Name: 隔离和脂肪干细胞分化的猪从皮下脂肪组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习从猪皮下脂肪组织中分离脂肪干细胞并进行多向分化诱导的方法。该技术可高效获取基质血管细胞，用于研究脂肪细胞分化机制及再生医学应用。

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作者谨向实验室所有成员致以诚挚感谢，感谢他们在本实验方案中提供的深入讨论与技术支援。本实验室的研究工作得到了中国台湾科技部（MOST 103-2314-B-002-126 和 MOST 102-2313-B-002-026-MY3）以及中国台湾国立大学顶尖大学计划（104R350144）项目资助的支持。

注意：本方法已在本实验室先前报道的研究中建立并使用14-17，并随着时间推移进行了修改。当前操作使用一只7至9日龄仔猪的平均约60 g猪皮下脂肪组织，在6孔组织培养板上进行接种。除非另有说明，所有操作均在室温（RT）下进行。所有动物实验均获得中国台湾大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 准备消化液
<ol>
	<li>从颈部和背部获取仔猪（7至9日龄）的皮下脂肪组织，每头仔猪取40至80 g，具体取决于猪的体型。此处使用一头猪获得的60 g皮下脂肪组织。</li>
	<li>配制消化液：称取共54,000单位的胶原酶II粉末，溶于90 ml杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，适用于60 g脂肪）中，置于100 ml血清瓶内（每1.5 ml DMEM每克脂肪含900单位胶原酶）。</li>
	<li>将消化液在摇床（100 rpm）上轻轻振荡至少15分钟以充分溶解，随后通过0.22 µm滤器过滤灭菌。4 °C保存备用。</li>
</ol>
2. 从猪体内分离皮下脂肪组织
<ol>
	<li>使用前将所有器械、玻璃器皿和塑料器皿灭菌，并将所有培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>通过电击晕并放血处死仔猪，或采用符合当地 IACUC 法规的方法处死。在仔猪处死后立即小心进行解剖。</li>
	<li>将仔猪置于清洁的手术台上（背部朝上，腹部朝下）。剃除仔猪背部的毛发，从颈部至尾部以及两侧至中线的所有毛发均需去除。</li>
	<li>用 7.5% 聚维酮碘对猪背部皮肤进行三次擦洗（每次使用新的独立擦洗材料），然后让碘溶液在皮肤表面停留约 10 分钟。</li>
	<li>用多次喷洒的 70% 乙醇去除聚维酮碘。使用含 70% 乙醇的纱布或纸巾单向擦拭皮肤，重复操作直至无明显聚维酮碘颜色残留。</li>
	<li>用镊子夹起脂肪层和皮肤，再用手术刀沿皮下脂肪层与肌肉连接处分离猪背部脂肪层及其附着的皮肤层。</li>
	<li>立即将带有附着皮肤的皮下脂肪层浸入含有无血清 DMEM 的无菌烧杯（200 ml）中。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒盛有脂肪层的烧杯外壁，并将其放入层流细胞培养罩内。在罩内放置一张大尺寸（40 cm × 30 cm）的无菌三层覆盖箔。（使用三层结构以确保持续完整性。）</li>
	<li>将组织皮肤面朝下放置在覆盖箔上。</li>
	<li>使用镊子和剪刀修剪脂肪组织上残留的肌肉组织，避免肌肉组织污染。</li>
	<li>用手术刀或剪刀将脂肪切割成约 7 cm × 7 cm 的方形小块。将这些脂肪块放入另一新的无菌烧杯（200 ml）中，烧杯内含无血清 DMEM。</li>
	<li>在覆盖箔上安装定制的切片夹具，并装配碳钢切片刀（图 1）。从烧杯中取出一块脂肪组织，放置于切片装置上（皮肤层在上，脂肪层在下）。</li>
	<li>将皮下脂肪层切成约 1 mm 厚的薄片。切割时应尽可能贴近皮肤层，但避免切到皮肤。</li>
	<li>用剪刀将切好的脂肪组织尽可能剪碎。</li>
	<li>向含有胶原酶的过滤消化液中加入已剪碎的脂肪组织，置于 250 ml 锥形瓶或血清瓶中（每 90 ml DMEM 含 54,000 单位胶原酶/60 g 脂肪）。</li>
	<li>将锥形瓶置于 37 °C 摇床中，以 45 rpm 振荡孵育 90 分钟，使胶原酶充分消化组织。 
	注意：每 15 至 30 分钟检查一次，避免过度消化。当消化液呈匀浆状且无明显组织团块时，表明消化完成。</li>
	<li>加入等体积（与消化液体积相等）的含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12 培养基，以终止胶原酶消化反应。</li>
</ol>
<img alt="组装夹具的各个部件平铺展示；包含金属部件和螺丝，表明组装过程。" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 用于分离猪脂肪间充质干细胞（pADSC）的定制切片装置。 从猪背部皮下脂肪组织中分离出的脂肪组织包含脂肪层及其附着的皮肤层。需要使用切片装置将脂肪层切成约1 mm厚的薄片，同时避免过度切割至皮肤层。从左到右：切片固定架、切片垫、碳钢切片刀片和螺丝。组装时，将切片刀片插入切片固定架与切片垫之间。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 从基质-血管组分中收集pADSC
<ol>
	<li>将含有消化后脂肪组织的消化液通过一层纱布过滤至洁净的灭菌 250 ml 锥形烧瓶或 250 ml 血清瓶中。使用镊子按压纱布中央，引导并协助消化物通过。</li>
	<li>用镊子将纱布中的液体挤出并扭转，以完成过滤。</li>
	<li>将消化液分装至四个 50 ml 圆锥形离心管中（每管约 40 ml 培养基）。</li>
	<li>在 700 × g 条件下离心 10 分钟，收集基质-血管细胞沉淀。</li>
	<li>倾去上清液，避免扰动沉淀，以去除含有成熟脂肪细胞的大部分上层脂肪。每管加入 10 ml DMEM，通过移液和轻轻振荡重悬沉淀进行洗涤。</li>
	<li>在 700 × g 条件下离心 6 分钟，倾去上清液。</li>
	<li>每管加入 10 ml ACK 裂解缓冲液，通过移液重悬沉淀。室温静置 7 分钟（5 至 10 分钟），以裂解基质-血管组分中的红细胞。</li>
	<li>加入等体积 DMEM（10 ml），通过轻轻振荡终止反应，然后在 700 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>倾去上清液，每管加入 10 ml DMEM，通过反复移液重悬沉淀，并在 700 × g 条件下离心 6 分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>收集并合并含有细胞的 DMEM（共 40 ml DMEM，来自 4 个管，代表 60 g 脂肪），通过 100 µm 滤网过滤至新的 50 ml 圆锥形离心管中。</li>
	<li>轻轻反复移液数次以充分混匀，取 20 µl 含细胞的培养基与 180 µl 0.4% 台盼蓝溶液（1:10 稀释）混合，加入新的 1.5 ml Eppendorf 管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，然后以 60,000 个细胞/cm2 的密度将 pADSC 接种至含有 DMEM/F12、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（P/S/A）的培养基中，接种于适当尺寸的培养皿或板中。通常将 pADSC 接种于 6 孔组织培养板中用于脂肪细胞或成骨细胞分化；将 pADSC 接种于 10 cm 培养皿中用于干细胞表面标志物染色或软骨细胞分化。</li>
	<li>将培养板或培养皿置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育，以促进细胞贴壁。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术鉴定 pADSC 的干细胞表面标志物
<ol>
	<li>24 小时后，完全移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 10 cm 培养皿两次，然后加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 下消化 5 分钟以收集细胞。</li>
	<li>用等体积（1 ml）的培养基中和胰蛋白酶-EDTA，将细胞收集至新的 15 ml 圆锥管中，随后在 400 × g 条件下离心 7 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用 3 ml 冰冷的 FCS 清洗缓冲液（含 10% FBS 的 PBS）重悬细胞沉淀，通过移液混匀并以 400 × g 离心 7 分钟，重复洗涤两次。</li>
	<li>将细胞重悬、计数，并用冰冷的 FCS 清洗缓冲液调整 pADSC 至 106 个细胞/ml。将细胞（每管 100 µl）分装至多个新的 15 ml 圆锥管中，每管分别加入针对以下抗原的藻红蛋白标记抗体：CD4a-PE、CD29-PE、CD31-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、MHC I-PE 或 MHC II-PE，于 4 °C 孵育 30 分钟进行直接染色。通过在 10 ml FCS 清洗缓冲液中清洗细胞两次，并每次以 400 × g 离心 7 分钟，终止反应。</li>
	<li>根据制造商说明书及我们先前发表的研究18，将细胞重悬于固定缓冲液（含 0.01% FBS 和 1% 甲醛的 PBS）中进行固定，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. pADSC向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化
<ol>
	<li>pADSC向脂肪细胞的分化
	<ol>
		<li>配制脂肪细胞诱导培养基和脂肪细胞维持培养基
		<ol>
			<li>对于脂肪细胞诱导培养基，配制 1 L 无血清 DMEM/F12（含 1% P/S/A 抗生素），其中包含以下成分：1 ml 胰岛素原液（10 mg/ml HEPES 缓冲液，pH 8），终浓度 = 10 µg/ml; 1 µl T3 储存液（3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸，DMSO 中 1 mM），终浓度 = 1 nM； 200 µl 转铁蛋白储备液（50 mg/ml 双蒸 H2O），终浓度 = 10 µg/ml; 100 µl 地塞米松储备液（10 mM，溶于乙醇），终浓度 = 1 µM; 100 µl 罗格列酮储备液（DMSO 中 10 mM），终浓度 = 1 µM.</li>
			<li>配制脂肪细胞维持培养基，成分与诱导培养基相同，但 omit dexamethasone。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>脂肪细胞分化过程 
		注意：将pADSC接种于6孔板后，pADSC将在72小时内达到汇合。
		<ol>
			<li>3天后，完全移除培养基，然后向每个孔中加入3 ml脂肪细胞诱导培养基。将培养板放回培养箱中。 这是分化的第0天。</li>
			<li>3天后，完全移除脂肪细胞诱导培养基，每隔三天更换3 ml脂肪细胞维持培养基。约9天时，脂肪细胞将完成终末分化。采用本方案，超过90%的脂肪细胞可良好分化。这些脂肪细胞可用于油红O染色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pADSC向成骨细胞的分化
	<ol>
		<li>制备成骨细胞诱导培养基：完全培养基（DMEM/F12，含10% FBS和1% P/S/A）中加入 1 µM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和 50 µg/ml 抗坏血酸-2-磷酸</li>
		<li>骨细胞分化过程 
		注意：将pADSC接种于6孔板后，pADSC将在72小时内达到融合状态。
		<ol>
			<li>3 天后，完全移除培养基，向每个孔中加入 3 ml 成骨细胞诱导培养基。将培养板放回 37 °C 培养箱。此为分化第0天。</li>
			<li>每三天更换一次成骨细胞诱导培养基。培养14天后将形成成熟的成骨细胞。这些成骨游戏副本可用于茜素红S染色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pADSC向软骨细胞的分化
	<ol>
		<li>制备软骨细胞诱导培养基：含1% FBS的αMEM， 6.25 µg/ml 胰岛素, 50 µg/ml 抗坏血酸-2-磷酸盐，以及10 ng/ml 转化生长因子-β1。</li>
		<li>软骨细胞分化过程
		<ol>
			<li>在10 cm培养皿中接种pADSC培养24 h后，完全移除培养基，并用PBS洗涤培养皿两次。</li>
			<li>用1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化pADSC 5分钟，然后加入1 ml培养基中和。收集细胞，计数，并在15 ml离心管中调整pADSC密度至2.5 × 105 每管细胞数。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
			<li>离心后（400 × g，7 分钟），弃去上清液，注意不要扰动沉淀，向 15 ml 离心管中加入 1 ml 软骨细胞诱导培养基。将离心管放回 37 °C 培养箱。此为分化第0天。</li>
			<li>每三天更换一次软骨细胞诱导培养基，无需移除底部的细胞。成熟的软骨细胞将在约14天内形成。这些软骨细胞可用于甲苯胺蓝O染色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 分化脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的染色
<ol>
	<li>分化脂肪细胞的油红O染色
	<ol>
		<li>第9天，从含有分化脂肪细胞的6孔培养板中移除脂肪细胞维持培养基，然后用PBS洗涤培养板两次。[在后续步骤中，加入足量指定试剂以覆盖6孔板的每个孔。]</li>
		<li>用10%甲醛溶液固定脂肪细胞至少10分钟。</li>
		<li>移除10%甲醛溶液，然后用双蒸水洗涤培养板两次。</li>
		<li>两次洗涤后，向培养板中加入100%丙二醇，静置1分钟。</li>
		<li>移除100%丙二醇，然后向培养板中加入油红O溶液（0.5%溶于丙二醇）。在摇床上轻柔振荡（100 rpm）至少10分钟。</li>
		<li>移除油红O溶液，然后替换为60%丙二醇。静置1分钟。</li>
		<li>移除60%丙二醇，然后用双蒸水洗涤培养板两次。</li>
		<li>替换为10%甲醛溶液。脂肪细胞内染色的脂滴即可用于光学显微镜观察。</li>
		<li>细胞内油红O定量（以下为可选步骤）：显微镜观察后，移除10%甲醛溶液，并用双蒸水洗涤培养板两次。</li>
		<li>彻底排干培养板中的液体，向6孔板中加入500 µl异丙醇。</li>
		<li>将异丙醇置于6孔板中，在温和摇床（100 rpm）上静置至少10分钟，以溶解油红O染料。</li>
		<li>吸出含油红O的异丙醇，转移至96孔板中。使用510 nm波长进行分光光度测定，定量提取的油红O。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分化成骨细胞的茜素红S染色
	<ol>
		<li>第14天，从含有分化成骨细胞的6孔板中移除成骨细胞诱导培养基，并用PBS洗涤培养板两次。[在后续步骤中，加入足量指定试剂以覆盖6孔板的每个孔。]</li>
		<li>用10%甲醛溶液固定成骨细胞至少10分钟。</li>
		<li>从每个孔中移除10%甲醛溶液，并用双蒸水洗涤培养板两次。</li>
		<li>两次洗涤后，向6孔板中加入2%茜素红S溶液（pH = 4.1–4.3），在温和摇床（100 rpm）上静置至少15分钟。</li>
		<li>移除茜素红S溶液，然后用双蒸水洗涤培养板两次。</li>
		<li>替换为10%甲醛溶液。成骨细胞即可用于光学显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分化软骨细胞的甲苯胺蓝O染色
	<ol>
		<li>第14天，从15 ml圆底离心管中吸除软骨细胞诱导培养基，注意不要移除管底已沉淀的分化软骨细胞，并用PBS洗涤管壁两次。[在后续步骤中，加入足量指定试剂以覆盖管底的软骨细胞或切片上的组织。]</li>
		<li>用10%甲醛溶液固定软骨细胞至少10分钟。</li>
		<li>从每根离心管中移除10%甲醛溶液，并用双蒸水洗涤管壁两次。</li>
		<li>两次洗涤后，将细胞沉淀包埋于OCT包埋剂中，并使用冷冻切片机以5 µm厚度进行切片。</li>
		<li>用甲苯胺蓝O溶液（0.1%，pH 4.1）对冷冻切片进行染色。</li>
		<li>移除甲苯胺蓝O溶液，然后用双蒸水洗涤切片两次。 
		注意：载玻片上的软骨细胞即可用于光学显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种可靠的细胞体系，用于在pADSC原代细胞培养中研究脂肪组织的发育。与其他永生化细胞系相比，该方法可便捷地分离获得大量高质量的成体间充质干细胞，适用于研究脂肪细胞分化过程或其他与动物发育相关的间充质谱系分化。 体内该方案中的关键改良步骤是采用7至9日龄的仔猪来分离pADSC，因为与成年猪相比，仔猪更易于操作，且该做法与其他物种类似。19,20，随着猪的年龄增长，pADSC 的产量和多向分化潜能会下降21.
潜在的干细胞来源包括胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）以及出生后的成体干细胞。被归类为成体多能干细胞的ADSC存在一定的局限性，即成体干细胞在分化为不同谱系方面的多能性相较于ESC或iPSC相对有限。然而，由于ESC的获取涉及伦理问题，而iPSC具有潜在的致瘤性，这些因素限制了ESC和iPSC的应用22,23。因此，许多研究者将关注点转向成体干细胞，并致力于提高其多能性。长期以来被广泛研究的成体间充质干细胞（MSC）最常见的来源是骨髓来源的间充质干细胞24。然而，骨髓采集被认为是一种相对疼痛的操作过程。另一个问题是，骨髓中干细胞的产量有限。骨髓穿刺液每毫升平均可获得约6 × 106个有核细胞，而MSC仅占所有有核细胞的0.001%至0.01%。在综合考虑这些缺点之后，ADSC被认为是一种更为微创且易于获取多能干细胞的来源25,26。
间充质干细胞（ADSC）在再生医学中的应用受限，很大程度上取决于细胞的产量和质量。因此，本方案中采用猪来分离ADSC的意义在于能够获得大量高质量的成体干细胞。猪作为一种有用的动物模型，其器官大小以及许多生理和生化特征与人类具有可比性，因而能够很好地代表人类27-30。从商业公司获取人源ADSC（hADSC）成本较高，且在多数情况下这些细胞已被操作、传代或冻存。由于伦理问题，获取人类临床样本相对困难，且ADSC的产量有限。经过胶原酶消化后，我们每克脂肪组织可获得约6 × 105个hADSC。以100克女性乳腺脂肪组织（平均取样量）计算，总共可收获6 × 107个细胞。而使用单只小鼠时，产量则更为有限。从一只成年FVB小鼠（6–8周龄）双侧后肢皮下腹股沟脂肪组织共0.4克中，仅能收获约1 × 106个细胞。然而，从一只7至9日龄的个体猪的背部脂肪库中获取60克皮下脂肪组织，即可轻松收获总计2 × 108个细胞。本方案所获得的猪源ADSC（pADSC）具有完全的间充质样多向分化潜能，并表达适当的间充质干细胞标志物。因此，pADSC是一种在不牺牲干细胞质量的前提下获取大量成体干细胞的理想来源。
pADSC 的应用不仅限于解析脂肪细胞分化过程，包括脂肪生成和脂质生成。近年来，ADSC 已成为再生医学领域中一种广受欢迎的干细胞来源22,31,32。与其他干细胞来源相比，ADSC 具有易于获取且数量丰富的独特优势，其强大的多向分化潜能已被证实是干细胞治疗和组织工程中极具前景的细胞来源22,33,34。由于脂肪组织易于获取，ADSC 成为获得多能前体细胞侵入性最小的方法之一。近期，我们将 pADSC 诱导分化为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞簇，表明 pADSC 的分化潜能不仅局限于中胚层谱系（未发表数据）。其他研究也已证明，ADSC 可被诱导分化为源自其他胚层的多种细胞类型，例如内胚层来源的肝细胞（来自 hADSC35 或 pADSC36）以及外胚层来源的神经元（来自 hADSC37 或 pADSC38）。因此，可通过引导 pADSC 进行不同方向的分化以获得特定谱系细胞，从而用于高通量药物或生物材料筛选。综上所述，本实验方案所获得的 pADSC 在再生医学研究中的干细胞治疗与组织移植方面具有广阔的应用前景。

肥胖症在美国约30%的人群中存在，其体重指数超过30，已成为一种普遍的全球性现象1。肥胖容易引发多种相关并发症，包括心血管疾病、2型糖尿病和癌症2-4。因此，应对肥胖是当前重要的公共卫生优先事项。肥胖表现为脂肪组织的大规模扩张，主要归因于现代社会中过度饮食和久坐不动的生活方式。因此，解析脂肪生成和脂质生成的转录调控机制，可能为治疗肥胖或糖尿病提供新的希望5。
3T3-L1、3T3-F442A 及其他小鼠脂肪细胞生成细胞系已被用于研究脂肪组织发育过程中的脂肪细胞生成或脂质生成。然而，这些细胞系之间的调控机制存在一些差异 体外 和动物 体内6. 间质-血管细胞组分中的原代脂肪源性干细胞（ADSC）可直接从白色脂肪组织中分离，并可诱导其分化。ADSC向脂肪细胞的分化过程很可能重现了脂肪组织发育过程中脂肪生成和脂质合成的生理过程 体内7.
猪是研究脂肪组织发育过程中脂肪生成和脂质生成的合适动物模型。我们之前开展的猪相关研究8-10 证明多不饱和脂肪酸（PUFA）可抑制猪肝脏和脂肪组织中固醇调节元件结合转录因子1c（SREBP1c）的表达，SREBP1c是一种已知可调控脂肪生成相关脂肪酸合酶转录的重要转录因子。猪SREBP1c的表达受PUFA下调 体内 和 体外 与其他物种（如人类和小鼠）相似11-13这些猪的研究 体外 主要存在于由猪脂肪源性干细胞（pADSC）分化而来的成熟脂肪细胞中。因此，这种pADSC的原代细胞培养体系可作为研究脂肪组织发育或其他干细胞应用的可靠细胞系统。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸钠</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含 HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-两性霉素 B (P/S/A) 溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>用于抗生素和抗真菌剂使用</td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM，无核苷酸&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>CD4a-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700063</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700398</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700467</td><td></td></tr><tr><td>CD44-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700183</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700483</td><td></td></tr><tr><td>CD90-PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700686</td><td></td></tr><tr><td>HLA I 类-PE (MHC I)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700640</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR-PE (MHC II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4700662</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Cayman</td><td>71740</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>2-磷酸-L-抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 重组人蛋白&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>油红 O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳素钢刀片</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C18</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 孔板</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm&amp;nbsp;培养皿</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>353003</td><td></td></tr></tbody></table>

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

肥胖是一种在全球范围内失控的流行病。解析脂肪组织发育过程中的分子调控机制，有望为治疗肥胖症或糖尿病提供新途径。尽管目前已建立多种永生化的脂肪细胞系，但来源于皮下白色脂肪组织基质血管组分的脂肪源性干细胞仍提供了一个可靠的细胞系统 离体 更接近脂肪发育 体内从7至9日龄的仔猪中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）。将猪皮下脂肪组织的背部白色脂肪库切片、剪碎并用胶原酶消化。这些pADSC具有向脂肪细胞分化的强大潜能。此外，通过特异性干细胞标志物鉴定，pADSC还具有多向分化潜能，可分化为多种中胚层来源的间充质细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。这些pADSC可用于阐明调控经典脂肪细胞分化的分子开关，或研究其向其他中胚层来源细胞分化的机制。最近还实现了pADSC向外胚层和内胚层来源细胞的跨系分化。因此，本方案所获得的pADSC为研究脂肪组织发育以及再生医学中的组织工程应用，提供了丰富且易于获取的具有完全多能性的成体间充质干细胞来源。

从猪背部皮下脂肪分离得到的pADSC接种于培养板或培养皿中，结果如图2所示。来源于基质-血管组分的pADSC形态与小鼠或人ADSC相似。接种24小时后，亚汇合状态的pADSC已贴壁，呈伸展的成纤维细胞样形态（图2A）。pADSC在72小时内将达到汇合状态，可用于脂肪细胞或其他间充质样细胞的分化（图2B）。经化学诱导后，pADSC表现出强烈的成脂分化潜能，分化9天后可观察到成熟脂肪细胞，超过90%的pADSC显示出成脂分化特征（图2C）。
为评估本实验方案中获得的猪脂肪间充质干细胞（pADSC）的特性，通过流式细胞术分析了其表面标志物的表达。如图3所示，间充质干细胞相关表面标志物CD29、CD44、CD90以及MHC I（或HLA I）在pADSC中高表达。而CD4a、CD31、CD45和MHC II（或HLA II）等阴性表面标志物在本方案获得的pADSC中几乎无法检测到（图3）。这些结果表明，这些pADSC具有典型的间充质干细胞特征，且未受到明显的内皮细胞或造血干细胞（包括髓系或淋巴系前体细胞）污染。
为进一步证实pADSC具有间充质干细胞特性，通过诱导pADSC向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化来检测其多向分化潜能。这些脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分别用特异性染料油红O、茜素红S和甲苯胺蓝O进行染色（图4）。这些结果表明，该方案所获得的pADSC具有多向分化潜能，并具备典型的间充质样前体细胞特征。
<img alt="光镜下的细胞培养形态；成纤维细胞；显微分析结果。" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 来自猪背部脂肪区域的pADSC的形态学特征。 （A）接种24小时后，pADSC在6孔培养板上贴壁并扩展，呈亚融合状态。（B）接种72小时后，pADSC达到融合状态。（C）pADSC经9天成脂诱导分化后观察到成熟脂肪细胞。图像采用相差显微镜以100倍放大倍数拍摄。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="pADSC表面标志物（阳性标志物CD29、CD44、CD90、MHC I及阴性标志物CD4a、CD31）的流式细胞术直方图。" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. pADSC干细胞表面标志物的鉴定。 将1 × 105个pADSC与特异性抗体反应，并通过流式细胞术分析干细胞标志物。图中数字表示与未染色对照相比，细胞群体中染色阳性细胞（红色）所占百分比。x轴表示相对荧光强度，y轴表示细胞群体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞分化；显微图像；脂肪生成、钙化、蛋白聚糖染色；200µm比例尺。" src="/files/ftp_upload/53886/53886fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. pADSC的多向分化能力。 通过将pADSC诱导分化为（A）脂肪细胞、（B）成骨细胞和（C）软骨细胞，并分别使用油红O、茜素红S和甲苯胺蓝O进行特异性染色，以评估pADSC的多向分化潜能。图像分别在（A）100倍、（B）200倍和（C）100倍放大倍数下，采用相差显微镜拍摄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53886/53886fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。

肥胖是一种在全球范围内不受控制的流行病。解析脂肪组织发育过程中的分子调控机制，有望为治疗肥胖症或糖尿病提供新途径。

本实验的总体目标是从猪皮下白色脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞，以评估其向间充质脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。该方法有助于解答肥胖研究中的关键问题，是揭示调控脂肪组织发育分子机制的有效工具。该技术的主要优势在于可收获大量基质血管细胞，从而能够深入分析脂肪细胞的分化过程及生物学特性。该技术的意义在于推动干细胞治疗研究，因为猪脂肪来源的干细胞具有多向分化潜能，可转分化为多种细胞谱系。首先将仔猪俯卧于清洁的手术台上。从颈部到尾部沿中线剃除所有毛发，并用7.5%聚维酮碘溶液擦拭背部皮肤三次。第三次擦拭后，让碘溶液在皮肤表面停留约10分钟。然后，用70%乙醇喷洒皮肤。使用浸有乙醇的纱布垫单向擦拭皮肤，以去除消毒剂，直至观察不到明显颜色为止。接下来，从颈部区域向下至腿部做一切口。然后，用镊子夹起脂肪和皮肤，用手术刀将猪的背部皮下脂肪组织层及相邻的皮肤层与肌肉分离。立即将皮肤和脂肪组织浸入一个无菌的200毫升烧杯中，烧杯内含有无血清、37摄氏度的DMEM，并用70%乙醇喷洒烧杯外表面。然后将烧杯置于超净台内，并在烧杯旁放置一张40厘米×30厘米的无菌三层铝箔覆盖物。将组织转移至铝箔上，皮肤面朝下。使用镊子和剪刀将脂肪组织上残留的肌肉组织修剪干净。将脂肪切成 7 厘米 × 7 厘米的方形小块，然后将脂肪块转移至一个新的灭菌 200 毫升烧杯中，烧杯内含有无血清、37°C 的 DMEM。随后，将一个定制的切片架（配备碳钢切片刀）置于覆盖箔上，并将其中一块脂肪组织放置在切片架上，脂肪层朝下。将脂肪切成尽可能接近但不切破皮肤的约1毫米厚的片状。然后用剪刀将脂肪组织尽可能剪碎，并将剪碎的组织加入含有补充胶原酶的过滤消化液的250毫升锥形瓶中。将锥形瓶置于37摄氏度的轨道摇床中，以45转/分钟的速度振荡孵育90分钟。当消化液变为无明显组织团块的糊状物时，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM F-12培养基终止消化。为收集猪脂肪来源的干细胞，使用镊子按压雪纺纱布的中部，将消化后的脂肪组织悬液经单层纱布过滤至无菌的250毫升血清瓶中，以引导并协助消化物通过。用镊子排空并扭转纱布，使液体完全滤出，随后将滤液分装至四个50毫升锥形离心管中。通过离心收集基质-血管细胞。然后，小心弃去上清液，避免扰动沉淀，以去除含有成熟脂肪细胞的大部分顶层脂肪。接着，用移液管将沉淀重悬于10毫升DMEM中，并轻轻振荡。再次离心细胞，并将沉淀重悬于10毫升ACK裂解缓冲液中。室温孵育7分钟后，向每管中加入10毫升DMEM以终止红细胞裂解，并轻轻振荡混匀。然后，再次离心细胞。用 10 毫升 DMEM 再洗涤细胞两次，然后将上清液通过 100 微米细胞筛滤入一个 50 毫升锥形管中。轻轻吹打细胞悬液数次以均匀分散细胞，并通过台盼蓝排斥法进行细胞计数。最后，将猪脂肪来源的干细胞以每平方厘米 6 × 10⁴ 的密度接种至适当大小的培养容器中，置于细胞培养基中培养。在37摄氏度、5% CO2条件下孵育细胞，以促进单层细胞的形成。接种后24小时可观察到，由基质-血管组分分离的猪脂肪源性干细胞呈现出类似小鼠或人脂肪源性干细胞的形态，呈伸展的纤维母细胞样。猪脂肪源性干细胞在72小时内达到汇合状态，此时可用于脂肪细胞或其他间充质样细胞的分化。这些细胞在化学诱导后也表现出强烈的成脂潜能，分化九天后即可观察到成熟的脂肪细胞，超过90%的猪脂肪源性干细胞显示出成脂分化能力。间充质干细胞表面标志物，包括CD 29、CD 44、CD 90和MHC 1，在猪脂肪源性干细胞中高表达，而CD 4a、CD 31、CD 45和MHC II几乎不可检测，表明这些猪脂肪源性干细胞具有间充质细胞特征，且无明显内皮细胞或造血干细胞污染。此外，通过使用特异性组织染色染料，可将分化的猪脂肪源性干细胞鉴定为脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞，证明这些基质-血管组分来源的细胞保留了典型的间充质前体细胞的多向分化潜能。进行此操作时，重要的是要牢记在细胞培养过程中保持良好的无菌技术，并尽可能快速地完成所有步骤，以最大限度地提高细胞的存活率。如果技术掌握得当，可在六小时内从两到三头猪中收获细胞。这一标准技术为糖尿病领域的肥胖研究者探索控制脂肪细胞分化的分子开关（如转录因子）铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离猪脂肪来源的干细胞，以及如何评估这些细胞向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞多向分化的潜能。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

隔离和脂肪干细胞分化的猪从皮下脂肪组织

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem...

从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

本文中，我们描述了采用酶消化法分离恒河猴来源的脂肪源性干细胞（ADSCs）的实验步骤。接下来，介绍了ADSC的增殖过程，包括细胞消化、计数和接种。最后，描述了使用特异性成脂诱导剂诱导ADSC分化的方法。此外，我们还介绍了用于确认分化的染色技术。...

恒河猴脂肪源性干细胞的分离、增殖与分化

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。...

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。...

分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了从小鼠腹主动脉周围脂肪组织中分离的基质血管组分来源的前脂肪细胞的分离、培养及成脂诱导方法，可用于研究血管周围脂肪组织的功能及其与血管细胞之间的关系。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞进行脂肪生成

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

学习从猪皮下脂肪组织中分离脂肪干细胞并进行多向分化诱导的方法。该技术可高效获取基质血管细胞，用于研究脂肪细胞分化机制及再生医学应用。

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

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