Name: 巨蟹座的建立源于人类传统的骨肉瘤细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习从人骨肉瘤活检样本中分离肿瘤干细胞的方法，掌握球体形成实验技术。该方案通过28天培养获得肉瘤球体，为开发骨肉瘤靶向治疗提供可靠的细胞模型和研究基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由 ITT（托斯卡纳肿瘤研究所）2010 年资助项目支持。

<ol><li>Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+sarcoma%3A+a+study+of+the+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure.</a> Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).</li>
<li>Gatta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+cancer+survival+trends+in+Europe%3A+a+EUROCARE+Working+Group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood cancer survival trends in Europe: a EUROCARE Working Group study.</a> J. Clin. Oncol. 23 (16), 3742-3751 (2005).</li>
<li>Olstad, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+in+human+osteosarcoma+demonstrated+by+enriched+mRNAs+isolated+by+directional+tag+PCR+subtraction+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity in human osteosarcoma demonstrated by enriched mRNAs isolated by directional tag PCR subtraction cloning.</a> Anticancer. Res. 23 (3B), 2201-2216 (2003).</li>
<li>Geller, D. S., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+review+of+diagnosis%2C+management%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Adv+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a review of diagnosis, management, and treatment strategies.</a> Clin Adv Hematol Oncol. 8 (10), 705-718 (2010).</li>
<li>Tang, N., Song, W. X., Luo, J., Haydon, R. C., He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+development+and+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma development and stem cell differentiation.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 466 (9), 2114-2130 (2008).</li>
<li>Kempf-Bielack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+relapse+after+combined+modality+therapy%3A+an+analysis+of+unselected+patients+in+the+Cooperative+Osteosarcoma+Study+Group+%28COSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma relapse after combined modality therapy: an analysis of unselected patients in the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS).</a> J. Clin. Oncol. 23 (3), 559-568 (2005).</li>
<li>Meyers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+randomized%2C+prospective+trial+of+the+addition+of+ifosfamide+and%2For+muramyl+tripeptide+to+cisplatin%2C+doxorubicin%2C+and+high-dose+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high-dose methotrexate.</a> J. Clin. Oncol. 23 (9), 2004-2011 (2005).</li>
<li>Gorlick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+childhood+osteogenic+sarcoma+and+potential+targets+for+therapeutic+development%3A+meeting+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary.</a> Clin. Cancer Res. 9 (15), 5442-5453 (2003).</li>
<li>Hayden, J. B., Hoang, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+basic+science+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: basic science and clinical implications.</a> Orthop. Clin. North Am. 37 (1), 1-7 (2006).</li>
<li>Thomas, D., Kansara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+in+osteogenic+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation.</a> J. Cell. Biochem. 98 (4), 757-769 (2006).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+retinoblastoma+gene+in+primary+osteosarcomas+and+other+bone+and+soft-tissue+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcomas and other bone and soft-tissue tumors.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 270 (270), 271-277 (1991).</li>
<li>Chou, A. J., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+resistance+in+osteosarcoma%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions.</a> Expert. Rev. Anticancer Ther. 6 (7), 1075-1085 (2006).</li>
<li>Arndt, C. A. S., Crist, W. M. Common musculoskeletal tumorsof childhood and adolescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArndt%2C+CAS+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341 (5), 342-352 (1999).</li>
<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Treat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: state of the art.</a> Cancer. Treat. Rev. 32 (6), 423-436 (2006).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+for+patients+with+nonmetastatic+osteosarcoma+of+the+extremity+treated+at+the+istituto+ortopedico+rizzoli+according+to+the+istituto+ortopedico+rizzoli%2Fosteosarcoma-2+protocol%3A+an+updated+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol: an updated report.</a> J. Clin. Oncol. 18 (24), 4016-4027 (2000).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells-perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells.</a> Cancer. Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+accumulating+evidence+and+unresolved+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions.</a> Nat. Rev. Cancer. 8 (10), 755-768 (2008).</li>
<li>Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of cancer stem cells.</a> Semin. Cancer Biol. 17 (3), 204-213 (2007).</li>
<li>Rubio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+human+adult+stem+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Spontaneous human adult stem cell transformation.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3035-3039 (2005).</li>
<li>Burns, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+heterogeneity+in+cancer+stem+cells+evolved+from+long-term+cultures+of+telomerase-immortalized+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3126-3135 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+etiology+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the etiology and treatment of cancer.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16 (1), 60-64 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+transgenes+encoding+components+of+the+Wnt+signaling+pathway+preferentially+induce+mammary+cancers+from+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 100 (26), 15853-15858 (2003).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+cancer%3A+dedifferentiation+or+stem+cell+maturation+arrest%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of cancer: dedifferentiation or stem cell maturation arrest?</a> Environ Health Perspect. 101 (Suppl 5), 15-26 (1993).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24 (4), 372-376 (2000).</li>
<li>Hochedlinger, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+reprogramming+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear reprogramming and pluripotency.</a> Nature. 441 (7097), 1061-1067 (2006).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells and drug resistance.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Ma, S., Lee, T. K., Zheng, B. J., Chan, K. W., Guan, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+HCC+cancer+stem+cells+confer+chemoresistance+by+preferential+expression+of+the+Akt%2FPKB+survival+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway.</a> Oncogene. 27 (12), 1749-1758 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+isolated+from+mesenchymal+neoplasms+have+tumor+initiating+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential.</a> Cancer. Res. 67 (17), 8216-8222 (2007).</li>
<li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem. Cell. Rev. 7 (2), 292-306 (2011).</li>
<li>Awad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+ALDH+activity+identifies+chemotherapy-resistant+Ewing%27s+sarcoma+stem+cells+that+retain+sensitivity+to+EWS-FLI1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High ALDH activity identifies chemotherapy-resistant Ewing's sarcoma stem cells that retain sensitivity to EWS-FLI1 inhibition.</a> PLoS One. 5 (11), e13943(2010).</li>
<li>Fujii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+stem-like+cell+populations+with+drug+resistance+in+human+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines.</a> Int. J. Oncol. 34 (5), 1381-1386 (2009).</li>
<li>Di Fiore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+characterization+of+the+human+osteosarcoma+3AB-OS+cancer+stem+cell+line%3A+a+possible+model+for+studying+osteosarcoma+origin+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness.</a> J. Cell. Physiol. 228 (6), 1189-1201 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonicprogenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonicprogenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gibbs, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+cells+in+bone+sarcomas%3A+implications+for+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis.</a> Neoplasia. 7 (11), 967-976 (2005).</li>
<li>Beccari, N., Mazzi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeccari%2C+N+%22Manuale+di+tecnica+microscopic.+Casa+Editrice+Dr.+Francesco+Vallardi+Societ%C3%A0+Editrice+Libraria%22">Manuale di tecnica microscopic. Casa Editrice Dr. Francesco Vallardi Società Editrice Libraria</a>. , 99-100 (1966).</li>
<li>Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Mosca, J. D., Moorman, M., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+of+cultures+of+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.</a> J. Cell. Physiol. 176 (1), 57-66 (1998).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+bone+sarcomas+contain+CD133%2B+cancer+stem+cells+displaying+high+tumorigenicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo.</a> FASEB J. 25 (6), 2022-2030 (2011).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Martins-Neves, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+an+enriched+cancer+stem-like+cell+population+in+a+human+osteosarcoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line.</a> BMC Cancer. 12 (1), 139(2012).</li>
<li>Tang, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+osteosarcoma+stem+cells+by+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enrichment of osteosarcoma stem cells by chemotherapy.</a> Chin. J. Cancer. 30 (6), 426-432 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

CSC 具有多种特性，使其能够在肿瘤组织中被识别出来。基于这些特性，例如由于 ATP 结合盒多药耐药外排转运蛋白的过表达28, 32, 33，或由于解毒酶（如 ALDH）表达上调32而获得对细胞毒性化疗药物的耐药性，以及特定表面标志物（如 CD133、CD44、CD34、CD90 等）的表达30, 34, 35, 41，目前已开发出多种分离 CSC 的不同方法42-44。其中一种技术是成球实验，该方法基于 CSC 在非贴壁条件下生长的能力。
组织干细胞和肿瘤干细胞形成球体的能力最早由Reynolds等人在鉴定神经干细胞的研究中描述。37随后，Gibbs 等人38 利用这些研究，我们开始从实体瘤中分离肿瘤干细胞（CSCs），特别是从骨肉瘤中分离。我们决定采用吉布斯（Gibbs）所展示的成球实验方法 等 从常规骨肉瘤活检获得的OSA细胞系中分离出肿瘤干细胞（CSCs）。我们对原始方法进行了改进，以优化本实验的结果，并提高其在其他癌细胞系中的可重复性。在建立成球实验时，我们验证了每孔接种40,000个细胞是确保实验初期细胞保持分离状态的有效做法。这一操作至关重要，可避免球形克隆来源于细胞聚集，而非单个CSC在非贴壁条件下特有且独有的增殖成球能力。该能力正是本实验的一个关键核心环节。
我们还证实，为了获得良好的球体形成率，每3天&#160;更换一次生长因子即可，无需如原始方法所述每天更换。在本研究中，我们还建立并详细描述了一种良好的方法，用于分离在非黏附条件下培养时形成的球状克隆。该步骤在本实验中至关重要，因为必须尽可能完整地分离出每个孔中形成的所有球体，同时避免对其造成损伤。此外，仅分离球体而避免混入单个细胞也非常重要，因为单个细胞可能在整个实验过程中保持悬浮状态。为克服这些关键问题，我们开发了一种特殊的分离方法，如上所述，该方法在肿瘤干细胞（CSC）分离中取得了良好的效果。显然，并非所有形成的球体都能被完全回收，但损失比例极低。实际上，我们还可以在球体长大后（约形成&#160;100–200个细胞）使用孔径为40 µm的滤网进行分离。
这种分离可阻止类球体形成，但允许单细胞、甲基纤维素残留物以及最小的类球体通过滤膜。该去除步骤按照方案中所述，通过充分过滤完成。
此外，通过40 µm的筛网筛选出最大的球形克隆，同时丢失较小的球形克隆，可富集具有最强球形克隆形成能力且干性更强的肿瘤干细胞（CSCs）。上述所有改进均旨在优化实验方法，帮助研究CSC的研究人员理解并重现球形克隆形成实验原始方法中最关键的步骤。
关于这些研究中的 体外 分离CSCs的方法，本研究旨在展示这种改良的成球实验如何成为从OSA细胞系中分离CSCs的有效方法。对原始方法的改进以及所描述的详细分离技术提高了其效率。在较短时间内即可获得足量的CSCs，并可用于多项实验。因此，能够快速验证干细胞样表型，特别是研究表征OS-CSCs的双重干细胞样表型。因此，这种改良的实验方法可能是分离CSCs并研究其生物学特性的有效技术。未来，该方法经过进一步优化后，也可能用于从其他通过罕见实体瘤活检获得的有限癌细胞系中分离CSCs。
从骨肉瘤（OS）等罕见实体瘤中分离出肿瘤干细胞（CSCs）的可能性，不仅有助于推进对该特定癌症的研究，还可拓展至对不同类型癌症的研究，以开发更优的分离方法，并为未来研究这一重要细胞亚群的生物学特性奠定基础。因此，正如本研究所做的那样，通过深入研究CSC的生物学特性来改进其分离方法至关重要，最终目标是发现分子靶点，并开发出针对这一特定细胞亚群的高度特异性抗癌疗法——该细胞亚群很可能负责维持原发肿瘤、导致肿瘤复发以及在多个器官中引发转移。对CSC生物学特性的研究对于寻找能够有效治疗某些预后极差癌症的疗法也具有重要意义，例如在新辅助治疗后生存率仍然很低的骨肉瘤（OS）。

肉瘤是一类起源于胚胎中胚层的异质性罕见恶性结缔组织肿瘤1。其不同类型包括骨肉瘤和软组织肉瘤。骨肉瘤是一组相对少见的原发性肿瘤，包含多个亚型，其中骨肉瘤（OS）是骨最常见的原发性肿瘤之一。OS是一种间叶源性恶性肿瘤，具有显著的临床、组织学和分子异质性2, 3。遗憾的是，OS主要发生于儿童和年轻成人4, 5，占儿童期骨肉瘤常见组织学亚型的60%6, 7。OS通常累及骨骼中骨生长迅速的区域（例如，长骨的干骺端）。在组织学上不同的OS亚型中，传统型OS（也称为髓内型或中心型OS）恶性程度高，占比达80%8。这80%包括60%的传统成骨细胞型OS、10%的软骨母细胞型OS和10%的成纤维细胞型OS6, 8-10。其他OS亚型包括未分化型、血管扩张型、富含巨细胞型和小细胞型OS。尽管在OS的治疗中联合手术与化疗已取得进展，但预后仍然不佳，无转移患者的长期生存率仅为65-70%11, 12。远处复发常表现为肺转移，较少情况下为远处骨转移或局部复发13。转移灶通常对常规治疗耐药，这也是在诊断时已存在转移的患者10年无病生存率仅为约30%的原因14, 15。
与正常组织一样，肿瘤组织由多种不同类型的细胞异质性组成。肿瘤内的细胞似乎对应着不同发育阶段的细胞。在任何正常组织中，都存在一群具有自我更新能力的细胞亚群，从而为组织稳态提供前体细胞和成熟细胞。类似地，癌症也由处于不同发育阶段、具有不同增殖能力和致瘤潜能的异质性细胞群体构成。其中一部分癌细胞被称为癌症干细胞（Cancer stem Cells, CSCs），它们是一类能够自我维持的细胞亚群，具有独特的自我更新能力，并可维持肿瘤的恶性潜能，进而产生构成肿瘤主体的各类细胞谱系16。20世纪90年代，关于急性髓系白血病的研究首次提供了癌症干细胞亚群存在的有力证据17, 18。此后，CSCs已从大量实体瘤中被成功分离出来，成为癌症研究中最受关注的课题之一19。CSCs可能起源于正常干细胞，因某些基因发生突变而导致正常干细胞转化为癌变细胞20-23。多个转化性突变以及与微环境的相互作用，也可能促使&#160;健康的前体细胞和成熟细胞获得典型的CSC特征，即自我更新能力和无限增殖潜能。关于这一转化过程存在多种假说：健康的前体细胞、健康的成熟细胞以及癌细胞均可能去分化为干细胞，通过激活与自我更新相关的基因而获得类似干细胞的表型24-28。尽管近年来已有诸多研究，但CSCs的起源至今仍未完全明确。
肿瘤干细胞（CSCs）的一个显著特征是其对多模式治疗（包括手术联合多种药物化疗）具有抵抗能力。近期研究表明，CSCs还可能获得对细胞毒性化疗药物的耐药性。这种耐药性的可能机制包括ATP结合盒（ABC）多药耐药转运蛋白的过表达。即，&#160;MDR1 和 BCRP1）、化疗药物代谢酶（如醛脱氢酶1（ALDH1））的过表达，和/或细胞周期动力学的改变30-33所有上述概念的直接结果是，只有当肿瘤干细胞亚群被完全清除时，癌症治疗才会有效；而即使有单个肿瘤干细胞存活，也可能导致局部复发或远处转移。
在人类肉瘤34，尤其是骨肉瘤35，或其他任何骨与软组织肿瘤中发现肿瘤干细胞（CSCs），具有重要的临床意义，因为它可能解释为何许多治疗在初期看似有效，但患者后期仍会复发。因此，未来对抗传统骨肉瘤的希望在于，基于对OS-CSCs亚群的分子特征分析及CSC生物学研究，开发出针对OS-CSCs&#160;的新型特异性靶向治疗策略。
1992年，Reynolds 及其同事在研究成年哺乳动物大脑中是否存在某些干细胞亚群时，开发出一种方法，用于分离疑似具有干细胞特性的细胞36, 37。该方法基于这些细胞在非黏附条件下培养时能够形成球形克隆的特殊能力。2005年，Gibbs 及其同事采用类似技术研究了骨肉瘤中的一群具有干细胞特性的细胞亚群38。为了从不同类型传统骨肉瘤的原代细胞培养物中分离和鉴定骨肉瘤干细胞（OS-CSCs），我们决定将该技术应用于骨肉瘤细胞系。
本文介绍了球体形成实验的一种改良方法，称为“&#34;肉瘤球实验&#34;”，可用于从来源于常规骨肉瘤（OS）患者活检组织的有限原代细胞系中分离骨肉瘤干细胞（OS-CSCs）。同时，我们还描述了用于验证该实验所分离细胞系干样肿瘤干细胞（CSC）表型的全部技术：1）检测多能性胚胎干细胞（ESCs）特征性基因及CSC标志物CD133基因的表达水平；2）集落形成单位（CFU）实验；3）在适当的诱导分化条件下，评估这些细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能；4）通过免疫荧光染色和流式细胞术分析间充质干细胞（MSCs）表面标志物（i.e.,&#160;CD44、CD105和Stro-1）的表达；5）评估这些细胞的ALDH活性。

<table><tbody><tr><td>含钙杜氏磷酸盐缓冲液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; （DPBS）</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液&amp;nbsp; 无钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; （DPBS）</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>溶剂：缓冲液，pH 7.4。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Ham/F-12 营养混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>溶剂：超纯 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 储备液浓度：粉末</td></tr><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：5 mg/mL</td></tr><tr><td>&amp;beta;二钠盐五水合甘油磷酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：1 M</td></tr><tr><td>胰岛素，人重组</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>溶剂：0.1 M NaOH。储备液浓度：10 mM</td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>溶剂：DMSO。储备液浓度：500 mM</td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>溶剂：DMSO。储备液浓度：200 mM</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>溶剂：DMSO。储备液浓度：&amp;nbsp; 1 mM / 100 &amp;micro;M. 用液氮保存以维持生物活性</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>南美洲胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（PEN-STREP）10,000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>溶剂：超纯 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 储存液浓度：2%</td></tr><tr><td>腐胺二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>溶剂：超纯 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 储备液浓度：粉末</td></tr><tr><td>脱铁转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：25 mg/mL</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EFGF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>溶剂：DPBS，pH 7.4。储存浓度：10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子 人</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>溶剂：DPBS + 0.2% BSA。储存浓度：25 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>亚硒酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：30 mM</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>溶剂：ETOH。储存浓度：10 mM</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>溶剂：超纯 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 储备液浓度：粉末</td></tr><tr><td>油红O</td><td>ICN Biochemicals</td><td>155984</td><td>溶剂：2-丙醇。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>萘酚AS-MX磷酸二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>溶剂：DMSO。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>Fast Blue BB 盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>溶剂：Tris HCl，pH 9.0。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB 盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>溶剂：Tris HCl，pH 9.1。储存浓度：粉末</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>溶剂：DPBS。储备浓度：2%</td></tr><tr><td>茜素红S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>溶剂：超纯 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 储备液浓度：粉末</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>默克</td><td>11869</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：0.2%。危险——仅可在化学通风橱中使用</td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>默克</td><td>2315</td><td>溶剂：DPBS。储备浓度：200 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>默克</td><td>109634</td><td>危险——仅可在化学通风橱中使用</td></tr><tr><td>Ab-CD105&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （小鼠单克隆抗体 [SN6] 针对 CD105（FITC））</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>液体。应用：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 流式细胞术（Flow Cyt）</td></tr><tr><td>Ab-CD44&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （小鼠单克隆）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; [F10-44-2] 至 CD44（PE/Cy7）&amp;reg;) )</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>液体。应用：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 流式细胞术（Flow Cyt）</td></tr><tr><td>Ab-CD45&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （小鼠单克隆）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; [MEM-28] 至 CD45（PerCP）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>液体。应用：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 流式细胞术（Flow Cyt）</td></tr><tr><td>Ab-CD105&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （人CD105纯化抗体）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>Ab-CD44&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （抗CD44抗体）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （小鼠抗STRO-1）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 流式细胞术（Flow Cyt）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （抗兔IgG（Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG（H+L）））</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>FITC 抗小鼠 Ig（FITC-兔抗小鼠 IgG（H+L））</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 流式细胞术（Flow Cyt）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>溶剂：DPBS。储存浓度：冻干粉。应用：免疫荧光染色（IF）</td></tr><tr><td>AutoMACS&amp;trade;MACS分离缓冲液</td><td>Miltenyi</td><td>130,091,221</td><td>液态。4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>QIAzol&amp;reg;裂解试剂</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>危险——仅可在化学通风橱内使用</td></tr><tr><td>QUANTITECT&amp;reg;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 逆转录试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>液体。危险——仅可在化学通风橱中使用</td></tr><tr><td>层流罩</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>技术设备&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 别墅</td><td>模型&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; DYNAMICA</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜 LSM 5109 Meta&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>iCycler PCR 扩增仪&amp;nbsp;</td><td>BIORAD</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CyFlow&amp;reg;太空&amp;nbsp;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>倒置显微镜 Axiovert 200M&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Nalgene</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Original Pipet-Aid</td><td>pbiBrand</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>EPPENDORF</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴斯德玻璃吸管</td><td>SIGMA</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3&amp;trade;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>珀金埃尔默</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>锥形管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （15 和 50 mL）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>352096（适用于15 mL）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 352070（50 mL装）</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板</td><td>BD FALCON</td><td>353047</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6孔透明平底超低吸附多孔板</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血清移液管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （5 和 10 mL）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>357543（5 mL装）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 357551（10 mL装）</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>注射器（5 mL）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿 100×20 mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>R&amp;ouml;hren 管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (3.5 mL，55×12 mm，PS)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>55,484</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿 60×15 mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353004</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL 冻存管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 cm 细胞培养瓶&amp;sup2;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353014</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尼龙网滤膜，亲水性</td><td>MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>斯温内克斯滤器支架</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>佩里镊子&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>柳叶刀</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td><td>_&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>邓斯匀浆器</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

目前针对骨肉瘤（OS）的治疗手段虽已取得进展，延长了癌症患者的生命，但一旦发生转移，患者的五年生存率仍然较低。癌症干细胞（CSC）理论认为，肿瘤内部存在一类具有干细胞特性的细胞亚群，能够维持肿瘤的持续生长并抵抗多种药物的化疗作用。因此，为了推动靶向治疗的发展，彻底清除这一特定细胞亚群并降低患者的发病率与死亡率，亟需更深入地理解OS的生物学特性与发病机制。分离CSC、建立CSC的细胞培养体系并研究其生物学行为，是增进对OS生物学与发病机制认知的重要步骤。目前已有多种方法可实现从OS活检组织中建立人源性OS-CSCs，其中包括在非黏附条件下构建三维干细胞培养体系的技术。在此类条件下，CSC能够通过子代干细胞形成悬浮的球形克隆，这些克隆被称为&#34;细胞球&#34;。本文介绍一种从OS活检组织获得的传统OS原代细胞培养物中建立CSC培养体系的方法，并详细描述分离与鉴定CSC所需的多个传代步骤。

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。

目前针对骨肉瘤（OS）的治疗手段虽已取得进展，延长了癌症患者的生命，但五年生存率仍然……

本研究的主要目标是从人骨肉瘤来源的有限细胞系中分离出肿瘤干细胞。本工作的主要优势在于能够向肿瘤学领域的研究人员清晰展示如何在体外分离肿瘤干细胞。这些细胞随后可用于针对骨肉瘤及其他实体瘤的治疗研究。通常，刚接触该领域的新手如果不知道如何分离肉瘤集落，将会遇到困难。直观地展示这一步骤至关重要，因为分离操作本身难以实现且不易理解。我们最初是在阅读了关于成球形成实验的文献后，产生了这一技术的想法。由Gypsum及其合作者描述。演示该实验操作的将是我的实验室的博士生Gaia Palmini博士和技师Roberto Zonefrati博士。首先，准备好所有必需的培养基。消化缓冲液以及其他实验步骤所需的溶液。接下来，通过从经确诊的穿刺活检或手术活检样本中分离骨肉瘤细胞，建立有限传代的骨肉瘤细胞系，并按照随附文本文章中所述方法对所获得的细胞进行传代培养。建立骨肉瘤细胞培养后，当培养板中的细胞接近汇合时，吸除培养基，用胰蛋白酶消化细胞以使其从培养板上脱落。将细胞转移至新的离心管中，并轻轻吹打细胞悬液，以分散任何细胞团块。接下来，取10 µL细胞悬液，转移至血细胞计数板腔室中。将血细胞计数板置于相差显微镜下，计算悬液中的细胞浓度。然后，将280,000个细胞加入含有甲基纤维素的35 mL肌球囊生长培养基中，使用移液器轻轻混匀溶液，以分散任何细胞团块。将五毫升细胞混合液转移至每个六孔超低吸附培养板的孔中。接种后，使用倒置显微镜观察细胞形态及其分离情况。将细胞置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育。每三天向每个孔中添加新鲜的β-FGF和EGF醇化物，以更新生长因子的浓度。在第7、14、20、21和28天，通过显微镜观察细胞，监测肉瘤球实验的进展。当观察到大量黑色肉瘤球聚集于孔中央时，停止培养，开始裂解过程。当需要分离肉瘤球时，使用无菌的1,000微升移液器将含有肉瘤球的培养基转移至带有无菌膜过滤器的注射器中。完全移除含有肉瘤球的培养基后，向孔中加入5毫升生长培养基，进行冲洗以确保彻底，并收集任何残留的球体。然后，使用显微镜确认是否已回收全部肉孢子。若未完全回收，则再次洗涤孔板，直至所有孢子完全收集。接下来，通过重力作用将悬液过滤至膜过滤器装置中，以避免损伤孢子，并确保无肉孢子穿透滤膜。在此过程中，使用无菌玻璃巴斯德吸管轻轻操作以去除任何气泡。当所有肉瘤球完成过滤后，向注射器中直接加入十毫升培养基，使其在无压力条件下自然过滤，以清洗过滤装置，确保清除单个细胞。肉瘤球悬液过滤完成后，需弃去滤液，特别注意回收滞留在滤网中的肉瘤球。此时，拆开滤器单元，将其从注射器上取下，并放入一个 100 毫米的培养皿中。使用无菌的细头镊子从滤膜过滤器架上取下网状滤膜。将滤膜转移至新的60毫米培养皿中，然后加入5毫升生长培养基，轻轻振荡以清洗网状滤膜，使肉孢子从膜的缠结中释放出来。接下来，将膜放入孔板中，通过显微镜观察确认膜上不再有缠绕的球状体。再次清洗膜，若显微镜下仍发现有球状体缠绕，则需重新检查。当膜上无任何残留球状体时，将膜置于生长培养基中孵育，使肉瘤球生长为单层细胞。监测从肉瘤球中获得的骨肉瘤肿瘤干细胞的生长情况，直至细胞在60毫米培养皿中达到约90%的汇合度。除本文提供的多种标准操作流程外，伴随的文字版实验方案中还详细包含了用于评估细胞分化能力、ALDH活性、流式细胞术、免疫荧光以及RT-PCR分析的方法。骨肉瘤样本通过穿刺抽吸或手术切片获取。若处理得当，原代培养物大约需要一个月时间才能在100毫米的培养皿中达到汇合状态。扩增后，将细胞接种于6孔超低吸附培养板中，以开始进行肉瘤球体实验。该培养板可使细胞保持悬浮状态，并防止细胞贴壁附着。培养7天后，可见多个由单个细胞包围的小型球状克隆；培养28天后，则可见多个较大的类球状结构（sarcospheres）。一旦分离出球形克隆，可将单个肉瘤球接种于普通贴壁培养板上，从而扩增具有干细胞特性的癌细胞。免疫荧光染色结果显示，扩增后的细胞呈CD44和CD105阳性，Stro-1呈中等程度阳性，表现出类似间充质干细胞的表型。此外，RT-PCR也证实了胚胎干细胞表型的存在，检测到三个胚胎干细胞标志基因的表达。Nanog、Oct3/4 和 Sox2，以及骨肉瘤肿瘤干细胞标志物 CD133 基因。本视频中展示的详细分离技术将为其他研究人员研究肿瘤干细胞提供基础，帮助他们理解并重复肿瘤球形成实验中最关键的步骤。这种改良的检测方法是分离肿瘤干细胞并研究其生物学特性的良好技术。经过进一步改进后，该方法也可用于从其他有限的肿瘤细胞系中分离肿瘤干细胞，这些细胞系可由实体瘤活检获得。总之，从多种肿瘤中分离出肿瘤干细胞，将有助于研究其生物学特性，最终目标是发现分子靶点，并开发出针对特定细胞亚群的高特异性抗癌疗法。

establishment-cancer-stem-cell-cultures-from-human-conventional

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

巨蟹座的建立源于人类传统的骨肉瘤细胞培养

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。...

从人前列腺癌样本中分离癌干细胞

由于具有化疗耐药性，癌症干细胞（CSCs）被认为与肿瘤复发有关。 我们已优化了一种从卵巢癌细胞系中筛选和扩增癌症干细胞的实验方案。通过使用化疗药物顺铂处理细胞，并在促进干细胞生长的培养基中进行培养， 可富集获得非贴壁生长的癌症干细胞群体。...

人源细胞系中化疗耐药性卵巢癌干细胞的富集

体外成球实验常用于鉴定肿瘤干细胞。本文比较了基于单细胞与多细胞的成球实验方法。基于单细胞的实验方法或添加甲基纤维素的方法虽然更为耗时，但结果更为准确；而在液体培养基中进行的基于多细胞的成球实验则可能受到细胞密度的显著影响。...

利用多细胞和单细胞成球实验评估人卵巢癌细胞中的干细胞特性

以下实验方案重点介绍建立患者来源的软组织肉瘤（STS）原代培养的方法。该模型有助于我们更深入地理解这些罕见恶性肿瘤的分子基础和药物反应特征，并可为后续改善STS治疗策略的研究提供起点。...

建立患者来源软组织肉瘤的原代培养

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。...

从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

利用定量相位成像技术对静息态和活跃态癌细胞表型进行表征。将细胞增殖、迁移和形态学检测整合于一种简便的方法中进行分析。...

一种基于延时、无标记、定量相位成像的休眠与活跃人癌细胞研究

本文介绍了一种从李-佛美尼综合征（Li-Fraumeni Syndrome, LFS）患者来源的成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）将iPSCs分化为成骨细胞，并建立疾病模型的方法 体内 使用LFS患者来源的成骨细胞研究肿瘤发生。...

利用Li-Fraumeni综合征患者来源的诱导性多能干细胞建立骨肉瘤模型

本方法的目的是通过成球实验，结合功能分析以及流式细胞术和蛋白质印迹法进行表型鉴定，以可靠地鉴定癌细胞系和原代人肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSC）。...

从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

学习从人骨肉瘤活检样本中分离肿瘤干细胞的方法，掌握球体形成实验技术。该方案通过28天培养获得肉瘤球体，为开发骨肉瘤靶向治疗提供可靠的细胞模型和研究基础。

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

探索更多视频