体外 通过梯度离心法拆解甲型流感病毒衣壳

本研究中速度梯度离心的总体目标是在模拟内吞环境的条件下分析甲型流感病毒衣壳，该环境是病毒进入细胞过程中所经历的。该方法有助于解答关于甲型流感病毒衣壳在细胞进入过程中如何解离的关键问题，例如弱酸性pH对衣壳稳定性产生的特定影响。该技术的主要优势在于能够在明确的实验条件下对甲型流感病毒脱壳过程进行定量分析。

除了有助于揭示甲型流感病毒脱壳过程的启动机制外，该方法还可应用于其他具有类似脱壳机制的包膜病毒的研究。本次实验操作由我实验室前成员 Firat Nebloglu 进行演示。根据文本方案配制好储备缓冲液和试剂后，针对每种待测的 pH 条件，通过混合 9 毫升 1 摩尔氯化钠、6 毫升 10% NP40、2.4 毫升 25 倍蛋白酶抑制剂储备液以及 9 毫升双蒸水，配制去污剂缓冲液母液。

然后针对每种 pH 条件，将 4.4 毫升主混合液用移液器转移至 50 毫升锥形管中。对于 pH 值高于 5.8 的条件，向管中加入 0.6 毫升相应 pH 值调节的 500 毫摩尔 Tris 储存液。对于 pH 值为 5.8 及以下的条件，向管中加入 0.6 毫升相应 pH 值调节的 500 毫摩尔 MES 储存液。

配制5毫升缓冲液，其中含有300毫摩尔氯化钠、2倍蛋白酶抑制剂、60毫摩尔Tris，用双蒸水调节至pH 7.4。该缓冲液将作为无去垢剂的对照梯度缓冲液。接下来，将5毫升50%甘油储备液分别加入5毫升含去垢剂和不含去垢剂的缓冲液混合物中，得到六种不同的25%甘油溶液。

使用 pH 试纸验证 pH 值。通过将 50% 甘油储备液与蒸馏水按三比七的比例混合，配制 15% 甘油溶液。使用 5 毫升注射器和针头，向 6 支超透明离心管中各加入 3 毫升 15% 甘油溶液。

每步操作后均需用双蒸水清洗针头。使用5毫升注射器和长针头，小心地将3.4毫升25%甘油溶液注入15%甘油层下方，注意避免混合两层液体。两层之间将形成清晰可见的界面。

对所有六种条件重复此步骤，使用相应 pH 值调整的甘油溶液进行测试。接下来，在 II 级生物安全柜中，取 1 毫升澄清的、稀释后的含甲型流感病毒的尿囊液，轻柔地覆盖在甘油梯度上。将试管转移至转子吊桶中，对称位置的试管配平后，小心放入预冷的 SW-41 超速离心转子中。

在 2100 rpm 和 12 摄氏度条件下离心 150 分钟。离心结束后，使用洁净的巴斯德吸管和抽吸装置小心移除两层甘油。然后加入 40 毫升 1X 非还原性 LDS 样品缓冲液，通过反复吹打充分重悬沉淀，再将样品转移至 1.5 毫升微量离心管中。

进行SDS-PAGE时，将所有样品在95摄氏度加热10分钟。将20微升溶解后的沉淀物上样至预制的梯度Bis-Tris迷你胶，并在1X MOPS SDS电泳缓冲液中以200伏特电压运行1小时。随后将凝胶在固定液中孵育1小时。

用清水冲洗一至两次，然后在15厘米的细胞培养皿中加入足量的胶体考马斯亮蓝溶液，在室温下轻轻摇动，染色过夜。用双蒸水脱色，每隔15至20分钟更换一次液体，直至凝胶背景变得清晰。将凝胶置于双蒸水中，于4摄氏度保存，直至进行条带定量扫描。

最后，以高分辨率扫描凝胶，并使用市售的定制软件对蛋白质条带强度进行定量分析。从各条带附近的区域扣除背景信号，并将数值归一化至无去垢剂对照组的数值。在本实验中，来源于澄清羊水的X31在pH 7.4至5.0范围内进行速度梯度离心，随后通过SDS-PAGE进行分析。

在梯度中不含去污剂的情况下，完整的病毒颗粒会沉淀，这反映在考马斯亮蓝染色凝胶上出现的特征性条带模式，即 HA、NP 和 M1 的条带。当在底部甘油层中加入 NP40 后，病毒包膜（包括 HA、NA 和 M2）被溶解，仅病毒核心在超速离心过程中沉降到沉淀中。当起始 pH 低于 6.5 时，M1 逐渐从沉淀组分中丢失，在 pH 5.8 至 pH 5.4 范围内达到最低值。

当 pH 低于 5.8 时，病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）发生解离，因而从沉淀中丢失。通过对分析的蛋白条带观察，揭示了基质蛋白 M1 层解离和 vRNP 束解聚的两个不同 pH 阈值，分别为 pH 6.5 和 pH 5.8。在进行该操作时，需注意根据不同的甲型流感病毒毒株或突变体，可能表现出不同的解离特性。

采用此方法后，可进一步进行电子显微镜等其他方法，以获得更多信息，例如分离的流感病毒衣壳的结构。