后生转换为安全和简单的方法来获得成人皮肤成纤维细胞胰岛素分泌细胞

该程序的总体目标是在不诱导多能性或使用逆向活度载体的情况下将成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞。这种方法可以帮助回答再生医学领域的关键问题，尤其是糖尿病的细胞治疗。该技术的主要优点是我们可以获得表型的转换，而无需在转化细胞中诱导稳定的多能状态，也无需逆转录病毒载体。

演示该程序的是我们实验室的博士后 Georgia Pennarossa。要开始此程序，请将 1.5 毫升无菌 0.1% 猪明胶添加到 35 毫米培养皿中，并在室温下包被 2 小时。接下来，用补充有 2% 抗生素抗真菌溶液的 PBS 清洗人体皮肤活检。

之后，将活检结果放入 100 毫米的培养皿中，并用无菌手术刀将它们切成大约 2 立方毫米的碎片。然后，将 5 到 6 个皮肤碎片放入预先涂有的 35 毫米培养皿中。在每个片段上加入一滴成纤维细胞培养基，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养它们。

孵育 6 天后，小心丢弃组织碎片。成纤维细胞应开始从组织碎片中长出并开始形成细胞单层。在此过程中，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养成纤维细胞，直到 80% 汇合。

然后将细胞接种在新的培养皿中。在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养它们，并将通过率保持在 1 比 2 和 1 比 4 之间，具体取决于生长速率。接下来，将 0.1% 猪明胶添加到细胞培养皿中，并包被 2 小时。

在成纤维细胞铺板前 10 至 30 分钟去除多余的涂层溶液。然后，从培养皿中取出成纤维细胞培养基。用补充有 1% 抗生素抗真菌溶液的 PBS 洗涤细胞 3 次。

然后，添加一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA 溶液。在 37 摄氏度下孵育，直到细胞单层开始从组织培养皿底部分离并且细胞解离。之后，用 9 份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶的作用。

然后，在室温下使用显微镜下的计数室对细胞进行计数。计算重悬细胞所需的成纤维细胞培养基的体积，并获得每平方厘米第 4 个成纤维细胞的 7.8 乘以 10 至第 4 个成纤维细胞的浓度。随后，在室温下以 150 g 离心细胞悬液 5 分钟。

然后，去除上清液，并用计算体积的成纤维细胞培养基重悬细胞。之后，将细胞接种在 0.1% 明胶预涂培养皿上，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养 24 小时。在第 0 天，临使用前，通过将 2.44 毫克 5-氮杂-CR 溶解在 10 毫升 DMEM 高葡萄糖培养基中来制备 5-氮杂-CR 储备液。

通过过滤对其进行消毒。接下来，在 1 毫升成纤维细胞培养基中稀释 1 微升 5-氮杂-CR 储备液。为了提高细胞可塑性，在细胞铺板后 24 小时从接种的成纤维细胞中去除培养基。

加入 1 微摩尔 5-氮杂-CR 储备液，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养 18 小时。第一天，准备新鲜的 HP 培养基。与一微摩尔 5-aza-CR 孵育后，去除培养基并用 HP 培养基洗涤细胞 3 次，以确保冲洗掉 5-aza-CR。

然后，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中，用 HP 培养基浸泡 5-aza-CR 处理的成纤维细胞 3 小时。为了监测 5-aza-CR 治疗的效率，请检查是否有任何形态变化。细胞应失去成纤维细胞的典型细长形态，并获得较小的圆形或椭圆形，细胞核增大。

在第 1 天到第 6 天，准备胰腺基础培养基和 Activin A 储备液。然后，在补充有激活素 A 储备液的胰腺基础培养基中，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养 5-氮杂-CR 处理的成纤维细胞 6 天，并每天更换培养基。在第 7 天到第 8 天，通过将 16.6 毫升 DMSO 添加到 50 毫克视黄酸中来制备视黄酸储备液。

将细胞在补充有激活素 A 储备液和视黄酸储备液的胰腺基础培养基中，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养两天，并每天更换培养基。在第 9 天到第 36 天，培养补充有 ITS、B27 和 BFGS 储备液的细胞和胰腺基础培养基，并在前 15 天每天更换培养基，从第 16 天开始每隔一天更换一次培养基。在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养细胞。

该图显示了内分泌胰腺分化过程中发生的形态变化。诱导 7 天后，人体细胞逐渐成簇组织。为了响应维甲酸的添加，它们以网状模式重排并聚集在可区分的聚集体中。

这些形成随着时间的推移而进展，募集细胞并聚集扩大的 3D 集落。最后，集落变成球形结构，倾向于分离并在培养基中自由流动，让人想起体外典型的胰岛。胰腺诱导 36 天后，人类表观遗传转化细胞的整体 DNA 甲基化水平恢复到在未处理的成纤维细胞中观察到的水平。

转化期结束时观察到 PDX1 与 CPEP 的共定位，而这些内分泌胰腺标志物在未经处理的成纤维细胞中完全不存在。该图显示了表观遗传转化细胞响应 20 毫摩尔 D-葡萄糖和 20 毫摩尔 L-葡萄糖暴露而释放的胰岛素量。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 38 天内完成。

发展，这项研究为再生医学领域的研究人员探索人类糖尿病的细胞疗法铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何在不诱导多能性或使用逆转录病毒载体的情况下将成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞有很好的了解。