脂肪库特异性Sca1^high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

本实验的总体目标是从不同小鼠脂肪垫中分离出Sca1阳性的间充质干细胞。该技术的主要优势在于，利用基于免疫磁珠的细胞分选方法，可有效富集来自不同脂肪组织的脂肪源性干细胞，以便后续实验使用。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为胶原酶介导的组织消化强度和时间需要优化，以获得足够数量的细胞用于分选。

为了分离皮下脂肪垫，首先将小鼠仰卧位固定在泡沫解剖板上，并用70%乙醇喷洒小鼠体表。固定四肢后，在下腹部皮肤做一小切口。然后用镊子夹住切口上缘，用剪刀将皮肤与腹膜从腹部分离至胸部。

沿身体侧面在皮肤上做侧向切口，将皮肤从腹膜向外头方向剥离。然后向后拉起剩余的皮肤，同时将腹股沟脂肪组织远离身体，并用22号针头将皮肤固定在解剖板上。接着，用镊子夹住靠近腹膜处的一侧腹股沟脂肪垫起始部位，用精细剪刀在皮肤与腹股沟脂肪之间进行剪切，向腹股沟方向推进，注意避免皮肤污染皮下脂肪垫。

然后，将分离出的腹股沟脂肪垫置于一个标有 SQ 的 60 毫米培养皿中，培养皿内含有 37 °C 的培养基；以相同方法采集动物另一侧的腹股沟脂肪垫。为分离内脏脂肪垫，剪开腹膜以暴露内脏脂肪垫和肠道，然后将肠道移向胸腔方向。

抓住远端的内脏脂肪垫，轻轻向上提起脂肪组织，并小心将其解剖分离，注意避免包含附睾组织。然后将脂肪垫放入一个标有 VIS 的 60 毫米培养皿中，培养皿内含有 37 °C 的培养基。当所有脂肪垫收集完毕后，将培养皿转移至组织培养超净台中，并吸除培养基。

使用弯头剪刀将组织块剪碎。然后，将脂肪组织碎片加入含有新鲜配制胶原酶的单个50毫升离心管中。接着，在37摄氏度、300转/分钟的条件下振荡孵育10至20分钟，直至组织完全消化。

可能仍可见部分皮下脂肪垫组织。向胶原酶溶液中加入20毫升培养基以终止消化，并使用10毫升血清移液管将组织悬液吹打10次，充分解离已消化的组织。用100微米细胞滤网过滤细胞，然后离心组织。

然后小心地倾去上清液，注意不要扰动沉淀物，并用 5 mL 无菌水轻轻重悬两组细胞。静置 2 分钟，使红细胞充分裂解。随后在每根试管中加入 25 mL 含 FBS 的培养基以终止反应。

将两种脂肪细胞群体分别通过新的100微米细胞滤网过滤，再次离心，然后将沉淀重悬于1至3毫升培养基中。通过台盼蓝排斥法计数后，将1×10⁶个皮下脂肪垫细胞和内脏细胞分别接种至6孔细胞培养板的独立孔中。胰酶消化细胞后，加入1毫升分离缓冲液稀释胰酶，然后离心培养板。

将细胞重悬于每管500微升分离缓冲液中，再次离心细胞。随后，将细胞重悬于每管90微升分离缓冲液中，并向细胞悬液中加入每管10微升的抗Sca1 FITC一抗。在4摄氏度避光孵育10分钟后，用每管1毫升分离缓冲液洗涤细胞。

离心后，每份细胞悬液用 80 微升分离缓冲液重悬。然后向每个孔中加入 20 微升 Anti-FITC Microbeads，将培养板置于 4 摄氏度避光孵育 15 分钟。孵育结束后，用 1 毫升分离缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于每管 500 微升新鲜缓冲液中。

现在，将色谱柱置于磁力架上，用500 µL分离缓冲液冲洗色谱柱。将来自皮下脂肪垫组织培养的细胞转移至色谱柱上，注意避免产生气泡，并将未标记的Sca1阴性细胞收集到15 mL锥形管中。待所有细胞流经色谱柱后，用500 µL分离缓冲液洗涤色谱柱三次。

然后将柱子从磁铁上转移至一个新的15毫升锥形管中，加入1毫升新鲜分离缓冲液穿过柱子，以洗脱Sca1阳性细胞。最后，将Sca1阳性与阴性细胞组分分别离心沉淀，并将沉淀重悬于1毫升培养基中。随后计数各组分中的细胞数量，并将各组分分别接种至新的六孔细胞培养板的各个孔中。

从皮下脂肪分离的血管基质细胞无论Sca1表达水平如何，均呈现成纤维细胞样的伸展状细胞形态。与皮下腹股沟脂肪来源的Sca1高表达细胞类似，内脏附睾脂肪来源的Sca1高表达细胞也呈现伸展状的成纤维细胞样形态，而VIS Sca1低表达细胞则呈现上皮样形态。

从分离的 Sca1-GFP 小鼠中获得的 Sca1 高表达细胞在组织培养中可轻松识别为 GFP 阳性细胞。事实上，通过流式细胞术检测时，大多数 GFP 阳性细胞经抗 Sca1 抗体检测证实可在其细胞表面表达 Sca1 蛋白。结合实时 PCR 分析，可展示腹股沟脂肪和附睾脂肪来源的 Sca1 高表达脂肪源性干细胞之间胶原降解性基质金属蛋白酶的差异表达。

此外，当使用荧光素标记的I型胶原凝胶评估细胞周围降解活性时，可观察到内脏Sca1高表达的脂肪来源干细胞介导的胶原重塑活性显著增强。熟练掌握后，若操作得当，脂肪垫细胞的分离可在两小时内完成。进行该操作时，应注意保持手术区域的清洁与有序，以确保脂肪垫高效分离。

采用此方法后，还可进行其他实验，例如胶原蛋白降解分析，以进一步探究脂肪来源干细胞介导的组织重塑相关问题。该技术建立后，为肥胖与基质生物学领域的研究人员探索脂肪来源干细胞在小鼠和人类脂肪组织重塑及功能中的作用奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从脂肪组织库中分离和富集Sca1阳性的原代细胞。