巨蟹座的建立源于人类传统的骨肉瘤细胞培养

本文的总体目标是从从人类骨肉瘤获得的有限细胞系中分离癌症干细胞。这项工作的主要优点是清楚地向肿瘤学领域的其他人展示如何在体外分离癌症干细胞。然后，这些细胞可用于研究针对骨肉瘤和其他实体瘤的疗法。

一般来说，如果刚接触这个问题的人不知道如何分离肉瘤菌落，他们会很挣扎。这一点的视觉演示至关重要，因为隔离步骤难以实现和理解。我们第一次想到这种技术是在我们读到球体形成的文章时。

由 Gypsum 和合作者描述。演示该程序的博士生 Gaia Palmini 博士和我实验室的技术员 Roberto Zonefrati 博士。首先，准备所有必要的培养基。

消化缓冲液和该程序所需的其他溶液。接下来，通过从确认的穿刺或手术活检中分离骨肉瘤，建立骨肉瘤有限细胞系。并按照随附的文本文章中的描述对获得的细胞进行传代培养。

一旦骨肉瘤细胞培养物建立，板接近汇合。通过抽吸去除培养基，并胰蛋白酶消化细胞以将其从板中释放出来。将细胞转移到新试管中，轻轻地上下移液细胞悬液，以分散任何细胞团块。

接下来，收集 10 微升细胞悬液，并将其转移到血细胞计数器室中。将血细胞计数器室置于相差显微镜下，并计算悬浮液中细胞的浓度。然后，将 280， 000 个细胞添加到 35 毫升含有甲基纤维素的肌膜生长培养基中，并使用移液管轻轻混合溶液，以分散任何团块。

将 5 毫升细胞混合物转移到 6 孔超低附着板的每个孔中。铺板后，使用倒置显微镜观察细胞的外观以及它们是否被很好地分离。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育细胞。

每三天向每个孔中加入新鲜的 β FGF 和 EGF 醇化物，以刷新生长因子的浓度。通过在显微镜下观察 7 、 14 、 20 、 21 和 28 天的细胞来检查肌球测定的进度。当您观察到大型黑色石球的存在时，它们都聚集在井的中心，停止培养并开始荒凉过程。

当需要分离肌球时，使用无菌的 1， 000 微升移液器将含有肌球的培养基转移到带有无菌膜过滤器支架的注射器中。完全去除含有肌层的培养基后，向孔中加入 5 毫升生长培养基，并冲洗以确保。并收集所有剩余的球体。

然后，使用显微镜确认是否恢复了所有肌球。如果没有，请再次清洗井，直到球体收集完成。接下来，通过膜过滤器支架通过重力过滤悬浮液，以免损坏球体并确保没有肉层穿过过滤器。

在此过程中，使用无菌玻璃牧场移液器轻轻去除任何气泡。过滤完所有肌膜后，直接向注射器中加入 10 毫升生长培养基，让其无压力过滤，以确保去除单个细胞，从而清洗过滤装置。一旦石球的悬浮液被过滤，就必须丢弃液体的过滤器，并认真注意缠结在网状过滤器中的石球的回收。

此时，取出过滤器单元的一部分，将其从注射器中取出。并将其放入 100 毫米培养皿中。使用一对无菌镊子从膜过滤器支架上取下网状过滤器。

并将过滤器转移到一个新的 60 毫米培养皿中。然后，轻轻摇晃净过滤器。同时加入 5 毫升生长培养基，以便从膜的缠结中释放肌膜。

接下来，将膜放入井中，并通过显微镜观察确认膜中没有更多缠结的球体。再次清洗膜，然后在显微镜下重新检查膜，如果膜中仍有球体缠结。当膜中没有更多球体时，将它们在生长培养基中孵育，使肌球生长成单层。

监测从肌球获得的骨肉瘤癌症干细胞的生长。直到细胞在 60 毫米培养皿中达到约 90% 汇合。除了本文中发现的众多常设方案外，随附的文本方案中还详细介绍了评估分化能力、ALDH 活性、流式测定、免疫荧光和 RTPCR 分析的方法。

骨肉瘤样本通过针吸或手术切除获得。如果处理得当，原代培养物大约需要一个月的时间才能在 100 毫米培养皿中汇合。扩增后，将细胞接种在 6 孔超低附着板中，开始肌球测定。

该板将细胞保持在悬浮状态，并防止基质附着。7 天后，观察到几个被单细胞包围的小球形菌落。28 天后，观察到几个大型肌层。

一旦分离出球形集落，就可以通过将干细胞放置在正常的附着板上，从单个肌球中扩增出干细胞样癌细胞。免疫荧光染色显示间充质干细胞样表型，因为扩增的细胞对 CD44 的 CD105 呈阳性，对 Stro-1 呈中度阳性。RTPCR 也通过三个胚胎干细胞标志基因的表达积极显示胚胎干细胞表型。

Nanog，10 月 3 日/4 日和 Sox2。以及 CD133 基因，骨肉瘤癌症干细胞的标志物。我们在本视频中展示的详细分离技术将为其他研究人员研究癌症干细胞铺平道路，向他们展示如何理解和重现球体形成测定的最关键步骤。

这些改良的检测是分离癌症干细胞和研究其生物学的好技术。这种物质，加上额外的适应，也可用于从其他有限癌细胞系中分离癌症干细胞。通过实体瘤活检获得。

总之，从几种类型的肿瘤中分离癌症干细胞将允许研究它们的生物学。最终目标是寻找分子靶点并开发针对特定细胞亚群的非常特异性的抗癌疗法。