单探针的应用：常温条件下的质谱成像与单细胞分析

本方法的总体目标是构建一种微尺度采样装置——单探针（Single-probe），用于在常温常压条件下通过质谱技术分析活体单细胞，并实现对生物组织的高空间分辨率常温质谱成像。该方法有助于解答生物与药物研究中的关键科学问题。

例如，活体单个细胞中存在哪些分子，以及这些分子在组织中的分布情况如何。该技术的主要优势在于，单探针是一种多功能装置，既可用于活体单细胞分析，也可用于高分辨率的常温质谱成像实验。尽管该方法可用于分析单细胞和组织，但它也可应用于其他需要微尺度取样的体系，例如化学物质的微区分析以及活体微菌落和生物膜的研究。

与我共同演示该操作的是我实验室的博士后 Wei Rao。将感兴趣的小鼠完整器官置于小型塑料孔板的中央，加入包埋剂，使器官完全浸没，液面高度约为 10 mm。

立即将组织放入液氮中进行速冻。制备小鼠组织切片时，取冷冻的小鼠器官，在温控冷冻切片机中将其解冻至15摄氏度。用约500微升组织包埋剂将组织固定在钢制底座上，并将其安装到冷冻切片机的切片支架上，使待切面朝向刀片，以获得所需的切片方向。

将组织切成12微米厚度。然后将切好的组织片放置在聚碳酸酯显微镜载玻片上，在室温下干燥30分钟。获取细胞样品，例如1毫升HeLa细胞悬液，加入到标准的10厘米细胞培养皿中的9毫升完全细胞培养基中。

将细胞在细胞培养板中于37摄氏度、5% CO2条件下培养两至三天，直至细胞生长表面覆盖率达到70–80%。在细胞培养板中进行细胞传代。具体操作为：吸除生长培养基，并用5 mL 1×磷酸盐缓冲液冲洗细胞。

使用无菌吸头移除 PBS，并加入 2.5 mL 胰蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟，使细胞从培养皿上脱落。加入 7.5 mL 完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，然后将细胞均匀重悬。为了准备单细胞质谱（SCMS）实验的细胞样品，首先将独立的微型盖玻片放入 12 孔板的各个孔中。

然后，向孔中加入 1.8 mL 细胞培养基和 0.2 mL 细胞悬液。在 37 摄氏度、5% CO2 环境中孵育约 24 小时前，轻轻晃动培养板，使细胞轻柔混匀。对培养的细胞进行药物处理时，将药物化合物溶液加入 12 孔细胞培养板中。

将双孔石英毛细管放入激光显微拉针仪中，拉制双孔石英微针。初始参数设置如下：加热值设为400，灯丝值设为3，拉速设为80，延迟设为150，拉力设为250。切割拉制后的尖端，使另一端保留约5 mm未拉制的双孔石英毛细管。

截取一段80 mm的熔融石英毛细管作为供溶剂用的毛细管，然后将其插入双孔石英针扁平端的一个孔中。用火焰拉制熔融石英毛细管制成纳米电喷雾电离（nanoESI）发射器，切割至7–10 mm长，并将其插入双孔石英针扁平端的另一个孔中。

在双孔石英针的平头端涂抹少量紫外光固化树脂。使用LED紫外灯照射约20秒，使树脂固化，以固定供溶剂毛细管和纳米电喷雾发射器。接下来，将标准显微镜载玻片沿长边方向纵向切成两半。

然后，将单探针放置在玻片的一端，使纳米电喷雾发射器朝外。在单探针的主体上涂抹普通环氧树脂，将其固定在玻片上，随后静置过夜使其固化。该系统包括一个定制的质谱仪离子源接口法兰，以及一个铝制光学平台，平台上安装有USB数字显微镜、微型手动XYZ平移台和电动XYZ平移台系统。

按照文本方案中的描述，改造质谱仪的离子源接口法兰，并制作数字体视显微镜的支架。将改装后的数字体视显微镜、USB 数字显微镜、带柔性夹持器的微型手动 XYZ 平移台以及电动 XYZ 平移台系统安装到铝制光学基板上。使用柔性夹持器固定附有单探针的载玻片。

然后，将单探针装置连接到质谱仪上。调节可调式夹具和微型XYZ位移台，使单探针的发射端位于质谱仪进样口前方。在室温下解冻样品切片，并将其放置在单探针下方的电动XYZ平移台系统上。

通过更改控制软件中的坐标来调整样品位置。使用注射器以适当的流速泵入采样溶剂。然后，施加电离电压。

调节单探针的高度，使其刚好位于样品表面之上，并能够进行代谢物的表面提取。小心地提升Z轴载物台，然后使用USB数字显微镜监测单探针尖端与组织表面之间的距离变化。设置在样品目标区域进行光栅扫描的参数。

对于本文所示的小鼠肾脏切片，使用每秒10微米的光栅扫描速度，以及每条线之间20微米的间距。在样本中对目标区域设置光栅扫描参数。对于本文所示的小鼠肾脏切片，使用每秒10.0微米的光栅扫描速度，以及每条线之间20微米的间距。

建立一种从质谱仪自动采集质谱（MS）数据的方法。对小鼠肾脏样本进行高分辨率质谱成像（MSI）时，采用60,000的质量分辨率、5 kV正离子模式、1次微扫描、最大注入时间150毫秒，并开启自动增益控制。启动MSI数据采集，然后按照文本方案中所述方法从原始质谱文件构建质谱图像。

根据质谱成像（MSI）的说明设置单探针系统，并调节溶剂流速。用 PBS 清洗贴壁生长在微型盖玻片上的培养细胞，以去除培养基和细胞外药物成分。然后将含有细胞的玻片放置于电动 XYZ 平移台系统上，进行实验。

将数码体视显微镜对准样品上方，聚焦于单探针的尖端，以在分析过程中监测细胞穿刺情况。利用单探针侧边的USB数码显微镜，监测单探针上纳米电喷雾电离（nanoESI）发射器的工作状态。使用电动XYZ载物台控制程序和数码体视显微镜定位目标细胞，并精确地将单探针尖端置于样品上方。

在将单探针尖端插入细胞之前，开始质谱数据采集。降低含有细胞的培养板，使单探针尖端从细胞中抽出。最后，让溶剂持续流动约三分钟，以彻底冲洗单探针。

对小鼠肾脏切片进行了常压质谱成像，可检测到组织表面存在的大量分子。绘制了多种分子在组织表面的空间分布及相对丰度。通过观察质谱数据中特征结构的 sharp transitions，实现了8.5微米的空间分辨率。

制备具有尖锐尖端和开放通道的单探针对于单细胞分析至关重要。需要使用显微镜来定位目标细胞并监测细胞穿刺过程。质谱信号的变化也提供了额外信息，可用于确认细胞穿刺的成功。

已从活体单细胞中检测到大量分子。在抗癌药物研究中，通过对照细胞实验可显示抗癌药物处理前后的差异。观看本视频后，您应能充分理解单探针的制备方法，以及该装置如何用于单细胞质谱分析和生物组织的常温质谱成像。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为需要详细的指导来制备单探针装置、搭建整个系统以及操作相关仪器。一旦掌握，便可对大量细胞连续进行单细胞分析，且每次分析耗时不到三分钟。

完成一次常压质谱成像实验可能需要数小时，具体时间取决于样品尺寸、空间分辨率以及所使用的质谱仪。在实施该实验过程中，需牢记制备高质量单探针是关键步骤。此外，仪器的调谐与操作对于成功开展实验至关重要。

可参照本文所述类似流程开发其他方法。例如，可将试剂加入样品溶剂中，进行反应性单细胞分析和常压质谱成像，以增强样品中分子的检测效果。该技术一经建立，便为在常压条件下开展单细胞分析和质谱成像研究的科研人员开辟了新的途径。

该技术可潜在地用于细胞生物学研究、药理学研究以及临床检测。请注意，操作尖锐的石英毛细管和紫外固化环氧树脂可能存在危险，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套和紫外防护眼镜。