大鼠初次摄入糖和脂肪后从中脑边缘和中脑皮层多巴胺奖赏区域同时检测c-Fos激活

本实验方案的总体目标是确定在初次摄入玉米油、葡萄糖、果糖或糖精溶液后，腹侧被盖区（VTA）及其主要的中脑-端脑多巴胺（DA）投射区域是否表现出协调且同步的c-Fos激活。该方法有助于回答神经生物学领域的关键问题，例如动机机制，并可识别多个脑区在面对可口刺激时是否以协调方式被共同激活。该技术的主要优势在于结合了成熟的动物行为学检测、细胞激活技术以及统计学分析方法。

安装装置时，使用带有橡胶塞的校准离心管和一根呈45度角的金属吸管，以准确测量提供给大鼠的溶液量。用一根拉紧的金属弹簧将装置固定在大鼠的饲养笼上，以便观察校准刻度。在训练开始前3至5天，限制大鼠的食物供给，使其体重降至原始体重的85%，以提高其摄入溶液的动机。

在此期间，每天提供10毫升含0.2%糖精的预训练溶液，每次持续一小时，连续四天，以最大限度提高大鼠在后续测试中快速摄取测试溶液的可能性。每次实验前后称量试管重量，以获得摄取量数据。随后，在第五天对接受六种溶液之一的亚组进行摄取量测试。

确保大鼠在较短的潜伏期内对样品溶液进行采样，若未满足此要求，则将该受试动物排除在研究之外。组织制备时，处死动物后应迅速将脑组织从颅骨中取出。使用咬骨钳从后向前小心地敲裂并移除脑部周围的颅骨。

在小脑下方区域操作，确保咬骨钳位于颅骨与软脑膜之间。去除颅骨顶部及两侧后，用小刮勺从基底部轻轻抬起脑组织，并用小剪刀剪断颅神经。随后，将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中，在4摄氏度下固定过夜。

第二天，将脑组织置于室温的蔗糖溶液中，直至其沉入容器底部。随后，切除嗅球。接着，切除小脑和脑桥。

然后，将脑组织按冠状面切片，将尾侧部分固定在切片机载物台上，切取厚度为40 µm的冠状切片。在此步骤中，用含有5%正常山羊血清和0.2% Triton X-100的PBS溶液5 mL处理切片，孵育1小时。接着，将处理后的切片置于含有1 mL PBS的孔板中，加入一抗，在4 °C下孵育36小时。

36小时后，用5毫升PBS溶液将切片冲洗三次，每次10分钟。然后，在含有1毫升PBS的孔中，室温下用二抗孵育切片2小时。随后，再次用5毫升PBS溶液将切片冲洗三次，每次10分钟。

接下来，将洗涤后的切片置于市售的亲和素-辣根过氧化物酶混合液中孵育两小时。孵育两小时后，用5毫升PBS溶液洗涤切片三次，每次10分钟。随后，在过氧化氢存在下，用DAB孵育切片5至10分钟。

随后，将VTA切片与酪氨酸羟化酶抗体在5 mL PBS中4°C孵育过夜，进行双重标记。次日，用5 mL PBS将切片漂洗三次，每次10分钟。接着，将切片在5 mL PBS中室温下与二抗孵育2小时。

孵育两小时后，用五毫升 PBS 溶液冲洗切片三次，每次十分钟。为通过二抗过氧化物酶复合物显色抗体，加入 DAB 与 0.3% 硫酸镍溶液的混合液反应五至十分钟。通过双击软件图标对细胞进行计数。

转到菜单栏，单击“Acquisition”，然后选择“Live Image”。接着，将目标区域调至清晰对焦，并单击屏幕以建立参考点。接下来，转到网格工具栏，单击“Display Grid”和“Use Grid Labels”。

使用预设的轨迹勾画出目标区域。然后，统计每个目标区域内的所有细胞，并在左侧边栏中选择“Plus”以记录c-Fos阳性细胞的数量。当观察到明确的深红色圆形信号时，可将该细胞判定为c-Fos阳性。

对每个位点重复此过程，并确保在每个感兴趣区域的各个切片中，两位不知情评估者之间的评分者间可靠性始终超过 0.8。随后，计数感兴趣区域中 c-Fos 阳性神经元。界定 VTA 中 TH 阳性细胞和 TH 阴性细胞是否存在 c-Fos 免疫反应阳性。

该图像显示，脂肪或糖的摄入会差异性地增加整个杏仁核以及基底外侧杏仁核和中央-皮质-髓质杏仁核亚区的c-Fos激活。在此图像中，实际观察到摄入玉米油、葡萄糖以及果糖的动物出现了杏仁核c-Fos激活。在摄入玉米油和水的动物中，也观察到腹侧被盖区（VTA）的c-Fos激活。

黑色箭头指示具有代表性的、双标记的 TH 与 c-Fos 阳性细胞，灰色箭头指示仅表达 c-Fos 的代表性细胞。若操作得当，掌握该技术后可在三到四周内完成实验。在实施该实验过程中，务必严格遵循精确的方法学、储存条件和计数步骤。

感谢观看，祝您的实验顺利。