豌豆蚜胚胎免疫染色关键条件的确定：提高组织通透性与降低背景染色

本免疫染色方案的总体目标是检测蚜虫胚胎中的蛋白质表达。本方案确定了若干关键条件，可增强组织通透性并降低背景染色，这两者长期以来一直是蚜虫胚胎组织染色中的难题。该技术的主要优势在于，它提供了抗体有效渗透和降低背景染色的具体条件，而这些条件通常在标准免疫染色方案中并未详细描述。

我们最初在研究豌豆蚜（一种用于基因组学和环境研究的昆虫模型）中生殖细胞如何被确定时，提出了这一测量方法的想法。该豌豆蚜（A. pisum）的实验室品系最初采自中国台湾中部，并已在寄主植物上饲养了超过300代。

为了促进萌发，将寄主植物的种子在室温下用自来水浸泡三至五天，每天更换一次新鲜水。将十粒正在萌发的种子种植于一个装有土壤的小花盆中，在培养室中培养，光照周期为16小时光照、8小时黑暗，温度保持在20摄氏度。

开始生长约10天后，植株高度通常超过8厘米。将每盆植株置于1升的玻璃烧杯内，用画笔将成年蚜虫转移到植株上。然后，用透气材料（如纱布）密封烧杯，防止蚜虫逃逸。

将蚜虫置于生长室中培养，光照周期为16小时光照、8小时黑暗，温度为20摄氏度，每天对每盆植物浇水一次。在点样板的一个孔中加入约500微升的4%多聚甲醛。将点样板置于体视显微镜下，使用低倍放大，将一只成年蚜虫浸入多聚甲醛中以进行解剖。

用一对镊子夹住头部和腹部，剪开腹部背侧的角质层，将卵巢从腹腔中分离出来。随后，将三对卵巢置于含有1毫升多聚甲醛的1.5毫升离心管中，在室温下固定20分钟，并在混合仪上轻轻振荡。用玻璃移液器弃去固定液，再用PBST洗涤卵巢三次，每次10分钟，并轻轻振荡。

为处理卵巢，首先将卵巢与蛋白酶K在轻微振荡条件下孵育10分钟，以增强胚胎组织的通透性。孵育结束后，弃去蛋白酶K溶液，随后用700 µL甘氨酸溶液清洗卵巢，每次5分钟，共清洗三次。接着用PBST清洗卵巢两次，每次10分钟。

用固定缓冲液在室温下轻轻振荡固定卵巢 15 分钟。为抑制内源性过氧化物酶活性，使用含不同浓度甲醇（体积比分别为 1:3、1:1 和 3:1）的 0.2% PBST 溶液依次对卵巢进行脱水处理，随后再将卵巢置于 100% 甲醇中，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。然后，按照文本方案中的说明依次对卵巢进行再水化处理。

对于1.5毫升离心管中的三对卵巢，200微升是样品封闭和抗体染色的最小体积。将卵巢与1× DIG-B封闭液在室温下轻度振荡孵育4小时，或在4摄氏度下过夜。孵育结束后，弃去上清液，并更换为新鲜的含有一抗（按适当稀释比例）的1× DIG-B封闭液。

将卵巢在室温下染色四小时，或在4摄氏度下避光振荡过夜。按照文本方案中所述清洗卵巢后，弃去上清液，加入含有适当稀释比例的二抗的新鲜1×DIG-B封闭液，其余染色步骤同前。进行免疫荧光染色时，需在避光条件下操作，因为二抗对光敏感。

蚜虫胚胎的厚度随发育阶段而变化，因此需调整封片策略以适应早期、中期和晚期胚胎。用塑料移液器将卵巢连同封片介质转移至细胞载样盘中，在体视显微镜下以低倍镜观察样品。

使用昆虫针切除与侧输卵管相关的胼胝体，然后用移液管将分离的卵泡管转移至空的玻璃孔中。用封片介质补足终体积至 50 到 100 微升。接着，用玻璃移液管将卵泡管转移至载玻片上。

使用昆虫针解剖卵室。对于发育阶段超过六期的胚胎，建议分离卵室；对于末端丝和前两个卵室，分离为可选步骤。

使用玻璃滴管将解剖后的卵室转移到干净的载玻片上。对于发育处于第1至第10阶段的胚胎，缓慢将盖玻片覆盖在解剖后的末端丝或卵室上，以避免产生气泡。对于发育处于第11至第18阶段的胚胎，可将卵室置于载玻片上，采用单侧盖玻片桥装置，再在样本上方放置另一片盖玻片。

对于发育阶段超过19期的胚胎，将卵室置于载玻片上，使用双面盖玻片桥固定，并在样品上方放置另一盖玻片。接着，向顶部盖玻片下方空间填充封片介质，以防止样品干燥。轻轻滚动顶部盖玻片，以获得适合观察的正确方位。

最后，在进行图像分析之前，按照文本方案所述，用指甲油密封盖玻片边缘，包括桥接盖玻片的边缘。图中所示为从雌性成虫解剖获得的一对卵巢。一个卵管由一个生殖囊、一至两个O区以及五至七个胚胎组成，所有这些结构均以流水线方式容纳于卵室之中。

建议在多聚甲醛固定后，用浓度为每毫升一微克的蛋白酶K溶液消化卵巢10分钟。染色结果显示，经蛋白酶K消化的胚胎信号强度显著增强。与使用正常山羊血清和牛血清白蛋白相比，将胚胎在基于DIG的缓冲液套装中的封闭液中孵育可减少更多的背景染色。

过氧化物酶的内源性活性也可能导致高背景染色。这些研究表明，将蚜虫胚胎浸入甲醇中比使用过氧化氢处理胚胎能更有效地抑制过氧化物酶活性。本研究揭示的关键条件可应用于生殖细胞和体细胞中的信号检测。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何成功地对蚜虫胚胎进行免疫染色，包括增强信号强度及降低背景染色。在实施该实验过程中，务必轻柔操作每一个胚胎，以获得形态良好的胚胎样本。

请注意，使用多聚甲醛和DAPI时可能存在极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取防护措施，例如佩戴手套。完成本实验步骤后，还可进一步开展原位杂交等其他实验，以回答更多科学问题，例如信使RNA是否与其蛋白质产物共同定位于胚胎细胞中。该方法有助于解答昆虫环境生物学领域中的关键问题，例如生殖细胞如何被确定，以及在蚜虫不同的生殖阶段中卵细胞是如何被决定的。