Name: 肠缺血再灌注损伤的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学习建立小鼠肠缺血再灌注损伤模型，通过暂时夹闭肠系膜上动脉分支诱导可重复的肠道损伤。该方法安全无致死性，适用于胃肠病学和免疫学研究中损伤与再生机制的探索。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由俄罗斯科学基金会（资助号：14-50-00060）和有限责任公司 RUSCHEMBIO 资助。本工作还获得了美国克罗恩病和结肠炎基金会资助 294083（授予 A.V.T.）以及美国国立卫生研究院资助 RO1 DK47700（授予 C.J.）的支持。

动物实验按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经特鲁多研究所机构动物护理与使用委员会批准。研究使用8至12周龄的C57BL/6小鼠。
1. 手术准备
<ol>
	<li>准备并灭菌手术器械。</li>
	<li>准备基于异氟烷的麻醉系统，包括鼻罩和加热垫。确保加热垫未过热（&#60;39 ºC）。</li>
	<li>确保异氟烷废气吸附罐放置正确，吸附罐底部的排气口不得被任何方式堵塞或遮挡。在操作前称量废气吸附罐重量，并将重量记录在罐体上。当吸附罐增重超过50 g（约12小时）时，应丢弃该吸附罐。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>将小鼠置于诱导室中，使用3%异氟烷（1 L/min O2）进行麻醉。
	<ol>
		<li>通过小鼠无法保持直立、失去有目的的自主运动、角膜反射消失、肌肉松弛以及对反射刺激（如用力捏脚趾或尾巴）无反应来评估麻醉深度。</li>
		<li>通过观察胸壁和腹部运动评估呼吸频率和呼吸模式。在理想麻醉状态下，呼吸频率应约为55–65次/分钟。</li>
		<li>将小鼠从诱导室中取出，并迅速剃除其腹部毛发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为防止角膜干燥，将温和的眼科软膏涂抹于小鼠眼睛中。</li>
	<li>将小鼠放置于加热垫上，并通过鼻罩连接至麻醉系统。确保乳胶鼻罩紧密贴合小鼠头部，且异氟烷无泄漏。</li>
	<li>将异氟烷流量降低至1.5%，并皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg），以防止疼痛级联反应的增强。</li>
	<li>用浸有聚维酮碘外科溶液的无菌棉签擦拭手术区域皮肤，随后用70%乙醇擦拭。</li>
</ol>
3. 手术
<ol>
	<li>使用手术剪在腹部正中线处做一长度为3-5 cm的剖腹切口。用生理盐水浸湿的无菌不粘敷料覆盖手术区域。用生理盐水浸湿的棉签分离盲肠和回肠，并暴露肠系膜上动脉。</li>
	<li>为便于夹闭血管，使用精细虹膜剪在肠系膜上动脉周围的肠系膜上制造小切口。操作时，用敷料钳轻轻提起肠管，在预定夹闭位置两侧的肠系膜上动脉旁剪开（图1A）。然后在夹闭前，在预定夹闭部位滴加少量无菌生理盐水。 
	注意：进行假手术时，请按手术步骤执行至3.2步，但不施加血管夹。相反，按照3.6步骤所述，持续滴加温热生理盐水以保持组织湿润，维持1小时。之后继续进行第4.1步。</li>
	<li>使用微血管夹（70 g力度）及施夹器夹闭肠系膜上动脉的一级分支，以形成一段位于盲肠附近的5-7 cm长的缺血性回肠区域（图1B）。尽管血管位置相对恒定，但小鼠之间可能存在轻微差异（见图1示例）。因此，通常需要使用2或3个血管夹（见图1A、D、E中黑色箭头所示夹子位置）。 
	注意：使用高质量的血管夹。高压夹可能损伤血管并阻碍再生，而低压夹（&#60;30 g）可能无法完全阻断血流。</li>
	<li>在血管上跨置两个微血管夹（40 g力度），以阻断肠道侧支血流&#160;，从而界定缺血肠段的范围（图1）。必须阻断侧支血管，以防止邻近血管供血（见图1A、D、E中绿色箭头所示夹子位置）。</li>
	<li>可选：滴加肝素溶液（6 USP单位/ml）以防止血液凝固。将0.5 ml肝素溶液逐滴加至分离出的肠段。</li>
	<li>用预热至37 °C的生理盐水浸湿无菌不粘敷料，轻轻覆盖于手术区域。确保敷料在整个操作过程中保持湿润。</li>
	<li>在整个过程中维持1-1.5%异氟烷麻醉，持续缺血60分钟。若缺血操作正确，缺血区域约30分钟后将变为酒红色。注意，夹闭远端的血管在缺血期间会扩张（图1右侧面板），表明夹闭成功。</li>
	<li>在缺血阶段密切监测小鼠状态。持续向覆盖手术区域的不粘敷料&#160;滴加生理盐水。</li>
	<li>通过移液器在组织上滴加20 μl Gill's 3苏木精溶液标记缺血区域的边缘，以便后续从同一只小鼠中分别采集缺血组织及相邻健康组织进行比较（图1E右侧面板）。</li>
</ol>
4. 再灌注阶段
<ol>
	<li>缺血结束时，在夹闭区域滴加少量生理盐水，使用动脉夹施加器轻柔地移除微血管夹。然后用浸有生理盐水的棉签轻柔地将肠管推回腹腔内。移除非粘附性敷料，使用9 mm不锈钢伤口夹关闭腹壁和皮肤。若再灌注时间超过3小时，应在皮肤上使用伤口夹前，先用可吸收的薇乔缝线缝合腹壁。</li>
	<li>将小鼠置于加热的洁净笼中，根据实验设计维持所需的再灌注时间（30分钟、60分钟、120分钟或180分钟）。</li>
	<li>至少每30分钟检查一次动物，以确保其状态稳定。</li>
</ol>
5. 小肠的剖检与采集
<ol>
	<li>在再灌注后所需时间点，通过过量 CO2 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>打开腹腔，收集缺血性肠组织用于进一步分析。同时采集损伤组织邻近的健康正常组织作为内部对照，以排除任何对损伤的全身性反应。 
	注意：此对照比假手术对照小鼠更为合适，因为假手术小鼠不会经历缺血-再灌注（IR）损伤所引发的全身性反应。</li>
	<li>使用装有灌胃针头并充满生理盐水的 30 ml 注射器冲洗肠内容物，然后纵向切开肠道。若需获取肠道样本用于基因表达分析，可纵向切取一段 1.5 mm 的组织片段，其余部分用于组织学分析。</li>
	<li>进行组织学分析时，使用一对镊子将肠道卷成瑞士卷状（Swiss roll）。</li>
	<li>为保持卷曲形态，将肠道组织置于活检泡沫垫之间，并放入组织包埋盒中（图 2）。将包埋盒置于 10% 缓冲福尔马林溶液中。</li>
	<li>在福尔马林中固定组织至少 24 小时。随后更换为 70% 乙醇继续固定 24 小时。可在室温下长期保存于 70% 乙醇中。</li>
	<li>石蜡包埋，切片厚度为 5 µm，按照标准方案进行苏木精-伊红染色（图 3）。</li>
</ol>
6. 评分
<ol>
	<li>按照表2中总结的方法对小鼠缺血-再灌注损伤进行评分，并选择合适的评分方法。</li>
	<li>可选：将视野分为四个区域，因为损伤严重程度在不同区域存在差异。</li>
	<li>根据盲法获得的评分结果，计算每个区域的平均等级。</li>
	<li>使用Kruskal-Wallis检验比较不同病例组与对照组之间以及损伤组织与未损伤组织之间的等级，随后进行Dunn's多重比较检验。</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17, 1391-1401 (2011).</li>
<li>Lenaerts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+intestinal+ischemia-reperfusion+injury%3A+implications+for+intestinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury: implications for intestinal transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 18, 298-303 (2013).</li>
<li>Yasuhara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+mesenteric+ischemia%3A+the+challenge+of+gastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Today%22%5BJournal%5D)">Acute mesenteric ischemia: the challenge of gastroenterology.</a> Surg Today. 35, 185-195 (2005).</li>
<li>Perez-Chanona, E., Muhlbauer, M., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+protects+against+ischemia%2Freperfusion-induced+intestinal+injury+through+nucleotide-binding+oligomerization+domain-containing+protein+2+%28NOD2%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The microbiota protects against ischemia/reperfusion-induced intestinal injury through nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 (NOD2) signaling.</a> Am J Pathol. 184, 2965-2975 (2014).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+relationships+among+the+formation+of+reactive+oxygen+species%2C+cell+membrane+instability+and+innate+autoimmunity+in+intestinal+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Delineating the relationships among the formation of reactive oxygen species, cell membrane instability and innate autoimmunity in intestinal reperfusion injury.</a> Mol Immunol. 58, 151-159 (2014).</li>
<li>Yoshiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+gut+commensal+bacteria+attenuates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G1020-G1030 (2011).</li>
<li>Wu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+for+complement+component+C3a+mediates+protection+from+intestinal+ischemia-reperfusion+injuries+by+inhibiting+neutrophil+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The receptor for complement component C3a mediates protection from intestinal ischemia-reperfusion injuries by inhibiting neutrophil mobilization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 9439-9444 (2013).</li>
<li>Muhlbauer, M., Perez-Chanona, E., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-specific+MyD88+signaling+mediates+ischemia%2Freperfusion-induced+intestinal+injury+independent+of+microbial+status%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-specific MyD88 signaling mediates ischemia/reperfusion-induced intestinal injury independent of microbial status.</a> Inflamm Bowel Dis. 19, 2857-2866 (2013).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G63-G75 (2015).</li>
<li>Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+intestinal+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A new model for intestinal ischemia in the rat.</a> J Surg Res. 49, 168-173 (1990).</li>
<li>Goldsmith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell-derived+mu-opioid+signaling+protects+against+ischemia+reperfusion+injury+through+PI3K+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell-derived mu-opioid signaling protects against ischemia reperfusion injury through PI3K signaling.</a> Am J Pathol. 182, 776-785 (2013).</li>
<li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase-3beta+inhibition+attenuates+the+development+of+ischaemia%2Freperfusion+injury+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase-3beta inhibition attenuates the development of ischaemia/reperfusion injury of the gut.</a> Intensive Care Med. 33, 880-893 (2007).</li>
<li>Farber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+inhibitor+of+apoptosis+decreases+tissue+injury+after+intestinal+ischemia-reperfusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">A specific inhibitor of apoptosis decreases tissue injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice.</a> J Vasc Surg. 30, 752-760 (1999).</li>
<li>Ben, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+mediates+lung+injury+and+inflammation+in+intestinal+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">TLR4 mediates lung injury and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion.</a> J Surg Res. 174, 326-333 (2012).</li>
<li>Watson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury+triggers+activation+of+innate+toll-like+receptor+4+and+adaptive+chemokine+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Intestinal ischemia/reperfusion injury triggers activation of innate toll-like receptor 4 and adaptive chemokine programs.</a> Transplant Proc. 40, 3339-3341 (2008).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MyD88+signaling+pathway+inhibits+ischemia-reperfusion+injury+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of the MyD88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G324-G334 (2012).</li>
<li>Murayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+%28c-Jun+NH2+terminal+kinase%29+and+p38+during+ischemia+reperfusion+injury+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">JNK (c-Jun NH2 terminal kinase) and p38 during ischemia reperfusion injury in the small intestine.</a> Transplantation. 81, 1325-1330 (2006).</li>
<li>Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+development+of+intestinal+tissue+injury+after+strangulation+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion.</a> Surgery. 107, 574-580 (1990).</li>
<li>Jilling, T., Lu, J., Jackson, M., Caplan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+apoptosis+initiates+gross+bowel+necrosis+in+an+experimental+rat+model+of+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial apoptosis initiates gross bowel necrosis in an experimental rat model of neonatal necrotizing enterocolitis.</a> Pediatr Res. 55, 622-629 (2004).</li>
<li>Aprahamian, C. J., Lorenz, R. G., Harmon, C. M., Dimmit, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+is+protective+of+ischemia-reperfusion-mediated+small-bowel+injury+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 is protective of ischemia-reperfusion-mediated small-bowel injury in a murine model.</a> Pediatr Crit Care Med. 9, 105-109 (2008).</li>
<li>Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+protective+against+neonatal+murine+ischemia-reperfusion+intestinal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury.</a> J Pediatr Surg. 45, 1246-1255 (2010).</li>
<li>Fleming, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-phospholipid+antibodies+restore+mesenteric+ischemia%2Freperfusion-induced+injury+in+complement+receptor+2%2Fcomplement+receptor+1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-phospholipid antibodies restore mesenteric ischemia/reperfusion-induced injury in complement receptor 2/complement receptor 1-deficient mice.</a> J. Immunol. 173, 7055-7061 (2004).</li>
<li>Fleming, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+complement+receptors+1+and+2+lack+a+tissue+injury-inducing+subset+of+the+natural+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in complement receptors 1 and 2 lack a tissue injury-inducing subset of the natural antibody repertoire.</a> J. Immunol. 169, 2126-2133 (2002).</li>
<li>Lapchak, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+orchestrate+remote+tissue+damage+after+mesenteric+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Platelets orchestrate remote tissue damage after mesenteric ischemia-reperfusion.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G888-G897 (2012).</li>
<li>Rehrig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+inhibitor%2C+complement+receptor+1-related+gene%2Fprotein+y-Ig+attenuates+intestinal+damage+after+the+onset+of+mesenteric+ischemia%2Freperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement inhibitor, complement receptor 1-related gene/protein y-Ig attenuates intestinal damage after the onset of mesenteric ischemia/reperfusion injury in mice.</a> J. Immunol. 167, 5921-5927 (2001).</li>
<li>Hoffman, S. M., Wang, H., Pope, M. R., Fleming, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+infection+alters+MyD88+and+Trif+signalling+in+response+to+intestinal+ischaemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter infection alters MyD88 and Trif signalling in response to intestinal ischaemia-reperfusion.</a> Exp Physiol. 96, 104-113 (2011).</li>
<li>Moses, T., Wagner, L., Fleming, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4-mediated+Cox-2+expression+increases+intestinal+ischemia%2Freperfusion-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">TLR4-mediated Cox-2 expression increases intestinal ischemia/reperfusion-induced damage.</a> J Leukoc Biol. 86, 971-980 (2009).</li>
<li>Feinman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+mediates+pathogenic+inflammatory+responses+to+intestinal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">HIF-1 mediates pathogenic inflammatory responses to intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 299, G833-G843 (2010).</li>
<li>Lapchak, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelet+factor+4+in+local+and+remote+tissue+damage+in+a+mouse+model+of+mesenteric+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The role of platelet factor 4 in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusion injury.</a> PloS one. 7, e39934(2012).</li>
<li>Wen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+postconditioning+during+reperfusion+attenuates+intestinal+injury+and+mucosal+cell+apoptosis+by+inhibiting+JAK%2FSTAT+signaling+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Ischemic postconditioning during reperfusion attenuates intestinal injury and mucosal cell apoptosis by inhibiting JAK/STAT signaling activation.</a> Shock. 38, 411-419 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+the+ileal+microbiota+in+intestinal+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of the ileal microbiota in intestinal ischemia and reperfusion.</a> Shock. 39, 96-103 (2013).</li>
<li>Zou, L., Attuwaybi, B., Kone, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NF-kappa+B+inhibition+on+mesenteric+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of NF-kappa B inhibition on mesenteric ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G713-G721 (2003).</li>
<li>Hassoun, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-melanocyte-stimulating+hormone+protects+against+mesenteric+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alpha-melanocyte-stimulating hormone protects against mesenteric ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G1059-G1068 (2002).</li>
<li>Stallion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia%2Freperfusion%3A+a+clinically+relevant+model+of+intestinal+injury+yielding+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Ischemia/reperfusion: a clinically relevant model of intestinal injury yielding systemic inflammation.</a> J Pediatr Surg. 40, 470-477 (2005).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia?</a> Surgery. 121, 526-534 (1997).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Victoni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+remote+tissue+injury+upon+intestinal+ischemia+and+reperfusion+depends+on+the+TLR%2FMyD88+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local and remote tissue injury upon intestinal ischemia and reperfusion depends on the TLR/MyD88 signaling pathway.</a> Med Microbiol Immunol. 199, 35-42 (2010).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+mediates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+small+intestine+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice.</a> PloS one. 9, e110441(2014).</li>
<li>Pope, M. R., Fleming, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2+modulates+antibodies+required+for+intestinal+ischemia%2Freperfusion-induced+damage+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR2 modulates antibodies required for intestinal ischemia/reperfusion-induced damage and inflammation.</a> J. Immunol. 194, 1190-1198 (2015).</li>
<li>Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E. Jr, Guth, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+gut+blood+flow+and+mucosal+damage+in+response+to+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion.</a> Am J Physiol. 263, G301-G305 (1992).</li>
<li>Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+lesion+in+low-flow+states.+I.+A+morphological%2C+hemodynamic%2C+and+metabolic+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal.</a> Arch Surg. 101, 478-483 (1970).</li>
<li>Quaedackers, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+methods+for+grading+histologic+injury+following+ischemia%2Freperfusion+of+the+small+bowel%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel.</a> Transplant Proc. 32, 1307-1310 (2000).</li>
<li>Bianciardi, P., Scorza, R., Ghilardi, G., Samaja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxido-reductase+activity+in+ischemic+human+and+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxido-reductase activity in ischemic human and rat intestine.</a> Free Radic Res. 38, 919-925 (2004).</li>
<li>Yandza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+as+a+preclinical+model+for+intestinal+ischemia-reperfusion+and+transplantation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies.</a> J Surg Res. 178, 807-819 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突

肠道缺血-再灌注损伤小鼠模型的建立极大地促进了对组织损伤机制的理解，并有助于开发潜在的治疗策略以最大限度地减少组织损伤7,9,11,34。本方案的关键步骤包括微血管夹的准确定位、缺血时间的精确控制以及对缺血-再灌注损伤的正确组织学评估。
缺血持续时间对后续上皮损伤至关重要。通常，为在不引起实验小鼠发病或死亡的情况下诱导出可重复的缺血-再灌注（IR）损伤，需进行45-60分钟的缺血，随后进行2-3小时的再灌注。延长缺血时间可能导致上皮完全丧失并增加死亡率。例如，在空肠缺血的猪模型中，60分钟的阻塞导致绒毛上皮部分丧失，而120分钟的阻塞则导致绒毛上皮完全丧失35。值得注意的是，无菌小鼠和基因修饰小鼠可能对IR损伤表现出更高的敏感性，因此在预实验中可能需要优化缺血和再灌注的最佳时间。尽管通常在再灌注后2-3小时评估组织损伤，但分析肠道干细胞动员则需要更长时间（12小时）36。此外，共生微生物群的变化以及TLR/Nod介导的信号通路可显著影响IR损伤的结果4,8,37-39。
<p class...

肠道对血流中断极为敏感，这会导致缺血和上皮损伤。缺血后重新灌注可使组织重新获得氧气，但也可能进一步加重病理损伤。因此，肠道缺血-再灌注损伤与多种疾病相关，包括坏死性小肠结肠炎、小肠移植中的异体移植物排斥反应、腹主动脉瘤手术并发症、心肺旁路术以及炎症性肠病1,2。肠道缺血-再灌注损伤，尤其是急性肠系膜缺血，是一种危及生命的状况，可导致严重的发病率和死亡率3。
尽管对肠道缺血-再灌注（IR）损伤的理解尚不充分，但认为其与肠道微生物群的变化以及活性氧物质、炎症性细胞因子和趋化因子的产生有关1,4-6。这会导致先天性和适应性免疫机制的激活，从而促进炎症反应和组织损伤1,7,8。
动物模型对于理解缺血-再灌注（IR）损伤的机制至关重要，因为它们便于进行基因的获得功能和缺失功能实验。目前已开发出多种IR动物模型，包括完全性血管阻断、低流量缺血以及节段性血管阻断（详见近期一篇综合性综述9）。由肠系膜上动脉（SMA）完全性血管阻断引起的肠道缺血，是在大型动物和啮齿类动物中常用且操作简便的IR模型9-11。然而，肠道不同区域对损伤的易感性存在差异。此外，所使用的麻醉剂、镇痛剂、动脉阻断技术各不相同，且缺血损伤持续时间和恢复时间缺乏统一标准，导致不同研究中损伤程度不一，从而影响了人们对IR生物学机制的系统理解。表1总结了小鼠IR研究中的这些不一致性。采用较短缺血时间（30–45分钟）最大的局限在于，其恢复窗口难以观察到实验组与对照组之间的显著差异。上皮的轻度损伤可能在再灌注后1小时内即被修复，因此可能需要采用特异性的病理学指标才能检测到上皮重建的差异。相反，过长时间的缺血损伤（如100分钟）可能导致上皮完全剥脱，使上皮无法再生，从而增加死亡率并延长恢复时间。因此，本文详细描述了一种在小鼠中建立肠道IR的实验方法，该方法可产生可重复的损伤，且不导致动物死亡，旨在推动本领域内该技术的标准化。该肠道IR损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞与分子机制。

<table><tbody><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>替代产品：Braintree Scientific 加热垫</td></tr><tr><td>台式科研麻醉机</td><td>Vasco</td><td>UCAP 0001-0000171</td><td>替代产品：Parkland Scientific，V3000PS</td></tr><tr><td>鼻罩</td><td>Parkland Scientific</td><td>ARES500</td><td></td></tr><tr><td>废气吸收罐及替换滤芯</td><td>Parkland Scientific</td><td>80000, 80120</td><td></td></tr><tr><td>诱导室</td><td>Surgivet</td><td>V711802</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td>管制药品，请联系 IACUC</td></tr><tr><td>动物毛发剪&amp;nbsp;</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Oster Golden A5 078005-050-003</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Webster</td><td>8804604</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>McKesson</td><td>562766</td><td>管制药品，请联系 IACUC</td></tr><tr><td>Ketaset（盐酸氯胺酮）</td><td>Pfizer</td><td>NADA 45-290</td><td>管制药品，请联系 IACUC</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan Medical Products</td><td>806-WC</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>贝塔碘</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td>10% 聚维酮碘</td></tr><tr><td>无菌生理盐水溶液</td><td>Aspen</td><td>46066-807-60</td><td>使用前调节至室温</td></tr><tr><td>红外线啮齿类动物体温计</td><td>BIOSEB</td><td>BIO-IRB153</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹，70 g</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;</td><td>RS5424, RS5435</td><td>替代产品：WPI 14121，用于 SMA 阻断</td></tr><tr><td>微血管夹，40 g</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;</td><td>RS6472</td><td>替代产品：WPI 14120，用于侧支血管阻断</td></tr><tr><td>血管夹施加钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>14189</td><td>替代产品：Roboz #RS-5410 或&amp;nbsp; #RS-5440</td></tr><tr><td>Gill's 3 苏木精染液</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-390-17</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合钉，Reflex 9 mm</td><td>Cell Point Scientific</td><td>201-1000</td><td></td></tr><tr><td>自动缝合钉施用器</td><td>Beckton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>活检泡沫垫</td><td>Simport</td><td>M476-1</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Fisher Healthcare</td><td>15182701A</td><td>Histosette II 组合盖与底座</td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>眼科虹膜剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263-G SC</td><td>替代产品：Roboz RS6816</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>501219-G</td><td>替代产品：Roboz RS6814</td></tr><tr><td>敷料钳</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;</td><td>RS-5228, RS-8122</td><td>替代产品：World Precision Instruments 1519-G</td></tr><tr><td>肝素，无内毒素，300 USP 单位/瓶，50 mg</td><td>Sigma</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 伤口缝合钉拆除钳</td><td>Roboz Surgical&amp;nbsp;</td><td>RS-9263</td><td>替代产品：World Precision Instruments：500347</td></tr><tr><td>小鼠 C57BL/6J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Stock No 0664</td><td></td></tr><tr><td>Telfa 非粘连敷料，3 x 4，无菌</td><td>Coviden</td><td>1050</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 移液管</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td>使用移液管逐滴加入生理盐水</td></tr></tbody></table>

小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

肠缺血是一种危及生命的疾病，与多种临床状况相关，包括动脉粥样硬化、血栓形成、低血压、坏死性小肠结肠炎、肠移植、创伤和慢性炎症。肠缺血-再灌注（IR）损伤是急性肠系膜缺血的后果，由肠系膜血管血流不足引起，导致肠道损伤。缺血后的再灌注可能进一步加重肠道损伤。IR损伤的机制复杂且尚未完全阐明。因此，实验性小型动物模型对于理解IR损伤的病理生理机制以及开发新型治疗方法至关重要。
本文描述了一种小鼠急性肠道缺血-再灌注（IR）损伤模型，该模型可稳定地引起小肠损伤且不导致动物死亡。通过使用微血管夹暂时阻断肠系膜上动脉的末段及外周侧支循环60分钟，从而在回肠远端区域诱导缺血。损伤后进行1小时或2小时的再灌注，可通过组织学分析观察到稳定且可重复的肠道损伤。微血管夹放置位置的准确性对该操作至关重要。因此，视频片段提供了该技术详细的可视化分步说明。该肠道IR损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞与分子机制。

我们优化了小鼠回肠缺血-再灌注（IR）手术的实验方案，以获得可重复的IR诱导性损伤。本节展示了代表性结果。
图1展示了用于诱导回肠缺血的微血管夹位置示例。黑色箭头指示主夹闭夹的位置，用于阻断肠系膜上动脉一级分支。绿色箭头指示附加夹的位置，用于阻断来自侧支血管的血液供应。注意夹闭部位远端被阻断血管的尺寸增大，以及肠管缺血区域的颜色变化。在缺血结束时移除血管夹后，血管恢复血流并逐渐恢复至正常大小。
图2显示了一个组织盒的示例，其中包含从缺血1小时后又再灌注1小时的回肠对照区域和缺血区域制备的瑞士卷。包含一块脾组织以帮助在处理和染色过程中定位对照组和缺血-再灌注（IR）肠道组织。注意对照组织与缺血组织之间的颜色差异。
<p class="jove_content"...

本文详细描述了小鼠肠道缺血-再灌注的实验操作步骤，该方法可产生可重复的损伤且不导致动物死亡，旨在促进该技术在研究领域内的标准化。此肠道缺血-再灌注损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞和分子机制。

肠缺血是一种危及生命的疾病，与多种临床状况相关，包括动脉粥样硬化、血栓形成、……

本实验的总体目标是通过暂时阻断肠系膜上动脉的外周及终末侧支循环，从而在小鼠远端回肠区域建立可重复的肠道缺血-再灌注损伤模型。该方法有助于理解胃肠病学和免疫学领域中的一些基础研究方法，例如髌骨损伤与再生机制的研究。该技术的优势在于，任何经过培训的实验室人员均可完成操作。另一个优点是该手术操作本身不会导致小鼠死亡。按照文本方案中的说明准备手术区域。接着，使用手术剪进行3至5厘米的腹中线切口。 然后用生理盐水浸湿的无菌非粘附性敷料覆盖手术区域。分离盲肠和回肠，使用生理盐水浸湿的棉签暴露肠系膜上动脉。为便于放置夹子，用持针器轻轻提起肠管，并使用虹膜剪在预定夹闭位置的肠系膜上动脉两侧剪开肠系膜。将肠段保持在抬高的位置，用另一只手轻轻挤压一个高质量的70 G-Force微血管夹闭器，以打开其夹头。然后将血管夹放置在血管上，轻轻松开夹头，从而闭塞该血管。以相同方式再放置一至两个微血管夹，直至通过闭塞肠系膜上动脉的一级分支，形成一段长5至7厘米、邻近盲肠的缺血性回肠区域。现在将两个40 G-Force微血管夹置于肠管上，以阻断侧支血流并标记缺血肠段区域。待所有血管夹就位后，用37°C生理盐水浸湿的无菌细拭子轻轻擦拭手术区域，并在密切监测下维持缺血状态60分钟。若缺血操作正确，约30分钟后该区域颜色将变为酒红色，且血管夹远端的血管会明显扩张，表明血流阻断成功。缺血结束时，用10 µL Gill苏木精标记缺血区域的边缘，以便后续采集缺血组织及邻近的健康组织。缺血结束后，在夹闭区域滴加数滴生理盐水，使用血管夹施加器轻轻移除微血管夹。随后，用生理盐水浸湿的棉签轻轻将肠管推回腹腔内。移除非粘附性垫片，使用9毫米不锈钢伤口夹闭合腹壁和皮肤。将动物置于加热的清洁笼具中，维持所需的再灌注时间，并每30分钟检查小鼠一次以确认其状态稳定。再灌注结束后，处死小鼠，打开腹腔，采集缺血组织及邻近的健康正常组织。接下来，使用一个装有灌胃针头并充满生理盐水的 30 毫升注射器冲洗肠内容物，然后纵向剪开肠道。若需取肠道样本用于基因表达分析，保留一段 1.5 至 2 毫米长的纵向组织片段。对于组织学分析，使用一对镊子将肠道卷成瑞士卷状，并将肠道组织片夹在活检泡沫垫之间后放入包埋盒中。最后，将包埋盒放入10%中性缓冲甲醛溶液中，以固定缺血及健康肠组织。此处展示的是一个代表性组织包埋盒，其中包含由对照组及缺血1小时再灌注1小时后的回肠区域制备的瑞士卷（Swiss rolls）。请注意对照组织与缺血组织之间的颜色差异。还包含了一块脾组织，以有助于在处理和染色过程中定位对照组与缺血-再灌注肠道样本。在这些图像中，展示了对照组以及回肠缺血区域在经历一小时缺血，或一小时缺血后接两小时再灌注后的代表性苏木精-伊红染色结果。请注意，经过一小时缺血后观察到的上皮严重损伤，其特征表现为出血性VILI、上皮剥脱以及隐窝部分至完全

murine-model-of-intestinal-ischemia-reperfusion-injury

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

肠缺血再灌注损伤的小鼠模型

手术创伤会诱发炎症反应。已知细胞因子和内源性配体可调节缺血再灌注后的心肌梗死面积。本文介绍一种改良的闭胸小鼠缺血再灌注模型，通过悬挂重物的方式减少开胸手术的影响。...

一种小鼠闭胸式心肌缺血与再灌注模型

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。...

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

本方案将使读者能够成功建立节段性肠缺血的猪模型，并随后分离和培养肠干细胞，以研究损伤后上皮的修复过程。...

肠道干细胞的分离与培养：基于节段性小肠缺血猪模型的研究

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

本文介绍了一种外科手术方法，用于实现小鼠左前降支冠状动脉的永久性结扎。该模型对于研究心肌梗死的病理生理学及其伴随的生物学过程具有重要意义。...

采用左前降支冠状动脉永久性结扎的小鼠心肌梗死模型

我们详细描述了一种具有临床相关性的结直肠癌肝转移（CRLM）肿瘤模型，以及肝脏缺血再灌注（I/R）对肿瘤生长和转移的影响。该模型有助于更好地理解手术促进肝转移性生长的潜在机制。...

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

肾缺血-再灌注损伤与住院患者的高发病率和高死亡率相关。本文介绍一种简单且有效的小鼠单侧肾缺血-再灌注损伤模型，并系统概述肾脏中典型的病理学改变过程。...

一种有效的单侧肾缺血-再灌注损伤小鼠模型

本文介绍一种简单且可重复的方法，通过显微操作对小鼠左前降支冠状动脉进行精确结扎，从而诱导心肌梗死或心肌缺血-再灌注损伤。...

小鼠心肌梗死与心肌缺血-再灌注损伤的诱导

我们描述了如何在啮齿类动物中建立一种广泛应用的肠道缺血-再灌注损伤（IRI）外科模型。该操作包括阻断肠系膜上动脉，随后恢复血流。此模型对于研究兽医学和人类医学中肠道IRI的闭塞性病因具有重要价值。...

通过闭塞肠系膜上动脉建立肠道缺血-再灌注损伤的啮齿类动物模型

该方案概述了一种可行、可靠且可重复的小鼠左肺门阻断方法，可用于研究小鼠模型中的肺缺血-再灌注损伤。...

小鼠左侧肺门阻断型肺缺血再灌注损伤模型

本方案介绍了一种通过活体显微镜诱导肠系膜缺血-再灌注损伤并可视化观察肠系膜微静脉中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。通过阻断肠系膜上动脉血流1小时后进行再灌注，可直接定量分析白细胞黏附和NETosis过程。...

通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

学习建立小鼠肠缺血再灌注损伤模型，通过暂时夹闭肠系膜上动脉分支诱导可重复的肠道损伤。该方法安全无致死性，适用于胃肠病学和免疫学研究中损伤与再生机制的探索。

小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

探索更多视频