临界条件在免疫染色豌豆蚜虫胚胎鉴定:增加组织通透性和降低背景染色

该免疫染色方案的总体目标是检测蚜虫胚胎中的蛋白质表达。确定了增加组织通透性和减少背景染色的关键条件，这两者都是蚜虫胚胎组织染色时长期存在的问题。该技术的主要优点是它为抗体的有效渗透和减少背景染色提供了特定的条件，这在标准免疫染色方案中通常没有描述。

当我们研究如何在豌豆蚜虫各种昆虫模型中指定生殖细胞，用于基因组学和环境研究时，我们第一次有了这个测量方法的想法。豌豆蚜的实验室菌株 A. pisum 最初是在台湾中部采集的，并在寄主植物上饲养了 300 多代。

要发芽，请将寄主植物的种子在室温下浸泡在自来水中 3 到 5 天。每天重新装满淡水一次。在 20 摄氏度的光照 16 小时、黑暗 8 小时的光照时间、8 小时的黑暗光照下，在生长室中种植 10 颗发芽的种子。

生长开始后约 10 天，植物的高度通常超过 8 厘米。将每盆植物放在一升玻璃烧杯中，并使用画笔将成年蚜虫转移到植物上。然后，用透气盖（如纱布网）密封烧杯，以防止蚜虫逃脱。

在 20 摄氏度的光照 16 小时、黑暗 8 小时的光周期下，在生长室中孵育蚜虫，每天给每盆植物浇水一次。用大约 500 微升 4% 的多聚甲醛填充点板的一个孔。将板放在立体显微镜下以低倍率放置，并将成虫浸入多聚甲醛中进行解剖。

用一把镊子夹住头部和腹部，切开腹部背侧角质层，将卵巢从腹腔拖出，解剖卵巢。接下来，将三对卵巢固定在含有 1 毫升多聚甲醛的 1.5 毫升试管中，在室温下固定 20 分钟，同时在混合器上轻轻摇晃。用玻璃滴管丢弃固定缓冲液，然后用 PBST 洗涤卵巢 3 次，每次 10 分钟，轻轻摇晃。

要治疗卵巢，首先将它们与蛋白酶 K 孵育 10 分钟，轻轻摇晃以增加胚胎组织的通透性。孵育后，弃去蛋白酶 K 溶液，然后用 700 μL 甘氨酸洗涤卵巢 3 次，持续 5 分钟。接下来，用 PBST 清洗卵巢两次，持续 10 分钟。

在室温下用固定缓冲液再次固定卵巢 15 分钟，同时轻轻摇晃。为了抑制体内过氧化物酶活性，用 0.2% PBST 中不同百分比的甲醇连续脱水卵巢，体积比为 1 比 3、1 比 1 和 3：1，然后在室温下用 100% 甲醇进一步孵育卵巢 1 小时，轻轻摇晃。然后，按照文本协议中的说明连续补液卵巢。

对于 1.5 毫升试管中的三对卵巢，200 μL 是样品封闭和抗体染色的最小体积。将卵巢与 1x DIG-B 封闭溶液在室温下孵育 4 小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜，同时轻轻摇晃。孵育后，弃去上清液，用新鲜的 1x DIG-B 封闭溶液替换，其中含有适当稀释比例的一抗。

在室温下对卵巢染色 4 小时，或在 4 摄氏度下孵育过夜，轻微摇晃。按照文本方案中的说明洗涤卵巢后，弃去上清液，用含有适当稀释比例的二抗的新鲜 1x DIG-B 封闭溶液替换，并像以前一样对卵巢进行染色。对于免疫荧光染色，请在黑暗中进行染色，因为二抗对光敏感。

蚜虫胚胎的厚度因发育阶段而异。因此，对安装策略进行了修改，以适应早期、中期和晚期胚胎。用塑料滴管将卵巢连同封固剂转移到细胞托盘中，并在立体显微镜下以低放大倍率观察样品。

使用昆虫针切下与侧输卵管相关的老茧，然后用滴管将分离的卵巢转移到空玻璃孔中。使用封固剂将最终体积补足至 50 至 100 μL 之间。然后，用玻璃滴管将卵巢转移到载玻片上。

用昆虫针解剖卵室。对于发育第六阶段以上的胚胎，建议分离蛋室。对于 germaria 和前两个蛋室，分离是可选的。

使用玻璃滴管将解剖的卵室重新定位到干净的载玻片上。对于发育第 1 至第 10 阶段的胚胎，慢慢地将盖玻片放在解剖的 germaria 或卵室上，以避免气泡。或者，对于发育第 11 至 18 阶段的胚胎，将卵室安装在带有单侧盖滑桥的载玻片上，并在样品顶部放置另一个盖玻片。

对于发育 19 期以上的胚胎，将卵室安装在带有双面盖玻片桥的载玻片上，并在样品顶部放置另一个盖玻片。接下来，用封固剂填充顶盖衬玻片下方的空间，以避免样品干燥。轻轻滚动顶盖玻片以获得正确的观察方向。

最后，在进行图像分析之前，用指甲油密封盖玻片的边缘，包括桥盖玻片，如文本协议中所述。这里展示的是一对从雌性成体解剖的卵巢。卵圆由一个天竺葵、1 到 2 个 O 位点和 5 到 7 个胚胎组成，所有这些胚胎都以流水线方式容纳在卵室内。

多聚甲醛固定后，强烈建议在浓度为 1 μg/mL 的蛋白酶 K 溶液中消化卵巢 10 分钟。染色结果表明，Poteinase K 消化的胚胎中的信号强度显着增加。与正常山羊血清和牛血清白蛋白中的胚胎相比，在基于 DIG 的缓冲液组的封闭溶液中孵育胚胎可减少更多的背景染色。

过氧化物酶的内源性活性也会导致高背景染色。这些研究表明，将蚜虫胚胎浸入甲醇中比用过氧化氢处理胚胎更有效地抑制过氧化物酶活性。本研究揭示的关键条件可用于生殖细胞和体细胞的信号检测。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。看完这个视频，你应该对如何对蚜虫胚胎进行成功的免疫染色有一个很好的了解，包括提高信号强度和减少背景染色。在尝试此程序时，重要的是要记住轻轻地作每个胚胎以获得良好的胚胎形状。

不要忘记，使用多聚甲醛和 DAPI 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如手套。在此程序之后，可以执行其他措施，如原位杂交，以回答其他问题，例如 messanger RNA 是否与其蛋白质产物一起定位在胚胎细胞中。这种方法可以帮助回答昆虫环境生物学领域的关键问题，例如如何指定生殖细胞，以及如何在蚜虫的不同生殖阶段确定卵细胞。