Name: 脂肪库专用SCA1的免疫磁性分离高脂肪干细胞（ASCs） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解利用免疫磁性分选技术从小鼠腹股沟和附睾脂肪库中分离Sca1阳性脂肪干细胞的方法。该技术通过胶原酶消化和磁珠分选实现细胞高效富集，为再生医学研究提供可靠的细胞来源。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）DK095137 项目（资助对象：THC）提供支持。我们感谢现有及以往实验室成员对所述方法的开发与完善所做出的贡献。

伦理声明：所有方法和实验方案均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，符合《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会实验动物资源研究所）的规定。小鼠饲养于密歇根大学动物实验中心，自由摄食饮水，并维持在12小时黑暗/12小时光照的循环环境中。
1. 准备工作
<ol>
	<li>使用DMEM、10% FBS、1× P/S/G和1×抗生素/抗真菌剂配制原代培养基，用于组织消化前的保存。将原液和分装样品置于37 ºC水浴中预热。</li>
	<li>每种待分离的脂肪垫（最多五只小鼠）按每5毫升使用HBSS（含Ca、Mg）溶解5 mg/ml的III型胶原酶配制溶液。例如，若从单一基因型中分离SQ和VIS脂肪垫，则配制10 ml；若为野生型和突变型的SQ及VIS脂肪垫，则配制20 ml。调节pH至7.4，经无菌过滤后分装至50 ml离心管中，避光放置备用。</li>
	<li>使用70%乙醇对术区进行消毒，擦拭后覆盖蓝色垫巾，并在垫巾上喷洒适量乙醇。</li>
	<li>使用22 G针头将吸水垫固定于泡沫板上，并用剪刀修整边缘。用乙醇喷洒垫子后，将泡沫板置于蓝色垫巾上，并用另一块蓝色垫巾覆盖，直至开始解剖操作。</li>
	<li>取两个50 ml离心管装满乙醇，放置在术区旁边的支架上，将剪刀和镊子浸入乙醇中消毒。</li>
	<li>另取一个50 ml离心管装入含1×抗生素/抗真菌剂的PBS，用于冲洗手术器械上的乙醇。</li>
	<li>在生物安全柜内，为每种组织类型标记60 mm培养皿，并加入预热至37 ºC的培养基，将培养皿置于手术区域附近备用。</li>
</ol>
2. 皮下脂肪垫的分离
<ol>
	<li>用过量异氟烷和张力性气胸法处死小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇轻轻喷洒小鼠，并使其仰卧。用22号针将四肢固定在泡沫板上。</li>
	<li>在小鼠下腹部皮肤上做一个小切口。用镊子夹住切口上缘，用剪刀将皮肤与腹膜分离。</li>
	<li>从腹部至胸部将皮肤完全与腹膜分离后，沿身体两侧做横向切口，将皮肤向头侧翻折，远离腹膜。</li>
	<li>将残留的皮肤连同腹股沟脂肪组织一起从身体上翻起，并用22号针将其固定在泡沫板上。</li>
	<li>更换为精细剪刀和镊子。用镊子夹住靠近腹膜处的腹股沟脂肪垫起始部位，沿皮肤与腹股沟脂肪之间的间隙向腹股沟方向剪下，避免皮肤污染皮下组织。</li>
	<li>将分离出的腹股沟脂肪垫放入已标记的60 mm培养皿中。</li>
</ol>
3. 内脏脂肪垫（VIS）的分离
<ol>
	<li>与步骤 2.5 类似，切开腹膜以暴露内脏脂肪团和肠道。</li>
	<li>将肠道向胸腔方向移开。</li>
	<li>在远端抓住 VIS 脂肪团并轻轻提起。在分离 VIS 脂肪团时需小心，避免包含附睾（或使用雌性小鼠时为子宫）组织。</li>
	<li>放入已标记的培养皿中，并对另一侧 VIS 脂肪团重复步骤 3.3。</li>
</ol>
4. 脂肪垫的胶原酶消化
<ol>
	<li>将60 mm培养皿移至组织培养罩中，吸除培养基。</li>
	<li>用弯头剪刀剪碎脂肪组织，然后加入胶原酶溶液中。在处理不同组织类型之间，务必用乙醇和PBS清洗剪刀和镊子。</li>
	<li>在37 ºC、300 rpm条件下振荡10–20分钟，直至组织消化完全。若仍有少量皮下组织碎片可见，亦属正常，后续步骤将予以处理。</li>
	<li>向胶原酶溶液中加入25 ml培养基以终止胶原酶消化作用，并用10 ml血清移液管反复吹打10次，使消化后的组织充分分散。</li>
	<li>使用100 µm细胞滤网过滤细胞，随后以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀，向沉淀中加入5 ml无菌水，轻轻吹打使细胞重悬，静置2分钟以裂解红细胞。</li>
	<li>加入含10% FBS的25 ml培养基，并通过新的100 µm细胞滤网过滤细胞。</li>
	<li>以300 × g离心10分钟，吸除上清液，将沉淀用1 ml培养基重悬。</li>
	<li>使用血细胞计数板，以1:1台盼蓝染色法进行细胞计数。</li>
	<li>在6孔板的每个孔中接种1 × 106个细胞。</li>
</ol>
5. 磁性细胞分离
<ol>
	<li>细胞贴壁约 4 至 6 小时后，用 HBSS (-Ca, -Mg) 洗涤细胞两次。使用 0.05% 胰蛋白酶消化贴壁细胞。将胰蛋白酶细胞悬液用 1 ml 分离缓冲液稀释后，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液。将细胞重悬于 500 µl 缓冲液中。取 10 µl 样品，使用血细胞计数板计数细胞。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>完全吸除上清液。将细胞重悬于 90 µl 缓冲液中。加入 10 µl 抗 Sca1-FITC 一抗，充分混匀后于 4 ºC 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 1 ml 缓冲液洗涤细胞，以 300 × g 离心 5 分钟。完全去除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 80 µl 缓冲液中。加入 20 µl 抗 FITC 磁珠，充分混匀后于 4 ºC 避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 1 ml 缓冲液洗涤细胞，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>去除上清液，将沉淀重悬于 500 µl 缓冲液中。</li>
	<li>将层析柱置于磁力架上，用 500 µl 缓冲液冲洗层析柱。</li>
	<li>将细胞悬液加入层析柱中。加样时避免产生气泡。</li>
	<li>收集未标记的 Sca1- 细胞，并用 500 µl 缓冲液洗涤层析柱 3 次。仅当储液腔排空后才加入新的缓冲液。加样时避免产生气泡。</li>
	<li>将层析柱从磁力架上取下，放入一个 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>向层析柱中加入 1 ml 缓冲液，通过推动随附的活塞穿过层析柱储液腔，洗脱 Sca1+ 细胞。</li>
	<li>将细胞组分以 300 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 1 ml 培养基中。</li>
	<li>从标记和未标记的组分中各取 10 µl 样品，使用血细胞计数板计数细胞。</li>
	<li>将每种细胞组分接种至 6 孔板中的 1 个孔内。</li>
</ol>
6. 使用流式细胞术验证Sca1high ACSs的免疫磁珠分选
<ol>
	<li>用不含钙、镁的 HBSS 溶液冲洗细胞两次，然后使用 0.05% 胰蛋白酶消化细胞。</li>
	<li>将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，加入 1 ml 培养基重悬细胞，并用血细胞计数板计数。</li>
	<li>取 1 ml 培养基中含有 &#62;106 个的细胞，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并重复步骤 6.3 两次。</li>
	<li>用 1 ml 含 2% 山羊血清和 2% BSA 的溶液重悬细胞，在室温下封闭 30 分钟。</li>
	<li>将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>移除封闭液。</li>
	<li>在 100 µl 含 2% 山羊血清和 2% BSA 的 PBS 中加入大鼠 IgG2a Alexa Fluor 647 抗体（0.25 µg，1:400）或抗 Sca1 Alexa Fluor 647 抗体（0.25 µg，1:400），4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>向细胞中加入 1 ml 冷 PBS，于 4 °C 在 300 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并重复步骤 6.9 两次。</li>
	<li>将细胞重悬于 1 ml PBS 中，将细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网，以备流式细胞术分析。</li>
</ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li>
<li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li>
<li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li>
<li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
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<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
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<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了从小鼠不同脂肪垫中分离和通过免疫磁珠法分离小鼠ASCs的方法及其应用 体外 实验。该方法可高效快速地分离大量Sca1阳性ASCs，相较于技术复杂且成本较高的FACS介导的ASCs分离方法具有优势。9,14与流式细胞术（FACS）不同，免疫磁珠细胞分选技术不能利用多种抗原来鉴定目标细胞群体。然而，若细胞表面抗原特征明确，使用免疫磁珠分离可增加待分析细胞的数量，且无需依赖FACS设备。15对于许多没有核心设施的小型研究机构的生物研究人员来说，仍然难以轻易获得。
为了确保实验成功，操作过程中有一些关键环节必须严格遵守。获取脂肪来源的干细胞需要通过手术分离小鼠的脂肪组织库。因此，组织获取的速度和准确性对于获得大量活细胞至关重要。此外，保持手术区域和器械的清洁对防止细胞和组织样本受到微生物污染也极为重要。分离后的脂肪组织必须在II型胶原酶溶液中进行酶解消化。皮下脂肪（SQ）与内脏脂肪（VIS）脂肪垫的细胞外基质（ECM）组成存在差异10,16，其中VIS脂肪垫的胶原蛋白含量低于SQ。因此，VIS脂肪...

干细胞抗原1（Sca1，或Ly6A/E）最初被鉴定为造血干细胞和间充质干细胞表达的一种细胞表面标志物5,6从小鼠脂肪组织库中获得的脂肪基质血管组分（SVF）是一类异质性细胞群体，包含成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、神经细胞以及脂肪细胞前体细胞。7脂肪细胞前体细胞，或称脂肪源性干细胞（ASCs），是存在于富含胶原的血管周围细胞外基质（ECM）中、不含有脂滴的细胞。8. 约50%的基质血管组分（SVF）由ASCs构成，其特征为谱系标记阴性（Lin-）和 CD29+CD34+Sca1+ 9。这些细胞大多数为 Sca1+CD24- 脂肪细胞前体，具有分化为脂肪细胞的能力 体外；然而，仅有少量细胞（SVF 的 0.08%）为 Sca1 阳性+CD24+ 具有完全增殖能力并能分化为脂肪细胞的细胞 体内 条件9尽管使用Sca1可能存在潜在的局限性+ 不区分CD24的SVF+ CD24 阳性细胞- 细胞，分离 Sca1+ 利用免疫磁珠细胞分离法从脂肪库中分离ASCs是确定原代脂肪细胞前体细胞细胞自主表型的一种高效且实用的方法。
在肥胖与糖尿病领域，组织纤维化和炎症在2型糖尿病的发生与维持过程中起着关键作用3。最近，Tokunaga 等. 表明 Sca1高 从C57BL6/J小鼠腹股沟（或皮下，SQ）和性腺周围（或内脏，VIS）脂肪组织分离的细胞表现出不同的基因表达特征和细胞外基质重塑模式 体外10MMP14（MT1-MMP）是膜型基质金属蛋白酶（MMP）家族的典型成员，通过其胶原蛋白水解活性介导白色脂肪组织（WAT）的发育。1.
通过以下方案分离和富集的细胞可开展多种实验，例如三维培养、分化研究、胶原降解检测以及RNA测序10,11降解实验应使用酸提取的胶原蛋白进行，以确保端肽的保留11,12以下方案将演示从不同脂肪组织库中分离原代血管基质细胞，并利用免疫磁珠细胞分离技术富集脂肪细胞前体细胞的方法。细胞分选的有效性将通过流式细胞术以及表达Sca1-GFP的转基因小鼠（其Sca1阳性细胞表达绿色荧光蛋白GFP）进行评估。+ 细胞，由一个 Sca1 启动子13.

<table><tbody><tr><td>III型胶原酶</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>LS004182</td><td>组织消化</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>高糖培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/谷氨酰胺（100倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>培养基抗生素</td></tr><tr><td>抗-抗（100倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>抗真菌培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×，pH 7.4）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.05%）</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD生物科学</td><td>352360</td><td>100-&amp;mu;m细胞滤筛</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>大型</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>精细，弯曲尖端</td></tr><tr><td>大型镊子</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8&amp;rdquo; 针</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5&amp;rdquo; 针</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS 分离柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>抗Sca1微珠试剂盒（FITC）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&amp;ordm;Ab 和抗 FITC 磁珠 2&amp;ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS 运行缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>蓝色Chux垫</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>吸水垫</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>泡沫板</td><td></td><td></td><td>使用50 ml离心管</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a 抗小鼠 Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 IgG2a 抗小鼠 F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>圆底试管</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（&amp;ndash;Ca, &amp;ndash;Mg</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（含Ca，含Mg）</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>用于胶原酶溶液</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白（2.7 mg/ml，溶于37 mm乙酸）</td><td>自行制备&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>自制准备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>康宁</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 羧酸琥珀酰亚胺酯，混合异构体</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO₃&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

脂肪库特异性sca1high 脂肪源性干细胞（ascs）的免疫磁珠分离

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

脂肪来源干细胞（ASCs）的分离是脂肪组织生物学、脂肪生成以及细胞外基质（ECM）重塑研究领域的重要方法。体内，由纤维状胶原蛋白构成的富含ECM的微环境在肥胖发展与消退过程中为脂肪组织提供结构支持。由基质金属蛋白酶（MMPs）介导的生理性ECM重塑在调控脂肪组织大小和功能中起关键作用1,2。生理性胶原降解性ECM重塑的丧失可能导致胶原过度积累（组织纤维化）、巨噬细胞浸润，最终导致包括胰岛素抵抗在内的代谢稳态失衡3,4。当在基因靶向小鼠模型中观察到脂肪组织表型改变时，从脂肪库中分离原代ASCs进行体外研究，是明确特定基因在调控ASCs功能中作用的有效方法。下文将介绍一种Sca1high ASCs的免疫磁珠分离方法。

从不同脂肪垫中富集 Sca1high ASCs
从皮下脂肪（SQ fat）分离的血管基质细胞呈现成纤维细胞样、伸展的细胞形态，且与Sca1表达水平无关（图1A）。另一方面，来源于腹股沟脂肪（VIS，即eWAT来源）的Sca1high和Sca1low细胞在细胞形态上表现出明显差异。与来源于皮下脂肪（iWAT来源）的Sca1high细胞类似，来源于腹股沟脂肪（eWAT来源）的Sca1high细胞呈现伸展的成纤维细胞样形态，而VIS来源的Sca1low细胞则呈现上皮样形态。从Sca1-GFP小鼠分离的Sca1high细胞可在组织培养中被轻易识别为GFP阳性细胞（图1B）。当通过流式细胞术检测这些细胞时，大多数GFP阳性细胞被证实可在细胞表面...

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1high脂肪来源干细胞（ASCs）。

脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

脂肪来源干细胞（ASCs）的分离是脂肪组织生物学、脂肪生成及细胞外基质研究领域的重要方法……

本实验的总体目标是从不同小鼠脂肪垫中分离出Sca1阳性的间充质干细胞。该技术的主要优势在于，利用基于免疫磁珠的细胞分选方法，可有效富集来自不同脂肪组织的脂肪源性干细胞，以便后续实验使用。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为胶原酶介导的组织消化强度和时间需要优化，以获得足够数量的细胞用于分选。为了分离皮下脂肪垫，首先将小鼠仰卧位固定在泡沫解剖板上，并用70%乙醇喷洒小鼠体表。固定四肢后，在下腹部皮肤做一小切口。然后用镊子夹住切口上缘，用剪刀将皮肤与腹膜从腹部分离至胸部。沿身体侧面在皮肤上做侧向切口，将皮肤从腹膜向外头方向剥离。然后向后拉起剩余的皮肤，同时将腹股沟脂肪组织远离身体，并用22号针头将皮肤固定在解剖板上。接着，用镊子夹住靠近腹膜处的一侧腹股沟脂肪垫起始部位，用精细剪刀在皮肤与腹股沟脂肪之间进行剪切，向腹股沟方向推进，注意避免皮肤污染皮下脂肪垫。然后，将分离出的腹股沟脂肪垫置于一个标有 SQ 的 60 毫米培养皿中，培养皿内含有 37 °C 的培养基；以相同方法采集动物另一侧的腹股沟脂肪垫。为分离内脏脂肪垫，剪开腹膜以暴露内脏脂肪垫和肠道，然后将肠道移向胸腔方向。抓住远端的内脏脂肪垫，轻轻向上提起脂肪组织，并小心将其解剖分离，注意避免包含附睾组织。然后将脂肪垫放入一个标有 VIS 的 60 毫米培养皿中，培养皿内含有 37 °C 的培养基。当所有脂肪垫收集完毕后，将培养皿转移至组织培养超净台中，并吸除培养基。使用弯头剪刀将组织块剪碎。然后，将脂肪组织碎片加入含有新鲜配制胶原酶的单个50毫升离心管中。接着，在37摄氏度、300转/分钟的条件下振荡孵育10至20分钟，直至组织完全消化。可能仍可见部分皮下脂肪垫组织。向胶原酶溶液中加入20毫升培养基以终止消化，并使用10毫升血清移液管将组织悬液吹打10次，充分解离已消化的组织。用100微米细胞滤网过滤细胞，然后离心组织。然后小心地倾去上清液，注意不要扰动沉淀物，并用 5 mL 无菌水轻轻重悬两组细胞。静置 2 分钟，使红细胞充分裂解。随后在每根试管中加入 25 mL 含 FBS 的培养基以终止反应。将两种脂肪细胞群体分别通过新的100微米细胞滤网过滤，再次离心，然后将沉淀重悬于1至3毫升培养基中。通过台盼蓝排斥法计数后，将1×10⁶个皮下脂肪垫细胞和内脏细胞分别接种至6孔细胞培养板的独立孔中。胰酶消化细胞后，加入1毫升分离缓冲液稀释胰酶，然后离心培养板。将细胞重悬于每管500微升分离缓冲液中，再次离心细胞。随后，将细胞重悬于每管90微升分离缓冲液中，并向细胞悬液中加入每管10微升的抗Sca1 FITC一抗。在4摄氏度避光孵育10分钟后，用每管1毫升分离缓冲液洗涤细胞。离心后，每份细胞悬液用 80 微升分离缓冲液重悬。然后向每个孔中加入 20 微升 Anti-FITC Microbeads，将培养板置于 4 摄氏度避光孵育 15 分钟。孵育结束后，用 1 毫升分离缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于每管 500 微升新鲜缓冲液中。现在，将色谱柱置于磁力架上，用500 µL分离缓冲液冲洗色谱柱。将来自皮下脂肪垫组织培养的细胞转移至色谱柱上，注意避免产生气泡，并将未标记的Sca1阴性细胞收集到15 mL锥形管中。待所有细胞流经色谱柱后，用500 µL分离缓冲液洗涤色谱柱三次。然后将柱子从磁铁上转移至一个新的15毫升锥形管中，加入1毫升新鲜分离缓冲液穿过柱子，以洗脱Sca1阳性细胞。最后，将Sca1阳性与阴性细胞组分分别离心沉淀，并将沉淀重悬于1毫升培养基中。随后计数各组分中的细胞数量，并将各组分分别接种至新的六孔细胞培养板的各个孔中。从皮下脂肪分离的血管基质细胞无论Sca1表达水平如何，均呈现成纤维细胞样的伸展状细胞形态。与皮下腹股沟脂肪来源的Sca1高表达细胞类似，内脏附睾脂肪来源的Sca1高表达细胞也呈现伸展状的成纤维细胞样形态，而VIS Sca1低表达细胞则呈现上皮样形态。从分离的 Sca1-GFP 小鼠中获得的 Sca1 高表达细胞在组织培养中可轻松识别为 GFP 阳性细胞。事实上，通过流式细胞术检测时，大多数 GFP 阳性细胞经抗 Sca1 抗体检测证实可在其细胞表面表达 Sca1 蛋白。结合实时 PCR 分析，可展示腹股沟脂肪和附睾脂肪来源的 Sca1 高表达脂肪源性干细胞之间胶原降解性基质金属蛋白酶的差异表达。此外，当使用荧光素标记的I型胶原凝胶评估细胞周围降解活性时，可观察到内脏Sca1高表达的脂肪来源干细胞介导的胶原重塑活性显著增强。熟练掌握后，若操作得当，脂肪垫细胞的分离可在两小时内完成。进行该操作时，应注意保持手术区域的清洁与有序，以确保脂肪垫高效分离。采用此方法后，还可进行其他实验，例如胶原蛋白降解分析，以进一步探究脂肪来源干细胞介导的组织重塑相关问题。该技术建立后，为肥胖与基质生物学领域的研究人员探索脂肪来源干细胞在小鼠和人类脂肪组织重塑及功能中的作用奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从脂肪组织库中分离和富集Sca1阳性的原代细胞。

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发育生物学

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