>
	<li>完成最后一个合成循环后，将带有合成寡核苷酸的 CPG 从柱子转移至带聚四氟乙烯衬垫螺帽的玻璃小瓶中，加入 1 ml 29% 氨水，于 55 °C 孵育 8 小时，以使寡核苷酸从 CPG 上切割下来，并去除碱基和磷酸基团上的保护基。</li>
	<li>在 40 °C 下使用离心浓缩仪蒸发去除氨水，然后将寡核苷酸重新溶解于 0.2 ml 0.1 M 正己基乙酸铵溶液中。</li>
	<li>使用含有 10–50% 乙腈/0.1 M 正己基乙酸铵缓冲液的聚苯乙烯-二乙烯基苯柱，通过反相高效液相色谱纯化合成的寡核苷酸。在 80 °C 下以 2.0 ml/min 的流速运行色谱柱 25 分钟。</li>
	<li>向分步收集的样品（1–2 ml）中加入 0.25–0.5 ml 浓乙酸，配制成 20% 乙酸溶液，并在室温下孵育 1 小时，以去除 DMT 基团。</li>
	<li>在 40 °C 下使用离心浓缩仪将样品干燥，重新溶解于 1 ml 29% 氨水中，并在室温下孵育 15 分钟，以去除 5′ 磷酸基团的侧链保护基。</li>
	<li>在 40 °C 下使用离心浓缩仪将样品体积（1 ml）浓缩至约 0.3 ml。</li>
	<li>将全部浓缩后的样品置于截留分子量为 1,000 的透析管中，在 4 °C 下与 500 ml 蒸馏水透析过夜。</li>
	<li>用移液器将透析后的样品从透析管转移至 1.5 ml 离心管中，在 40 °C 下使用离心浓缩仪干燥，随后重新溶解于注射用水中，溶解体积应足够小，以获得浓度高于 100 µM 的溶液。</li>
	<li>使用分光光度计测定 RNA 样品在 260 nm 处的光密度，并通过添加注射用水将浓度调整至 100 µM。使用前将 RNA 溶液储存于 -20 °C 以下。</li>
</ol>
2. 细胞活力的sgRNA文库筛选
<ol>
	<li>制备103 细胞/99 μl/孔例如， 在96孔板中，使用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基培养HL60和RPMI-8226细胞。设置仅含培养基的孔用于背景信号扣除。为消除边缘效应，在样品孔周围的空孔中加入无菌水。</li>
	<li>向每孔中加入 1 μl 溶解于注射用水中的 heptamer-type sgRNA（100 μM）。每个 sgRNA 设三个复孔进行检测。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 湿润培养箱中培养3天。</li>
	<li>向每个孔中加入适量的市售WST-8溶液。将培养板置于同一培养箱中，在37 °C孵育1至4小时。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。 
	注意：在大多数情况下，吸光度与活细胞数量之间呈线性关系，除非吸光度值超过1.0。</li>
</ol>


3. 通过流式细胞术评估有效sgRNA

<ol>
	<li>准备103 细胞/99 µl/孔例如， 在96孔板中，用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基培养HL60细胞。每检测一种sgRNA，至少准备10个孔。为消除边缘效应，在样品孔周围的空孔中加入无菌水。</li>
	<li>向每个孔中加入1 µl溶于注射用水中的heptamer型sgRNA（100 µM）。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 湿润培养箱中培养3天。</li>
	<li>用移液器从至少10个孔中收集经相同sgRNA处理的细胞至一个5 ml离心管中。在离心机中以300 × g离心5分钟，弃去培养基。</li>
	<li>加入 2 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）至离心管中，重悬细胞。在离心机中以 300 × g 离心 5 分钟，弃去 PBS。向管中加入 150 µl 1× Annexin V 结合缓冲液，重悬细胞。</li>
	<li>加入 2 µl 藻红蛋白（PE）标记的膜联蛋白 V 溶液和 1 µl 7-氨基放线菌素 D（7AAD）溶液至离心管中，充分混匀，室温避光孵育 15 分钟。使用流式细胞仪分析样品。24.</li>
</ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

新泻药科大学应用生命科学学院对部分七聚体类型sgRNA拥有待审批的专利申请。

在大多数情况下，完全2′-O-甲基化、5′和3′端磷酸化的七聚体型sgRNA溶于注射级水（浓度为100 µM）后，根据其在癌细胞中诱导凋亡的活性判断，于-20 °C以下保存至少一年仍保持稳定。然而，其稳定性会因序列、质量和纯度的不同而有所变化。根据质谱分析，在某些情况下，部分sgRNA分子的5′或3′端磷酸基团在储存过程中可能发生自发性脱落，尽管这通常不会严重影响其活性。
当通过文库筛选获得有效的sgRNA后，可通过DNA微阵列和/或高通量测序进行转录组分析，以确定其在细胞内的靶标RNA。然而，目前获得的数据表明，无论是否存在转染试剂，七聚体型sgRNA介导的靶标RNA下调水平通常较为温和10,12,14,17,18。
靶向BCL2和WT1 mRNA的七聚体类型sgRNA的优势在于，尽管对靶mRNA的下调作用较弱，仍能有效诱导人白血病细胞发生凋亡17,18，这提示可能存在其他RNA靶点和/或除真正的基因沉默之外的其他作用机制。
<p class='jove_...

TRUE基因沉默（以tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing命名）是一种RNA导向的基因沉默技术1。该技术基于tRNase ZL（或3′ tRNase，即tRNA 3′端加工内切核糖核酸酶）的特性而开发：在人工设计的小向导RNA（sgRNA）引导下，通过识别靶RNA与sgRNA之间形成的类似前体tRNA（pre-tRNA）或微小前体tRNA（micro-pre-tRNA）的结构，可在任意预期位点切割任何靶RNA2-9。sgRNA通常长度为7–31 nt，可分为四类：5′-半tRNA、七聚体RNA、14-nt线性RNA和钩状RNA（hook RNA）。
我们已通过将多种人工设计的sgRNA导入活细胞，证明了TRUE基因沉默的有效性10-15。我们还表明，sgRNA可在无需任何转染试剂的情况下被细胞摄取，并可在人癌细胞中下调其靶标RNA水平和/或诱导细胞凋亡16-18。TRUE基因沉默似乎通过tRNase ZL和天然sgRNA作用于细胞内和细胞间的基因调控网络系统19-21。
我们构建了一个包含156种七聚体型sgRNA的文库，用于筛选针对血液系统恶性肿瘤的潜在治疗性七聚体型sgRNA22。我们对该文库在人骨髓瘤和白血病细胞活力方面的影响进行了筛选，发现其中20种可有效诱导至少一种癌细胞系发生凋亡。此外，有4种sgRNA已在小鼠异种移植实验中被证实可降低肿瘤生长速率。
本文介绍了一种针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体类型sgRNA文库筛选方案。该方案包括sgRNA文库的构建方法、如何评估每条sgRNA对细胞活力的影响，以及如何通过流式细胞术进一步验证有效sgRNA的功能。对于sgRNA的细胞靶标RNA分析，以及在小鼠异种移植模型中对有效sgRNA的评估，可依据常规方法进行17,22，但这些步骤未包含在本方案中。

<table><tbody><tr><td>定制七聚体RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC 羧酸酯柱</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>注射用水</td><td>Otsuka Pharmaceutical&amp;nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素混合溶液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 溶液</td></tr><tr><td>酶标仪，Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS 圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记Annexin V 结合缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪，FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

真正的基因沉默：七聚体型小向导rna文库筛选潜在癌症治疗药物

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE基因沉默（以tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing命名）是一种RNA导向的基因沉默技术，该技术利用人工合成的小向导RNA（sgRNA）引导tRNA 3′端加工内切核糖核酸酶tRNase ZL识别靶标RNA。sgRNA可在无需任何转染试剂的情况下被细胞摄取，并能够下调靶标RNA水平和/或在人源癌细胞中诱导细胞凋亡。我们已筛选包含156种七聚体型sgRNA的sgRNA文库，评估其对人源骨髓瘤和白血病细胞存活率的影响，发现其中20种sgRNA可有效诱导至少一种癌细胞系发生凋亡。本文提供了一项针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体型sgRNA文库筛选方案。该方案包括sgRNA文库的构建方法、各sgRNA对细胞活力影响的评估方法，以及通过流式细胞术进一步验证有效sgRNA的操作流程。通过筛选由16,384种七聚体组成的全规模sgRNA文库，预计可获得约2,000个阳性结果。

六种七聚体类型的sgRNA 5′-AUCUUCA-3′（H1885）、5′-ACACACA-3′（H3277）、5′-GGGGGCG-3′（H10927）、5′-GGGGCCC-3′（H10944）、5′-GCCCCCG-3′（H12287）和5′-CACCAGC-3′（H13260）被化学合成为含有5′-和3′-磷酸基团的2′-O-甲基RNA。
这些sgRNA对人白血病细胞系HL60和人骨髓瘤细胞系RPMI-8226的存活率影响进行了检测。细胞活力检测的代表性结果如图所示 图1. 四种sgRNA H1885、H3277、H10927和H13260效果显著，可降低HL60和RPMI-8226细胞的存活率 &gt;80% 和 &gt;70%。此外，还检测了七聚体H3277和H10927对非癌性HEK293细胞活力的影响，结果显示二者几乎不影响细胞活力。22.
<p clas...

本文介绍了一种针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体类型sgRNA文库筛选方案。

真正的基因沉默：七聚体型小向导RNA文库筛选潜在癌症治疗药物

TRUE基因沉默（以tRNase ZL为作用基础的高效基因沉默，tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing）是一种RNA导向的基因沉默技术，其利用……

本筛选的总体目标是寻找针对血液癌症的潜在治疗药物。首先选择一组七聚体序列。这些序列可以是随机的，也可以设计用于靶向特定的细胞RNA。若要靶向特定的细胞RNA，可使用适当的计算机程序寻找与目标RNA中T臂相似的发夹结构，并在其下游立即选择互补的七核苷酸序列。采用亚磷酰胺法，在可控孔径玻璃（CPG）载体上，利用DNA-RNA合成仪将每个选定的七聚体合成为完全2′-O-甲基化、5′和3′端磷酸化的RNA。在合成最后一个循环时，保留5′端的DMT保护基团。完成最后一个循环后，将带有合成寡核苷酸的CPG从柱子转移至带有聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃小瓶中。加入1 mL 29%氢氧化铵，并将小管在55 °C下孵育

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科研

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医学

TRUE基因沉默：一个七聚物型小导RNA库的筛选潜在的癌症治疗药

在此，我们使用人类esiRNA文库进行高通量筛选，以鉴定参与细胞分裂的基因。我们将演示如何设置和开展esiRNA筛选实验，以及如何分析和验证筛选结果。...

用于哺乳动物细胞RNAi筛选的MISSION esiRNA

本文利用人源LentiPlex混合文库和传统测序方法，鉴定促进细胞存活的基因靶点。我们展示了如何建立并解析LentiPlex筛选实验，并对结果进行验证。...

哺乳动物细胞中 MISSION LentiPlex 混合 shRNA 文库筛选

RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.

基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。...

一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX...

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

为了鉴定转录因子的新调控因子，我们开发了一种方法，利用基于双荧光素酶的转录报告基因检测技术，对排列式慢病毒或逆转录病毒RNAi文库进行筛选。该方法能够在单次实验中快速且相对低成本地筛选数百个候选基因。...

利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

利用慢病毒shRNA文库进行高通量RNA干扰（RNAi）筛选，可作为发现恶性肿瘤中具有治疗意义的合成致死靶点的工具。我们提供一种基于shRNA文库的筛选方法，用于研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传调控因子。...

利用shRNA文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。...

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

了解七聚物型sgRNA文库筛选方法，用于血液癌症治疗药物研发。本方案通过靶向基因编辑技术识别潜在候选药物，为肿瘤学研究提供高效筛选工具。

真正的基因沉默：七聚体型小向导RNA文库筛选潜在癌症治疗药物

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