Name: 后生转换为安全和简单的方法来获得成人皮肤成纤维细胞胰岛素分泌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 了解将成人皮肤成纤维细胞通过表观遗传重编程转化为胰岛素分泌细胞的安全方法。该技术无需逆转录病毒载体，也不诱导稳定的多能状态，为糖尿病细胞治疗提供了新的研究方向。

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本工作由Carraresi基金会和欧洲糖尿病研究基金会（EFSD）资助。GP获得米兰大学博士后奖学金的支持。作者为COST行动FA1201 Epiconcept（表观遗传学与围受精期环境）和COST行动BM1308大型动物模型研究进展共享（SALAAM）的成员。TALB为COST行动CM1406表观遗传化学生物学（EPICHEM）的成员。

注意：以下所有操作步骤必须在层流罩内的无菌条件下进行。确保所有培养操作均在恒温控制的载物台上进行，并在整个操作过程中将细胞维持在 37 °C。
1. 皮肤成纤维细胞的分离
<ol>
	<li>准备培养皿包被液
	<ol>
		<li>将0.1 g猪源明胶溶解于100 ml水中（终浓度为0.1%），通过高压灭菌法对溶液进行灭菌。</li>
		<li>向35 mm培养皿中加入1.5 ml无菌的0.1%猪源明胶溶液，室温下静置2小时以完成包被。 
		注意：人皮肤活检组织通过局部麻醉下切除前臂前侧无血管区域的皮肤获取，并在使用前保存于添加了2%抗生素-抗真菌溶液的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于+4 °C环境中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用新鲜的、添加了2%抗生素-抗真菌溶液的PBS洗涤活检组织。</li>
	<li>将活检组织置于100 mm培养皿中，使用无菌手术刀将其切成约2 mm3大小的组织块。</li>
	<li>在接种组织块前，立即去除包被液的多余部分。</li>
	<li>将5–6个皮肤组织块放入预先包被的35 mm培养皿中。</li>
	<li>配制成纤维细胞培养基：77%高糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、20%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺溶液和2%抗生素-抗真菌溶液。</li>
	<li>在每个组织块上滴加一滴成纤维细胞培养基（通常每块100 µl），于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>24小时后，在组织块上加入500 µl成纤维细胞培养基，保持湿润，继续在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>使用移液器至少每48小时更换一次培养基。</li>
	<li>培养6天后，小心移除并弃去组织块。 
	注意：6天后，成纤维细胞开始从组织块中迁移出来，并逐渐形成单层细胞。</li>
	<li>更换新鲜培养基，加入2 ml成纤维细胞培养基，继续在37 °C、5% CO2培养箱中进行单层细胞培养。</li>
</ol>
2. 成纤维细胞培养
<ol>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养成纤维细胞，直至细胞融合度达到 80%</li>
	<li>传代时，吸除组织培养皿中的成纤维细胞培养基，用 4 ml 含 1% 抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA 溶液（体积为培养基体积的 10%，含 0.5 g/L 猪胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA），于 37 °C 培养，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱离且细胞解离。</li>
	<li>用 9 份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶活性。无需离心。</li>
	<li>将细胞接种至新的培养皿中（无需明胶包被），在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。根据细胞生长速率，保持 1:2 至 1:4 的传代比例。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 80% 时进行传代（通常每周两次）。</li>
</ol>
3. 成纤维细胞接种用于表观遗传学转化
<ol>
	<li>向细胞培养皿中加入 0.26 ml/cm2 的 0.1% 猪源明胶（按 1.1 中所述方法配制）。静置 2 小时进行包被。</li>
	<li>在接种成纤维细胞前 10–30 分钟，移除多余的包被液。</li>
	<li>从培养皿中移除成纤维细胞培养基，用含 1% 抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA 溶液（含 0.5 g/L 猪源胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA），体积为原培养基体积的 10%，于 37 °C 孵育，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱离且细胞发生解离。</li>
	<li>用 9 份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶的活性。</li>
	<li>在室温下使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。根据所需细胞浓度 7.8 × 104 个成纤维细胞/cm2，计算重悬细胞所需的成纤维细胞培养基体积。该体积取决于所使用的特定培养腔室类型。 
	细胞/µl = 每个小方格平均细胞数 × 90（稀释倍数）× 稀释倍数</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以 150 g 离心 5 分钟。弃去上清液，并用先前计算好的体积的成纤维细胞培养基重悬细胞。</li>
	<li>将细胞接种至预先用 0.1% 明胶包被的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。</li>
</ol>
4. 使用去甲基化试剂 5-aza-CR 增强细胞可塑性
<ol>
	<li>第0天
	<ol>
		<li>通过将2.44 mg的5-aza-CR溶解于10 ml高糖DMEM培养基中，制备5-aza-CR储备液。过滤除菌。使用前立即配制5-aza-CR储备液。</li>
		<li>将1 µl的5-aza-CR储备液加入1 ml成纤维细胞培养基中稀释（终浓度为1 µM）。</li>
		<li>为提高细胞可塑性，在细胞接种后24小时（见第3.8节），移除培养基，向接种的成纤维细胞中加入1 µM的5-aza-CR储备液，并在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>按照表1所述方法新鲜配制人多能性（HP）培养基。</li>
		<li>经1 µM 5-aza-CR处理后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞三次，以确保完全去除5-aza-CR。</li>
		<li>将经5-aza-CR处理的成纤维细胞在37 °C、5% CO2条件下，用HP培养基孵育3小时（恢复期）。</li>
		<li>恢复期结束后，移除培养基，并用PBS洗涤三次。</li>
		<li>为监测5-aza-CR处理效率，此步骤中应观察是否存在形态学变化（详见结果部分）。细胞将失去成纤维细胞典型的细长形态，转变为圆形或椭圆形，体积变小，细胞核增大。</li>
		<li>继续进行胰腺定向分化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 胰腺分化方案
<ol>
	<li>第1-6天
	<ol>
		<li>按照表2所述配制胰腺基础培养基。</li>
		<li>配制激活素A储存液：将5 µg激活素A重组人蛋白溶解于166.6 µl无菌水中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2培养箱中，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养经5-氮杂-胞苷（5-aza-CR）处理的成纤维细胞，培养基中添加1 µl/ml激活素A储存液（见5.1.2），持续6天。每天更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第7-8天
	<ol>
		<li>通过将16.6 ml二甲基亚砜（DMSO）加入50 mg全反式维甲酸中，配制维甲酸储存液。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养细胞，培养基中添加1 µl/ml激活素A储存液（见5.1.2）和1 µl/ml维甲酸储存液（见5.2.1），持续2天。每天更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第9-36天
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2培养箱中，使用0.26 ml/cm2的胰腺基础培养基培养细胞，培养基中添加1%（v/v）胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、2%（v/v）B27和0.1%（v/v）重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）储存液（见表1）。前15天每天更换培养基。</li>
		<li>从第16天开始，每隔一天更换一次培养基，并在显微镜下观察，因为形成的细胞聚集体可能从培养皿底部脱落。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本文描述了一种将人类皮肤成纤维细胞转化为胰岛素生成细胞的方法，该方法通过短暂暴露于5-aza-CR，随后进行组织特异性诱导方案实现。该策略可实现从中胚层向内胚层相关细胞的转变，无需强制表达转录因子或微小RNA，也无需获得稳定的多能状态，从而避免了细胞稳定性降低及易出错的问题14。
第一步中，通过使用一种合成的表观遗传修饰剂，终末分化的细胞被诱导进入一种短暂且可逆的容许状态，从而提高了细胞可塑性。具体而言，使用了5-aza-CR以引起皮肤成纤维细胞全基因组甲基化的降低。已知5-aza-CR可直接抑制甲基转移酶活性，并阻止新合成DNA中的从头甲基化（de novo methylation）。由于这一作用，该分子此前已被用于重新激活沉默基因，以及改变真核细胞的分化状态15,16。与此一致的是，经5-aza-CR处理后的皮肤成纤维细胞显示出全基因组DNA去甲基化现象（图2A），表明5-aza-CR具备提高本实验所用细胞可塑性的能力。这一结果也与已有观察一致，即5-aza-CR可促进神经球细胞（N...

再生医学的一个基本目标是生成新的功能性细胞，用于修复或替换受损或退化的组织。通过将一种类型的细胞转化为另一种类型，将容易获取的成体细胞重编程为新细胞，是一种极具吸引力的方法，尤其是在所需细胞群体数量稀少或难以获取的情况下。然而，成体细胞具有极高的稳定性。它们通过逐步限制其分化潜能而获得特定的分化状态，一旦达到成熟的终末分化状态，便会稳定地维持这一状态1。
近年来，已开发出多种方案，可通过强制表达一组转录因子实现体细胞重编程为多能性细胞（iPS）2,3。此外，也可通过直接谱系转分化实现细胞转化，即导入单一4或多种转录因子的组合5-7。该策略不经过去分化状态的过渡，但需要特定转录因子的高表达8。
我们近期开发了一种转化方案，该方案基于将成体细胞短暂暴露于胞苷类似物5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza-CR）的去甲基化作用下，后者是一种特征明确的DNA甲基转移酶抑制剂。去甲基化步骤之后立即进行特定的分化方案9-11，从而获得所需的终末表型。该方法能够将成熟、已分化的细胞转化为不同谱系的细胞，并具有显著优势：无需使用病毒载体，也无需转染任何外源性转录因子。同时，该方法避免了获得稳定多能状态及其相关的细胞不稳定性风险。
本文介绍了将成人人类皮肤成纤维细胞转化为具有完全功能的胰岛素分泌细胞的详细方案。然而需要指出的是，该技术已应用于不同类型的细胞，并在引导细胞向多种分化途径转变时取得了积极成果。此外，表观遗传转化已在人类和猪物种中成功应用9-13，也在犬类中得到成功应用（论文已提交），表明该方法具有广泛的效力和稳健性。

<table><tbody><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS；用于细胞洗涤和溶液配制</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的组分</td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>用于成纤维细胞分离</td></tr><tr><td>猪明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>用于培养皿包被</td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>用于溶液配制</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>用于成纤维细胞分离</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>用于成纤维细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td>FBS；成纤维细胞和 HP 培养基的组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>成纤维细胞、HP 和胰腺培养基的组分</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>用于成纤维细胞解离</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>5-氮杂胞苷</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR，用于提高成纤维细胞的可塑性</td></tr><tr><td>Ham's F-10 营养混合物</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>用于 HP 培养基</td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸</td><td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>用于 HP 培养基</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>HP 培养基的组分</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Life Technologies</td><td>11140035</td><td>HP 和胰腺基础培养基的组分</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>HP 和胰腺基础培养基的组分</td></tr><tr><td>鸟苷</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>HP 培养基核苷混合储备液组分</td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>HP 培养基核苷混合储备液组分</td></tr><tr><td>胞苷</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>HP 培养基核苷混合储备液组分</td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>HP 培养基核苷混合储备液组分</td></tr><tr><td>胸苷</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>HP 培养基核苷混合储备液组分</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>用于溶液过滤除菌</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) 重组人蛋白</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF；HP 和胰腺基础培养基的组分</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA；胰腺基础培养基的组分</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>用于胰腺基础培养基</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A）</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>胰腺培养基的组分</td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>胰腺基础培养基的组分</td></tr><tr><td>Activin A 重组人蛋白</td><td>Life Technologies</td><td>PHG9014</td><td>用于胰腺培养基</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>用于胰腺培养基</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO；用于视黄酸储备液配制</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS；用于胰腺终末培养基</td></tr><tr><td>抗波形蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:100</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI；用于免疫细胞化学分析，工作稀释度&amp;nbsp; 1 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>5-甲基胞苷</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:500</td></tr><tr><td>抗C肽抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:100</td></tr><tr><td>抗PDX1抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>用于免疫细胞化学分析，工作稀释度 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia 胰岛素 ELISA 试剂盒</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>用于胰岛素释放检测</td></tr></tbody></table>

表观遗传重编程作为从成体皮肤成纤维细胞获取胰岛素分泌细胞的一种安全简便方法

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

再生医学需要将新的、功能完整的细胞递送至患者体内，以修复退化或受损的组织。当这类细胞难以直接获取时，可通过多种方法获得，其中包括重编程和转分化，这些技术各有其优势与局限性。本文介绍一种将成年成熟成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新策略，该细胞被任意命名为表观遗传转化细胞（epigenetic converted cells, EpiCC）。该方法基于对调控细胞命运和分化的表观遗传机制的深入理解而开发。具体而言，第一步采用一种表观遗传修饰剂——5-aza-胞苷（5-aza-cytidine），诱导成年细胞进入“高度可塑”状态；随后利用这一短暂且可逆的表观遗传可塑性窗口，将细胞重新导向另一谱系。该策略被称为“表观遗传细胞转化”，是一种简单而稳健的方法，可实现高效、可控且稳定的细胞跨谱系转换。由于该方案不涉及任何基因转染，无需病毒载体，也不经过稳定的多能性状态，因此在转化医学应用中具有广阔前景。

从皮肤活检样本建立原代培养 
将皮肤活检样本切成小片段，并置于明胶预包被的培养皿中。6天后，成纤维细胞开始从组织片段中生长出来，并形成单层细胞（图1A）。细胞呈典型的细长形态，且如预期一样，对成纤维细胞特异性标志物波形蛋白（Vim，图1B）表现出一致的免疫阳性反应。
皮肤成纤维细胞经 5-aza-CR 处理 18 小时后的形态学变化及甲基化模式 
为成功实现成纤维细胞向胰岛素分泌细胞的表观遗传转化，我们使用去甲基化试剂 5-aza-CR 来增强其可塑性。将人源成纤维细胞以 7.8 × 104 个成纤维细胞/cm2 的密度接种于预先涂有 0.1% 明胶的培养皿中。接种后 24 小时，细胞用 1 µm 的 5-aza-CR 孵育 18 小时。
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本文介绍了一种可将成体皮肤成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞的新方法。该技术基于表观遗传重编程，无需使用逆转录病毒载体，也不需要获得稳定的多能性状态，因此在转化医学应用中具有广阔前景。

再生医学需要将新的、功能完整的细胞递送至患者体内，以修复退化或受损的组织。当此类……

本实验的总体目标是将成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞，同时不诱导多能性，也不使用逆转录病毒载体。该方法有助于回答再生医学领域，尤其是糖尿病细胞治疗中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，我们能够在不诱导细胞产生稳定的多能状态且不使用逆转录病毒载体的情况下，实现细胞表型的转变。本实验操作将由本实验室的博士后 Georgia Pennarossa 演示。开始操作时，向35毫米的培养皿中加入1.5毫升无菌的0.1%猪源明胶，室温下孵育2小时以完成包被。接着，用含有2%抗生素-抗真菌溶液的PBS冲洗人皮肤活检组织。随后，将活检组织置于100毫米的培养皿中，用无菌手术刀将其切成约2立方毫米大小的组织块。然后，将5至6个皮肤组织块放入预先包被的35毫米培养皿中。每个组织块上滴加一滴成纤维细胞培养基，并在37°C、5% CO₂条件下进行培养。孵育六天后，小心弃去组织碎片。成纤维细胞应开始从组织碎片中生长出来，并逐渐形成单层细胞。在此步骤中，将成纤维细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养至80%汇合度。然后将细胞接种至新的培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，传代比例根据细胞生长速度保持在1:2至1:4之间。接着，在细胞培养皿中加入0.1%猪源明胶，室温孵育2小时以完成包被。在接种成纤维细胞前10至30分钟，去除多余的包被液。随后，从培养皿中移除成纤维细胞培养基。用含1%抗生素-抗真菌溶液的PBS洗涤细胞三次。然后，加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA溶液。在37摄氏度下孵育，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱离，且细胞发生解离。随后，用九份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶的消化作用。然后，在室温下使用血细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数。计算所需成纤维细胞培养基的体积，以重悬细胞并获得每平方厘米7.8 × 10⁴个成纤维细胞的细胞浓度。随后，将细胞悬液在室温下以150 × g离心5分钟。然后，移除上清液，并用计算好的体积的成纤维细胞培养基重新悬浮细胞。随后，将细胞接种至预先用0.1%明胶包被的培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。在第0天使用前，立即通过将2.44毫克5-aza-CR溶解于10毫升DMEM高糖培养基中来配制5-aza-CR储存液。通过过滤灭菌。接着，将1微升5-aza-CR储存液稀释至1毫升成纤维细胞培养基中。为提高细胞可塑性，在细胞接种后24小时，移除接种的成纤维细胞的培养基。加入1 µM的5-aza-CR储存液，在37°C、5% CO₂条件下培养18小时。第1天，制备新鲜的HP培养基。用1 µM 5-aza-CR孵育后，移除培养基，并用HP培养基洗涤细胞3次，以确保完全去除5-aza-CR。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用HP培养基孵育经5-aza-CR处理的成纤维细胞3小时。为监测5-aza-CR处理的效率，观察是否存在任何形态学变化。细胞应失去成纤维细胞典型的细长形态，转变为更小的圆形或椭圆形，并伴有细胞核增大。在第1至第6天，配制胰腺基础培养基和Activin A储备液。随后，将经5-aza-CR处理的成纤维细胞接种于添加了Activin A储备液的胰腺基础培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养6天，每天更换培养基。在第7至第8天，通过将16.6毫升DMSO加入50毫克视黄酸中，配制视黄酸储备液。将细胞在添加了Activin A储备液和视黄酸储备液的胰腺基础培养基中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天，每天更换培养基。从第9天至第36天，将细胞在添加了ITS、B27和BFGS储备液的胰腺基础培养基中培养，前15天每天更换培养基，从第16天起每隔一天更换一次培养基。培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳。该图展示了内分泌胰腺分化过程中发生的形态学变化。在诱导七天后，人类细胞逐渐聚集成团。在添加视黄酸后，细胞重排为网状结构，并聚集成可区分的细胞团块。这些结构随着时间推移逐渐发展，招募细胞并聚集成扩大的三维克隆。最终，克隆形成倾向于从培养表面脱离并在培养基中自由漂浮的球形结构，类似于体外培养的典型胰腺胰岛。经过36天的胰腺诱导后，人表观遗传转化细胞的全基因组DNA甲基化水平恢复至未处理成纤维细胞所观察到的水平。在转化末期可观察到PDX1与CPEP的共定位，而这些内分泌胰腺标志物在未经处理的成纤维细胞中则完全缺失。该图显示了表观遗传转化细胞在暴露于20毫摩尔D-葡萄糖和20毫摩尔L-葡萄糖后胰岛素的释放量。若操作得当，掌握该技术后可在38天内完成。 该研究一经发展，便为再生医学领域的研究人员探索糖尿病的细胞治疗应用于人体铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何将成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞，且在此过程中不诱导多能性，也不使用逆转录病毒载体。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

后生转换为安全和简单的方法来获得成人皮肤成纤维细胞胰岛素分泌细胞

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本文介绍一种结合化学表观遗传擦除与力学感应相关信号的方法，可高效生成哺乳动物多能细胞，且无需基因转染或逆转录病毒载体。因此，该策略在转化医学领域具有广阔前景，并代表了干细胞类器官技术的重要进展。...

一种结合表观遗传修饰与生物力学信号的两步法策略以生成哺乳动物多能细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。...

小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

了解将成人皮肤成纤维细胞通过表观遗传重编程转化为胰岛素分泌细胞的安全方法。该技术无需逆转录病毒载体，也不诱导稳定的多能状态，为糖尿病细胞治疗提供了新的研究方向。

表观遗传重编程作为从成体皮肤成纤维细胞获取胰岛素分泌细胞的一种安全简便方法

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