Name: 的发展体外眼平台，试验用隐形眼镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解体外眼模型技术，通过模拟泪液流动、眨眼机械磨损及空气暴露评估隐形眼镜性能。该方法采用PDMS材料构建平台，为眼科器械研发提供经济高效的测试方案。

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作者谨此感谢NSERC 20/20眼科先进材料开发网络提供的经费支持。

所有实验均按照滑铁卢大学动物研究伦理委员会规定的相关指南完成，并符合其要求。牛眼由当地屠宰场慷慨捐赠。
1. 眼球模型
<ol>
	<li>模具的设计与制造13
	<ol>
		<li>根据成年人类眼睛的平均生理尺寸设计眼模型。13</li>
		<li>在眼球模型的眼球与眼睑部件之间留出250 µm的间隙。使用计算机辅助设计（CAD）软件设计相应的模具。</li>
		<li>使用 AutoCAD 或 Solidworks 创建新的 .cad 文件或 .sldprt 文件。建立人眼眼球/眼睑的三维模型。对模型制作模具，并将模具保存为 .stl 文件。</li>
		<li>将 .stl 文件导入 3D 打印机软件（例如，&#160;用于Replicator2的制造文件）。指定打印参数（位置、稀疏度、比例、方向、平滑度， 等等。)13.</li>
		<li>将文件保存为3D打印机可读取的G代码文件。选择用于打印模具的材料，如PLA（聚乳酸）、ABS（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物）、PC（聚碳酸酯）或其组合材料13.</li>
		<li>安装所需材料的耗材。将G代码文件导入3D打印机以读取。打印模具。 
		注意：如果希望眼模型表面更光滑，可选用计算机数控（CNC）机床来制作眼模具。对于CNC模具加工，模具材料不再局限于热塑性塑料，还可扩展至金属、陶瓷以及耐化学腐蚀的聚合物（如聚四氟乙烯）。</li>
		<li>打开与切割钻相连的CNC软件界面。在控制软件界面中，根据先前构建的眼球/眼睑模型模具的前视图、顶视图、侧视图和透视图构建三维模具。选择合适的加工参数（刀具尺寸、基底材料、材料厚度），然后开始切割模具。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用PDMS合成目镜
	<ol>
		<li>使用注射器量取10 ml的PDMS（聚二甲基硅氧烷）基液，转移至15–50 ml离心管中。按PDMS总重量的10% w/v加入弹性体溶液，用搅拌棒充分混匀。</li>
		<li>将PDMS溶液倒入眼球和眼睑模具中，在室温下静置，使PDMS自然固化。&#160;过夜（或至少12小时）以启动聚合反应，并使气泡从聚合物中充分溶解逸出。 
		注意：确保聚二甲基硅氧烷（PDMS）中无残留气泡，以免气泡上浮或膨胀。</li>
		<li>随后，将模具放入75 °C（167 °F）烘箱中加热1小时，或在150 °C（302 °F）下加热5分钟。若需制备较软的凝胶，让PDMS在室温下静置至少48小时，以完成完全聚合。</li>
		<li>将样品放入冰箱冷冻几分钟；这会使PDMS收缩，从而便于从模具中取出样品。使用薄刮刀从模具中取出目镜。</li>
		<li>为将溶液注入眼球与眼睑之间区域，连接一根1/16&#34; x 1/8&#34; 聚四氟乙烯管，内径1/16&#34; 等边接头管连接器，并将其连接至眼睑部件的管孔处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用琼脂糖合成眼球部件 
	注意：眼球部件可使用其他聚合物（如琼脂糖）制备。以下步骤也可经修改后，用于制备多种类型琼脂的眼球部件，例如PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）或SDA（沙保葡萄糖琼脂）。
	<ol>
		<li>制备2%（2 g/100 ml）琼脂糖凝胶时，称取2 g琼脂糖，加入100 ml超纯水，混匀。加热至沸腾（100 ºC），使琼脂糖完全溶解。将溶液冷却5分钟。</li>
		<li>将溶液倒入眼球模具中，在室温下冷却30分钟。用刮勺取出眼球状凝胶块。将眼球琼脂储存于-20℃ °C 冰箱中以备后续使用。进行微生物学研究时，通过高压灭菌和/或紫外照射对眼球模具进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将牛角膜整合到PDMS眼球中 
	注意：本方案已根据 Parekh 的研究进行了调整 等14
	<ol>
		<li>在超净工作台内的无菌条件下进行牛角膜的分离和处理。同一天内获取眼球并进行解剖。</li>
		<li>使用前开启超净工作台10分钟，并用70%乙醇进行消毒。确保所有材料和仪器经133 °C（273 °F）高压灭菌45分钟以达到无菌，并将其放置在距离超净工作台入口不少于4英寸的位置。</li>
		<li>将牛眼浸入盛有稀释聚维酮碘溶液的烧杯中，持续2分钟&#160;用含有磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）的烧杯冲洗眼睛。&#160;用镊子轻轻将眼球置于玻璃培养皿中，角膜面朝上。</li>
		<li>使用钝头解剖剪在巩膜附着点处剪除多余的肌肉和脂肪组织，将废弃组织放入指定用于动物废弃物的无菌烧杯中。</li>
		<li>使用显微剪刀去除眼球的结膜。用无菌纱布包裹眼球，纱布边缘距离角膜缘至少1 cm。</li>
		<li>使用手术刀，在距离角膜缘约2毫米处切开巩膜，切口应浅表，避免穿透下方的脉络膜和玻璃体。使用手术刀或解剖剪小心地沿360°方向延伸切口，操作过程中注意保持角膜自然曲率，避免变形。</li>
		<li>用精细镊子从眼球上取下角膜。用镊子小心去除附着的葡萄膜组织，并用PBS冲洗角膜。</li>
		<li>将角膜置于含有3%胎牛血清的培养基（如Medium 199）中，于31ºC下在无菌容器中保存，以维持组织湿度和细胞营养。</li>
		<li>实验前，将切除的角膜放置在PDMS眼球上，并使用专用夹具将两部分固定在一起。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Blink 平台
<ol>
	<li>眨眼平台的设计与制作 
	注意：眨眼平台由三个功能部分组成：眼模型（见第1节）、齿轮系统和电子系统。
	<ol>
		<li>使用CAD设计并采用3D打印技术制造眨眼平台，方法类似于眼模型的制备（第1.1节）。设计齿轮系统，使其将电机的简单旋转运动转化为镜片的横向和旋转运动。15</li>
		<li>利用小齿轮与齿轮传动机构，将步进电机的旋转运动转化为连接至眼睑部件的小齿轮的横向运动。</li>
		<li>利用共轭齿轮系统，将一个步进电机的单个旋转运动放大为三个（或更多）不同眼球部件的旋转运动。</li>
		<li>对齐两个齿轮系统，一个用于眼睑，另一个用于眼球，确保两者之间的距离保持恒定。组装包含微控制器、电机驱动板和两个电机的电子系统。 
		注意：使用两个步进电机提供旋转动力，该动力通过齿轮系统转化为眨眼动作。</li>
		<li>通过将电机驱动板叠加在微控制器上的方式连接两个步进电机。连接并配置电子元件，使其能够与开源软件产品协同工作。</li>
		<li>编程控制系统，以调节电机参数，如每分钟转数（RPM）、正向旋转圈数、反向旋转圈数以及转动模式。 
		注意：详见补充材料中的&#34;Arduino代码文件&#34;。</li>
		<li>从制造商网站下载系统软件。</li>
		<li>安装软件并打开。编写代码以控制步进电机的预期配置。将系统连接至电源，使电子系统供电，从而让电机按照研究人员设定的方式运行。 
		注意：详见补充材料中的&#34;Arduino代码文件&#34;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与微流控系统联用（人工泪液溶液）
	<ol>
		<li>取合成的眼球和眼睑部件，将其安装到眼模型对应的卡扣件上。将连接有注射器并置于微流控泵上的管路与眼睑部件相连（见第1.2.5节）。试运行平台，检查运动是否稳定一致。</li>
		<li>预充管路，并检查人工泪液溶液（ATS）是否稳定流动。ATS的配方已有文献报道。16</li>
		<li>手动在同一水平面上移动眼模型各部件，使眼球与眼睑接触。将微流控泵的流速设定为所需值。生理条件下的流速设定为1–1.5 µl/min。17</li>
		<li>启动泵和执行器以开始实验。进行药物递送实验时，将载药隐形眼镜放置在眼球部件上。</li>
		<li>使流经液体滴入12孔板中。在预定的时间间隔，使用常见检测方法（如紫外-可见光谱法或荧光法）定量分析物或药物浓度。1,4,18</li>
		<li>对于评估泪液成分在隐形眼镜上沉积的研究，将隐形眼镜放置在&#34;眼球&#34;部件上。收集流经液体，该液体可丢弃。</li>
		<li>在预定时间间隔后，从眼球部件上取下隐形眼镜，并准备用于进一步分析，如共聚焦显微镜检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Phan, C. M., Subbaraman, L. N., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+drug+release+of+natamycin+from+beta-cyclodextrin+and+2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-functionalized+contact+lens+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">In vitro drug release of natamycin from beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-functionalized contact lens materials.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 25, 1907-1919 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中有三个关键步骤需要特别注意：模具的设计与制备（第1.1节）、平台组装（第2.2.1–2.2.3节）以及实验运行的监测（第2.2.4–2.2.7节）。在模具的设计与制备（第1.1节）方面，眼球部件应根据人角膜的尺寸进行设计。然而，可能需要经过多次模具原型的尝试，才能制备出与市售隐形眼镜（CL）完全匹配的眼球部件。此外，当眼球部件与眼睑部件接触时，必须保持250 µm的间距，以确保在存在隐形眼镜的情况下，泪液能够在整个眼模型中顺畅流动。该距离在后续版本中可进行调整，但不应小于150 µm，以留出足够的空间容纳隐形眼镜。平台组装（第2.2.1–2.2.3节）需要特别仔细，以确保在眨眼运动过程中眼球部件与眼睑部件能够充分接触。如果两个部件未能完全接触，则无法有效模拟眼睑闭合及机械摩擦过程。操作人员应观察平台运行数个周期，确认眼球与眼睑部件确实接触，并按预设程序完成摩擦动作。当前平台设计为可持续运行一个月，但在实验过程中，操作人员应每24小时检查一次系统的稳定性（第2.2.4–2.2.7节）。这一点非常重要，因为当前平台不具备温湿度控制功能，环境参数的波动可能导致隐形眼镜干燥。若发生此类情况，应将眼模型置于温湿度可控的环境舱内。此外，在药...

接触镜（CL）领域的两个重要研究方向包括佩戴不适问题以及新型接触镜应用的开发。阐明接触镜不适背后的机制是困扰该领域数十年的难题.8 新型功能性接触镜（CLs）的开发，例如药物递送装置1,3,9 和生物传感器，10-12 是一个日益受到关注的领域，具有巨大的潜在市场。在这两种情况下，都需要复杂的 体外 该模型将提供相关信息，以在开发阶段辅助选择合适的镜片材料或设计特征。然而，目前 体外 用于评估隐形眼镜及其他眼部相关应用的模型相对粗糙且不够精密。传统上， 体外 CL研究中用于评估泪膜沉积或药物递送的实验通常在静态的大体积小瓶中进行，这些小瓶含有固定的液体体积，远超过生理条件下的泪液量。此外，这种简单模型缺乏自然泪液流动和眨眼反射，而这两种因素均为眼表环境的关键特征。
一种复杂且具有生理相关性的眼部模型的开发 &#34;模型&#34; 将需要多学科的方法，并需要大量的 体内 验证。基于这些原因，我们研究的基本框架 体外 眼模型具有高度的多功能性，可通过未来的升级和调整持续改进。迄今为止，该模型能够模拟泪液体积、泪液流动、机械磨损和空气暴露。目标是构建一个 体外 能够提供有意义结果的模型，具有预测性且可相互补充 体内 和 离体 观察。

<table><tbody><tr><td>Arduino Uno R3（Atmega328 - 已组装）</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>开发板</td></tr><tr><td>步进电机</td><td>Adafruit</td><td>324</td><td>电机及电机驱动扩展板</td></tr><tr><td>等臂联轴器 1.6 mm 1/16&quot;</td><td>VWR</td><td>CA11009-280</td><td>50 个管路连接件</td></tr><tr><td>PT/SIL 管路 1/16&quot;×1/8&quot;</td><td>VWR</td><td>16211-316</td><td>每箱 50 英尺</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 太阳能电池封装材料</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，1-A型，低电渗扩散（EEO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-25G</td><td></td></tr><tr><td>PHD UltraTM</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703006</td><td>微流控泵</td></tr><tr><td>牛角膜</td><td>Cargill, Guelph/ON（加拿大安大略省圭尔夫）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systèmes</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>3D 打印</td><td>滑铁卢大学 - 3D 打印中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>常规解剖工具</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>角膜培养基储存液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>加入培养基中，终体积占比 3%</td></tr></tbody></table>

一种的开发 体外 用于测试隐形眼镜的眼部平台

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

目前， 体外 用于药物递送的隐形眼镜（CLs）评估通常在大容量小瓶中进行，1-6 无法模拟生理泪液体积。7 传统模型还缺乏自然泪液流动成分和眨眼反射，而这两种因素都是眼表环境的关键特征。本研究描述了一种新型模型的开发，该模型采用独特的两部分设计，包括眼球部分和眼睑部分，能够模拟生理状态下的泪液体积。该模型通过三维打印模具（聚四氟乙烯或特氟龙模具）制备，可用于多种聚合物材料（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）和琼脂）制作眼模型。对眼球部件进一步改进，例如整合离体的人或动物角膜，或人角膜构建物，将可实现更复杂的 体外 眼部研究。该平台集成了商用微流控注射泵，以模拟生理条件下泪液的分泌。通过两个机械执行器实现空气暴露和机械磨损，其中一个执行器使眼睑部件横向移动，另一个使眼球-眼模组件做环形运动。该模型已用于评估隐形眼镜的药物递送性能以及泪液成分在隐形眼镜上的沉积情况。

从机械加工和3D打印获得的合成眼模如图1所示。这些模具可与多种聚合物（如PDMS和琼脂糖）配合使用，以制备具有理想特性的镜片。眼模型平台与微流控注射泵的组装示意图如图2所示。该平台通过眼球部件的旋转模拟机械磨损，并通过眼睑部件的侧向开合运动模拟空气暴露。泪液通过微流控泵以设定的流速注入眼睑，流出的液体可收集于12孔板中。
牛晶状体的解剖步骤以及将其安装到PDMS目镜上的过程如图3所示。首先将眼球周围的多余组织分离并弃去，随后去除结膜。角膜的移除始于靠近角膜缘处的巩膜切口。图4展示了可用于各种体外分析的不同类型目镜。图中所示的已安装眼球部件由PDMS、琼脂以及安装在PDMS眼球部件上的离体牛角膜制成。
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当前 体外 用于评估接触镜（CLs）及其他眼部相关应用的模型严重受限。本研究所提出的ocular平台可模拟生理泪液流动、泪液体积、空气暴露以及机械磨损。该系统具有高度通用性，可应用于多种 体外 使用CLs进行分析。

目前，用于药物递送的接触镜片（CLs）体外评价通常在大容量小瓶中进行1-6，但这种方法无法模拟……

该体外眼模型的总体目标是模拟生理泪液量、自然泪液流动、空气暴露以及眨眼过程中产生的机械磨损，以评估隐形眼镜的性能。该方法有助于解答隐形眼镜领域中的关键问题，例如预测隐形眼镜及相关眼科器械在眼部的使用表现。该技术的主要优势在于提供了一种简单且经济高效的体外模型，可同时模拟多种眼部环境因素，而此类模型目前尚不可得。尽管该方法旨在用于评估隐形眼镜的性能，但也可用于测试其他眼科系统，例如谷歌和诺华公司目前正在开发的智能葡萄糖隐形眼镜。对该方法进行可视化演示，有助于理解眼模型的工作原理及其在各种研究场景中的有效应用。该模型的眼睑和眼球部分由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。首先，准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）。使用注射器将10毫升PDMS基液转移至15或50毫升离心管中。然后称取并加入相当于基液体积10%的固化剂溶液，充分混合。使用玻璃棒充分搅拌溶液。然后将PDMS溶液倒入眼球和眼睑模具中。小心填充模具，避免混入气泡。将PDMS在室温下静置过夜，使其充分聚合，同时模具中的微小气泡将逐渐消散。次日，将模具转移至设定为75摄氏度的烘箱中加热一小时。随后，将模具放入-80摄氏度的超低温冰箱中冷冻数分钟。PDMS 会略微收缩。然后使用刮刀将样品从模具中取出。接着，将一根 PTFE 管连接到等臂三通接头，并将其固定到眼睑部件上。此管道用于在样品之间引入流体。现在使用琼脂糖或类似的琼脂材料制备眼球部件。首先，配制100毫升2%琼脂糖溶液。当溶液冷却至约 40 摄氏度时，将其倒入眼球模具中。多余的琼脂可冷冻以备后续使用。在室温下静置冷却 30 分钟后，用刮勺取出眼球状凝胶块。进行微生物学研究时，使用高压灭菌器或紫外照射对眼球模具进行灭菌。在生物安全柜中通风运行至少10分钟后，用70%乙醇酒精对表面进行消毒。此操作需在层流罩内的无菌条件下对牛角膜进行。在摘取眼睛后立即进行解剖。仅使用经过高压灭菌的器械，并且在工作区前缘四英寸范围内不得放置任何物品。开始操作时，先将牛眼浸入0.5%聚维酮碘溶液中两分钟。然后将眼球从聚维酮碘溶液中取出，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗眼球。现在使用镊子将眼球轻柔地转移至玻璃培养皿中，角膜面朝上。使用钝头解剖剪在巩膜附着点处剪除多余的眼外肌和脂肪组织。将多余的组织弃置于指定用于动物废弃物的无菌烧杯中。接下来，使用显微剪刀去除眼球的结膜。用无菌纱布包裹眼球，但纱布边缘应距离角巩膜缘至少一厘米。正确执行此步骤对成功至关重要。然后使用手术刀，在距离角膜缘约两毫米处切开巩膜，以避免穿透下方的脉络膜和玻璃体。接下来，小心地将切口围绕眼球完整延伸360度，同时避免使角膜偏离其自然曲率。现在，使用精细镊子从眼球上取下角膜。执行此步骤时需格外小心。然后，仔细清除角膜上附着的葡萄膜组织（如有残留），并用 PBS 冲洗角膜。将角膜置于含有 3% 胎牛血清的培养基（如 M199

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

的发展<em&gt;体外</em&gt;眼平台，试验用隐形眼镜

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