从脑边缘和Mesocortical多巴胺奖赏网站继朴素的糖和脂肪摄入大鼠c-fos激活的同时检测
August 24th, 2016
这项研究的目的是通过使用蜂窝的c-fos的激活来测量大鼠的脂肪和糖新颖摄入后多巴胺途径和终端站点同步变化划定一个可靠免疫组织学技术，以确定奖励相关的分布式脑网络。
该实验方案的总体目标是确定 VTA 及其主要的中端脑 DA 投影区是否会在新摄入玉米油、葡萄糖、果糖或糖精溶液后显示坐标和同时 c-Fos 激活。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，例如动机，并确定多个大脑部位是否以协调的方式响应可口的刺激而被激活。该技术的主要优点是它结合了已建立的行为分析、细胞激活技术和统计分析。
要设置该装置，请使用带有强盗塞的校准离心管和 45 度角金属吸管，以准确测量提供给大鼠的溶液。通过拉紧的金属弹簧将其固定在笼子上，并允许看到校准。训练前 3 到 5 天，限制大鼠的食物配给，将其体重降低到原始体重的 85%，以增加食用溶液的动力。
同时，在一小时的疗程中向动物提供 10 毫升含有 0.2% 糖精的训练前溶液，为期 4 天，以最大限度地提高大鼠以较短的潜伏期对后续测试溶液进行采样的可能性。在每次会话之前和之后称量试管以获得摄入量测量值。然后，在第五天对接受 6 种溶液之一的亚组进行摄入测试。
确保大鼠采样溶液具有较短的潜伏期，如果不满足此要求，则将受试者排除在研究之外。为了准备组织，在牺牲动物后，迅速从头骨中取出大脑。使用咬合器小心地从大脑中裂开并去除骨头，从后到前。
在小脑下方的区域工作，并确保咬合骨位于骨骼和脑膜软脑膜之间。去除颅骨的顶部和侧面后，用小抹刀将大脑从底部提起，然后用小剪刀剪断颅神经。然后，将大脑在 4% 多聚甲醛溶液中于 4 摄氏度下固定过夜。
第二天，将大脑置于室温下的蔗糖溶液中，直到它沉淀在容器底部。之后，取下嗅球。随后，去除小脑和脑桥。
然后，冠状安装大脑，将尾部固定在切片机的舞台上，并切割 40 微米的冠状切片。在此过程中，用 5 毫升 5% 正常山羊血清和 0.2% Triton x-100 的 PBS 溶液处理切片 1 小时。接下来，将处理过的切片与 4 摄氏度的一抗在含有 1 mL PBS 的孔中孵育 36 小时。
36 小时后，用 5 毫升 PBS 冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。然后，在含有 1 mL PBS 的孔中，将切片与二抗在室温下孵育 2 小时。然后，用 5 毫升 PBS 冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。
接下来，将冲洗后的切片在市售的亲和素辣根过氧化物酶混合物中孵育 2 小时。2 小时后，用 5 毫升 PBS 冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。随后，在过氧化氢存在下，将这些切片与 DAB 反应 5 到 10 分钟。
之后，通过将 VTA 切片与酪氨酸羟化酶抗体在 5 毫升 PBS 中在 4 摄氏度下孵育过夜来双重标记 VTA 切片。第二天，用 5 毫升 PBS 冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。然后，在室温下将切片与 5 mL PBS 中的二抗孵育 2 小时。
2 小时后，用 5 毫升 PBS 冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。要使用二抗过氧化物酶复合物观察抗体，请将其与 DAB 和 0.3% 硫酸镍溶液的组合反应 5 至 10 分钟。双击软件图标对细胞进行计数。
转到菜单栏，单击 Acquisition ，然后单击 Live Image。之后，聚焦感兴趣的区域，然后单击屏幕以建立参考点。接下来，转到网格工具栏，然后单击 显示网格， 和 使用网格标签.
使用预先确定的轨迹勾勒出感兴趣区域。然后，对每个感兴趣区域中的所有细胞进行计数，并在左侧边栏中选择 Plus 以注册 c-Fos 细胞的计数。当观察到定义的深红色圆圈时，考虑一个细胞 c-Fos 阳性。
对每个站点重复此过程，并确保每个感兴趣区域中每个部分的两个不知情的评分者之间的评分者间可靠性始终超过 0.8。之后，计算感兴趣区域中的 c-Fos 阳性神经元。描述 VTA 中的 TH 阳性和 TH 阴性细胞中是否存在 c-Fos 免疫反应性。
该图显示，脂肪或糖的摄入量不同地增加了整个杏仁核以及基底外侧和中央皮质-内侧杏仁核亚区域的 c-Fos 激活。在这张图片中，在暴露于玉米油、葡萄糖和果糖摄入的动物中观察到实际的杏仁核 c-Fos 激活。在暴露于玉米油和水的动物中也观察到 VTA 中的 C-Fos 激活。
黑色箭头表示代表性的双标记 TH c-Fos 阳性细胞，而灰色箭头表示仅代表性的 c-Fos 细胞。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个星期内完成。在尝试此过程时，请务必记住遵循精确的方法、存储和计数。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本研究旨在通过使用免疫组织化学技术测量大鼠摄入脂肪和糖分后多巴胺通路中的c-fos活化，来识别与奖励相关的大脑网络。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为科学
- 神经生物学
背景
- 了解多巴胺在奖励处理中的作用。
- 研究美味刺激对大脑激活的影响。
- 利用c-fos作为神经元活化的标记。
- 探索大鼠饮食与动机之间的关系。
研究目的
- 确定VTA及其投射区域的c-fos活化。
- 评估多个大脑部位的协调活化。
- 研究不同糖分和脂肪溶液对大脑活动的影响。
使用的方法
- 行为测试以评估动机。
- 免疫组织化学技术测量c-fos活化。
- 统计分析以评估大脑活化模式。
- 准备大鼠摄入的溶液。
主要结果
- 对新食物摄入观察到同步的c-fos活化。
- 识别了多巴胺通路中的不同活化模式。
- 提供了对美味刺激反应中协调大脑部位活化的证据。
- 体重受限后，动机与食物摄入增加相关联。
结论
- 研究提供了有关奖励神经生物学机制的见解。
- 研究结果可能为未来关于动机和饮食影响的研究提供信息。
- 结合行为和细胞技术增强了对大脑功能的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous detection of c-Fos activation across mesolimbic and mesocortical dopamine pathways enables precise mapping of distributed neural responses to palatable nutrient intake. This approach strengthens predictive confidence in target validation for reward-related neurobiological mechanisms, supporting early-stage de-risking in CNS drug discovery. The method's quantitative, multi-site readouts facilitate robust portfolio triage and translational continuity for neuropsychiatric and metabolic research programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of coordinated neural activation in response to defined nutrient stimuli.
- Supports biological de-risking by clarifying functional engagement of dopamine pathways.
- Provides quantitative evidence for distributed network involvement in reward processing.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated brain region activation profiles for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative c-Fos immunoreactivity outputs across multiple sites.
- Supports assay standardization and cross-study comparability for neural activation endpoints.
- Enables reliable evaluation of candidate interventions on reward circuitry.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neural activation patterns with disease-relevant behavioral phenotypes in rodent models.
- Provides continuity from discovery-stage pathway mapping to preclinical validation of CNS targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for neuropsychiatric and metabolic indications.
- Strengthens translational biomarker strategies by linking cellular activation to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neural activation, supporting both target validation and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Quantifies coordinated c-Fos activation to clarify pathway engagement and de-risk mechanistic hypotheses.
- Screening: Provides standardized, reproducible activation metrics for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative cell counts and inter-rater reliability metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Links neural activation signatures to behavioral phenotypes, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for mapping distributed neural responses across diverse models and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes multi-site neural activation assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and metabolic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, immunohistochemistry, and quantitative image analysis.
- Demands access to calibrated behavioral apparatus, microtomes, and imaging software.
- Necessitates rigorous cross-rater standardization and reliability assessment for cell counting.
- Adaptable to various rodent models and nutrient stimuli with protocol optimization.
- Dependent on precise tissue handling and antibody validation for reproducible results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Testing Apparatus and Intake Procedures
2:06
Tissue Preparation
3:22
c-fos Staining Procedure
5:29
Determination of c-fos Immunoreactive Counts
6:45
Results: Actual Amygdala and Ventral Tegmental Area c-fox Activation Following Fats and Sugars
7:35
Conclusion
