Name: 单探头的应用:根据环境条件质谱成像和单细胞分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 了解单探头技术在常压质谱成像和活细胞单细胞分析中的应用。该方法利用微型多功能装置实现高分辨率生物样品分析，无需复杂样品制备即可研究活细胞和组织中的分子分布。

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作者感谢Laskin博士（美国西北太平洋国家实验室）分享了电动载物台控制软件和质谱成像可视化程序。我们还感谢Mao博士（俄克拉荷马大学）提供了小鼠器官样本，以及Chad E. Cunningham先生（俄克拉荷马大学）在机械加工和电子方面提供的帮助。本研究得到了俄克拉荷马大学诺曼校区研究委员会、美国质谱学会研究奖（由Waters Corporation资助）、俄克拉荷马科学技术发展中心（资助号HR 14-152）以及美国国立卫生研究院（R01GM116116）资助项目的资助。

动物的使用与福利应遵循经机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的《NIH 实验动物护理和使用指南》。小鼠组织样本由合作者 Chuanbin Mao 博士提供。
1. 小鼠组织切片制备
<ol>
	<li>放置一个完整的小鼠目标器官（脑、肾、肝） 等等。) 注入小塑料孔的中心（例如，12孔细胞培养板），并用包埋剂浸没至约10 mm高度。确保包埋剂中无气泡产生，且器官处于预期的方向即，矢状，冠状 等等。).</li>
	<li>立即将组织放入液氮中进行速冻。如需长期保存，应将冷冻样品置于 -80 °C 超低温冰箱中储存。</li>
	<li>取冷冻的小鼠器官，在温度可控的冷冻切片机中解冻至 -15 °C。</li>
	<li>用约500 µl包埋剂将组织固定于钢制底座上，然后置于冷冻切片机切片托架，使组织处于所需切片方向对准刀刃。</li>
	<li>将组织切成12 µm厚度。将切好的组织切片置于聚碳酸酯显微镜载玻片上，室温下干燥30分钟。如需长期保存，将冷冻载玻片存放在-80 °C冰箱中。</li>
</ol>
2. 细胞培养
注意：细胞培养在生物安全柜（生物安全二级）中的无菌条件下进行。以 HeLa 细胞系作为模型系统，细胞使用完全培养基，按照以下常规方案进行培养：
<ol>
	<li>将试剂（即，胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）和细胞培养基）预热至 37 °C。 
	注意：细胞培养基含有无机盐、氨基酸、维生素等成分。有关成分的完整列表，请参考生产商提供的配方。</li>
	<li>取细胞样品（例如，1 ml HeLa 细胞悬液），将其加入标准 10-cm 细胞培养皿中的 9 ml 完全细胞培养基中。初始细胞密度约为 0.5 × 106 细胞/ml。将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 2–3 天，直至细胞培养皿表面有 70–80% 被细胞覆盖。记录每次传代的细胞代数。</li>
	<li>在细胞培养皿中进行细胞传代（即，细胞分种）。
	<ol>
		<li>吸除生长培养基，用 5 ml 1× PBS 清洗细胞。使用无菌吸头去除 PBS，然后加入 2.5 ml 胰蛋白酶（0.25%）于 37 °C 孵育约 5 分钟，使细胞从培养皿表面脱落。 
		注意：实际胰蛋白酶处理时间需根据所购自生产商的具体产品进行优化。处理时间不足会导致细胞仍附着于培养皿，而处理时间过长则会引起细胞死亡。</li>
		<li>加入 7.5 ml 完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，随后将细胞均匀重悬（总体积 10 ml）。将所得细胞悬液用于后续培养（步骤 2.2）或 SCMS 样品制备（步骤 2.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为 SCMS 实验准备细胞样品。
	<ol>
		<li>将单个微型盖玻片放入 12 孔板中，每孔加入 1.8 ml 细胞培养基和 0.2 ml 细胞悬液。</li>
		<li>轻轻晃动培养板使细胞均匀混合，并在 37 °C、5% CO2 环境中孵育约 24 小时。如需对培养细胞进行药物处理，可将药物化合物溶液（例如，溶于 DMSO（二甲基亚砜））加入 12 孔细胞培养板中。 
		注意：最终药物浓度（例如，10 nM、100 nM、1 µM 和 10 µM）及处理时间（例如，4 小时）应根据具体研究目的进行调整。细胞将附着于微型盖玻片上，可用于后续 CSMS 实验（步骤 6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单探针制备
<ol>
	<li>将双孔石英毛细管（内径（I.D.）127 µm，外径（O.D.）500 µm）放入激光微电极拉制仪中，拉制双孔石英针。可使用以下参数作为起始值：加热（Heat）= 400，拉力（Fil）= 3，速度（Vel）= 80，延迟（Del）= 150，拉力持续时间（Pul）= 250（所有单位均为仪器制造商单位）。确保拉制出的双孔石英针具有锥形尖端，以获得最佳探针性能。将拉制后的尖端切断，使另一端保留约 5 mm 未拉制的双孔石英毛细管。
	 
	注意：激光拉制仪的实际参数应根据仪器的具体条件进行优化。</li>
	<li>截取一段约 80 mm 的熔融石英毛细管（内径 40 µm，外径 105 µm）作为溶剂供给毛细管，并将其插入双孔石英针扁平端的一个孔中。</li>
	<li>截取一段约 40 mm 的熔融石英毛细管（内径 40 µm，外径 105 µm），用剃刀从其中部去除约 5 mm 的聚酰亚胺涂层。使用丙烷火焰快速加热并拉伸该熔融毛细管，制成具有细锥形的纳米电喷雾电离（ESI）发射器。截取一段纳米ESI发射器（长约 7–10 mm），将其插入双孔石英针扁平端的另一个孔中。也可使用激光拉制仪制备细锥形。</li>
	<li>在双孔石英针的扁平端滴加少量（约 1–2 µl）紫外光固化树脂，使用LED紫外灯照射约 20 秒以固化树脂，从而固定溶剂供给毛细管和纳米ESI发射器。将各部件组装成单探针的步骤如图1a所示。</li>
	<li>将标准显微镜玻片（1&#34; × 3&#34;）沿长度方向切成两半。将单探针放置在玻片一端，使纳米ESI发射器朝外。在单探针主体上涂抹普通环氧树脂，使其牢固固定在玻片上（图1b）。静置过夜使其完全固化。将制备好的单探针连接至集成式单探针装置（图1c），该装置如图1d所示连接至质谱仪。</li>
</ol>
4. 构建集成式单探针质谱装置
<ol>
	<li>改造质谱仪的离子源接口法兰，并制作数字体视显微镜的支架（可调节位置和高度）（图1e和图1f）。
	<ol>
		<li>在离子源接口法兰上钻两个孔，用于固定铝制光学板。制作滑轨装置和高度调节杆（连接至XY平台以实现精细位置调节），使数字体视显微镜系统能够安装在铝制光学板上（图1e）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将改造后的数字体视显微镜、USB数字显微镜、带柔性夹具的微型手动XYZ平移台以及电动XYZ平移台系统安装到铝制光学板上，该光学板固定在质谱仪定制的离子源接口法兰上（图1c和图1f）。使用柔性夹具固定装有单探针的载玻片。</li>
	<li>将单探针装置连接至质谱仪（图1f）。调节柔性夹具和微型XYZ平移台，使单探针的发射端位于质谱仪进样口前方。使用位于单探针侧边的USB数字显微镜（视角可调）放大观察单探针尖端或纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射端，同时利用位于单探针上方的数字体视显微镜（高度可调）观察细胞和探针尖端。 
	注意：通过使用相应的离子源法兰，该集成式单探针系统可与任何配备常压电离源的其他类型质谱仪联用。</li>
</ol>
5. 常温质谱成像
<ol>
	<li>在室温下解冻样品切片，将其放置于单探针下方的电动XYZ平移台系统上。通过调节控制软件中的坐标来调整样品位置。</li>
	<li>使用注射器以适当速率泵入采样溶剂（例如，0.2 µl/min），并施加电离电压（例如，5 kV）。采样溶剂的选择具有灵活性，常见的包括甲醇：水（9:1）和乙腈。纳米电喷雾电离发射器的死体积估计约为 ~3 nl，探针与表面接触至观测到离子信号之间的时间通常小于 1 秒 15. 
	注意：定制的离子源接口法兰可通过鳄鱼夹将质谱仪的电离电压传递至导电接头。电离电压随后通过导电接头传导至毛细管内的溶剂及单探针通道，并施加于纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射端，以实现待测分析物的离子化。连接鳄鱼夹与导电接头时，务必确保电离电压处于关闭状态。</li>
	<li>调节单探针的高度，使其刚好位于样品表面之上，能够进行代谢物的表面提取。小心地抬升Z轴载物台，然后使用单探针侧边的USB数字显微镜监测单探针尖端与组织表面之间的距离变化。在调节高度过程中实时监测质谱信号的变化，当观察到离子信号由溶剂背景转变为组织代谢物信号时，停止抬升Z轴载物台。</li>
	<li>重复步骤 5.3 三次，以在阶段控制程序中设置三个不同的点，用于自动表面平整调整。将单探针的尖端置于样品表面上相距约 10 mm 的三个不同位置。通过按上升和下降图标进行高度调节，并将这三个点的位置锁定在 &#34;规划方法&#34;.</li>
	<li>使用该程序设置在样品目标区域进行光栅扫描的其他参数。对于本实验所展示的小鼠肾脏切片，采用10.0 µm/sec的光栅扫描速度和20 µm的线间距。电动载物台系统的最小移动步长为0.1 µm。单探针尖端与组织之间的距离来自步骤5.3。</li>
	<li>建立一种从质谱仪自动采集质谱（MS）数据的方法。针对小鼠肾脏样本进行高分辨率质谱成像（MSI）时，采用以下参数：质谱分辨率60,000（m/Δm），正离子模式约5 kV，微扫描次数1次，最大离子注入时间150毫秒，自动增益控制（AGC）开启。所有采集的质谱数据代表质谱图像的每一行，每条谱图具有相同数量的扫描次数，且各次扫描之间的时间间隔均匀，表明所生成图像的像素尺寸分布均匀。</li>
	<li>启动 MSI 数据采集。启动质谱仪的质谱采集序列，然后启动 XYZ 控制程序的光栅扫描序列。
	<ol>
		<li>例如，在此处使用的 MS 数据采集程序中，前往 &#34;序列设置&#34;，选择 &#34;新序列&#34;，生成一组新序列文件，编号从01到X，其中X为获取目标质谱图像所需的行数，然后按下 &#34;运行序列&#34;.</li>
		<li>使用自制的电子设备，使软件能够产生一个触点闭合信号，以触发质谱仪进行数据采集。电路图见补充图图 S1）作为参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的质谱成像（MSI）可视化软件，从原始质谱文件构建质谱图像。例如，当使用美国西北太平洋国家实验室（PNNL）Laskin 团队开发的软件包时 17，执行以下步骤。
	<ol>
		<li>点击 &#34;浏览文件&#34; 选择从MSI实验中获得的第一个文件。在下方指定文件的起始和结束位置 &#34;线条数量&#34; 选择一个范围 m/z 质谱图像范围的数值 &#34;输入质荷比范围&#34;.</li>
		<li>按压 &#34;开始&#34; 按钮以启动图像生成过程。一旦生成质谱图像，单击 &#34;保存图像&#34; 在……下方 &#34;工具栏&#34; 将图像存储在计算机中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 原位 活体 SCMS
<ol>
	<li>按照质谱成像（MSI）的说明设置单探针系统。调整溶剂（例如， 甲醇/H2O 或乙腈）流速（例如，约25 nl/min）。</li>
	<li>用 PBS 清洗贴壁生长在微型盖玻片上的培养细胞，以去除培养基和细胞外药物成分。将含有细胞的玻片置于电动化 XYZ 平移台系统上进行实验。 
	注意：也可使用新鲜的细胞培养基（不含胎牛血清）冲洗培养的细胞，此方法观察到的离子抑制效应较弱。此外，在环境温度（约 20 °C）显著低于培养温度（37 °C）的实验过程中，细胞可存活更长时间。不同研究中所使用的药物类型、溶液浓度及处理时间各不相同。</li>
	<li>将数码体视显微镜（位于样品上方）聚焦于单探针的尖端，以在分析过程中监测细胞穿刺情况。使用USB数码显微镜（位于单探针侧面）监测单探针上纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器的工作状态。</li>
	<li>使用电动XYZ载物台控制程序和数字体视显微镜（位于细胞上方）定位目标细胞，并将单探针尖端精确置于样品上方。在单探针插入细胞前，开始质谱数据采集。
	<ol>
		<li>使用高分辨质谱仪进行质谱分析时，参考以下参数：质量分辨率 100,000 (m/Δm)，正负离子模式下约 3 kV，1 次微扫描，最大注入时间 150 毫秒，AGC 模式开启。通过点击自动采集质谱图 &#34;开始&#34; 在质谱数据采集程序中。</li>
		<li>点击图标抬升电动Z轴，以穿透细胞膜并持续记录细胞产生的质谱信号。探针插入与质谱信号检测之间通常存在1-2秒的时间延迟。作为细胞膜穿透的另一确认依据，可在穿透细胞膜时观察到质谱信号的显著变化。细胞内化合物的质谱信号通常可持续约15-20秒，随后显著减弱。</li>
		<li>降低含有细胞的培养板，将单探针尖端从细胞中抽出。通常需要 &#60;细胞化合物的离子信号需约15秒降至接近噪声水平。随后让溶剂持续流动约3分钟，以彻底冲洗单探针。在此期间，调整电动XYZ载物台系统，定位下一个待分析的细胞。每个细胞的实验过程约需3分钟完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我们声明，本文所述工作不存在任何利益冲突。

单探针是一种多功能装置，可用于质谱成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验。单探针装置（包括平移台系统、显微镜、离子源接口法兰） 等等。设计为可灵活适配现有质谱仪的附加组件。单探针装置与传统电喷雾电离（ESI）离子源之间的快速切换可在一分钟内完成。原则上，通过使用适当的离子源接口法兰，单探针装置可适配于其他各类质谱仪。此外，单探针装置可使用含有多种试剂的采样溶剂，用于反应性质谱成像（reactive MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验，显著增强了对更广泛生物分子的检测能力。除动物组织和细胞系外，单探针还可用于分析植物等其他生物体系。因此，在相同的实验装置和相似的操作培训条件下，同一仪器和同一操作人员可开展多种研究，从而以最少的培训时间和仪器成本实现高效且多用途的实验。
单探针质谱技术的关键组件是探针本身。单探针的质量对其性能具有显著影响，很大程度上决定了质谱成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）实验的质量。在制备单探针时，务必确保双通道管内的毛细管被牢固粘接，以避免实验过程中发生溶剂泄漏。使用尽可能少的紫外固化环氧树脂至关重要，以防止探针制备过程中堵塞孔口和毛细管。
单探针已用于对生物样本进行高空间分辨率和高质量分辨率的常压质谱成像 15环境型质谱成像相较于非环境型方法的主要优势在于，样品前处理步骤极简，且无需真空采样环境，从而使样品能够以接近其天然状态的形式进行分析 8大多数其他常压质谱成像技术面临的主要障碍之一是空间分辨率不足 1与基于解吸的质谱成像技术（如 DESI 和 LAESI）相比，单探针的小尺寸尖端可在较小区域内实现更稳定且高效的表面液体微萃取，从而获得 8.5 µm 的高空间分辨率，该分辨率在环境质谱成像技术中属于最高水平之一 15此外，调整采样溶剂的组分可为实验提供额外的灵活性。例如，含有试剂的采样溶剂（例如，双阳离子化合物）已被用于开展反应性质谱成像实验，使得每次实验所鉴定的代谢物数量显著增加 20单探针的另一个优势在于其一体化设计，可在整个数据采集过程中提供便捷的操作体验。由于探针尖端与组织表面之间的距离对离子信号强度和稳定性极为敏感，因此获得平整的组织切片，并进行表面平整调节以最小化距离差异，是实现高质量质谱成像（MSI）实验的关键。因此，单探针MSI技术不适用于对表面不平整样品进行高空间分辨率质谱成像。
除了制备高质量的探针外，仔细调试仪器对于成功的质谱成像（MSI）实验也至关重要。在所有调试步骤中，调节单探针尖端与组织切片表面之间的高度是最关键的一步。调节探针高度时，应泵入采样溶剂并开启电离电压，以便仅能观察到溶剂背景离子信号。随后，在通过电动Z轴平台缓慢降低探针与样品表面距离的同时，密切监测质谱信号的变化，直至观察到强而稳定的来自组织切片的离子信号；此探针高度将用于实验过程中MSI数据的采集。此外，优化的溶剂流速对MSI实验同样至关重要。应在已优化的探针高度条件下调节流速，确保组织表面无溶剂扩散现象即，流速过高）或纳米电喷雾发射器内部产生气泡（即，流速过低。
单探针是一种用于生物分析的多功能设备。除了质谱成像实验外，它还能够进行接近实时的 原位 利用SCMS从活体真核细胞中解析详细的化学信息16，这与其他基于真空的单细胞质谱技术（如MALDI）相比具有显著优势10 和 SIMS21）。探针尖端尺寸微小，可插入活体真核细胞内，直接提取并离子化胞内化合物，进而进行即时质谱分析。类似地，含有试剂的采样溶剂（例如，双阳离子化合物）可用于SCMS实验，从而以前所未有的方式在活体单细胞中检测更广泛的细胞组分（正在进行的研究，数据未展示）。尽管实时分析能够提供活体单细胞的化学图谱，但由于探针穿透细胞膜并提取细胞内容物，受测细胞在实验后将死亡，表明单探针SCMS技术仍属于破坏性方法。此外，单探针中的探针尖端和纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器对于经验不足的操作者而言容易发生堵塞。为降低装置堵塞的风险，在将单探针插入细胞时应避免触碰细胞核。若发生堵塞，可通过自制加热线圈对堵塞的探针尖端或nano-ESI发射器进行加热，从而实现装置的再生。16单探针SCMS技术的另一个局限性在于，仅能检测贴壁细胞（即, 可通过当前装置分析贴壁细胞（即细胞附着于表面）；然而，若将细胞操控系统整合至单探针质谱装置中，则未来有望研究更广泛的细胞类型。
与MSI实验类似，获得高质量的探针和优化的溶剂流速对于SCMS研究至关重要。调节溶剂流速时，将单探针尖端置于样品上方（即，不与细胞或培养基接触），并确保探针尖端无溶剂滴落，纳米电喷雾电离发射器内无气泡形成。

质谱成像（MSI）是一种相对较新的分子成像技术，可用于提供目标化合物在表面的空间分布信息。在MSI分析过程中，质谱（MS）测量以单个像素为基础在整个表面上进行，从而生成目标物种的二维图像1。MSI技术能够对多种代谢物提供空间分辨的特征分布，使从样品中获得的信息量远超传统分子成像技术，并有望显著提升生物学和药理学研究中对生物样本的分析能力2。MSI技术 broadly 可分为非环境离子化和环境离子化两类。非环境MSI分析技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱3和飞行时间二次离子质谱（ToF SIMS）4，具有高空间分辨率（分别为约5 µm和100 nm）和高灵敏度。然而，这些方法需要复杂的样品前处理，例如在样品表面施加基质分子，且需在真空采样环境中进行，这可能引入数据伪影。而环境离子化技术，如解吸电喷雾电离（DESI）质谱5、激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）质谱6和纳米DESI质谱7，可在常压环境下对样品进行几乎无需前处理的质谱成像，从而生成更可能反映样品原始状态的质谱图像。然而，与非环境技术相比，这些技术通常在空间分辨率和检测灵敏度方面有所不足，实验中每个像素通常约为150 µm8。
单细胞分析（SCA）是一个不断发展的领域，能够对生物样品在细胞水平上进行化学成分表征。与传统的细胞分析技术相比，SCA可在更基础的层面上研究生物系统；传统方法通常提供细胞群体的平均结果，而单细胞分析则可能揭示以往难以获得的生物学见解9。近年来，质谱技术已应用于单细胞分析（称为单细胞质谱分析，SCMS），包括使用非环境电离技术，如基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI MS）10和飞行时间二次离子质谱（ToF SIMS）11，这些方法需在分析前对细胞进行预处理；同时也包括环境电离技术，如激光烧蚀电喷雾电离质谱（LAESI MS）12，以及直接提取方法，例如活体单细胞视频质谱（live single-cell video-MS）13, 14，用于分析多种类型的细胞，如卵细胞、植物细胞和癌细胞。环境电离技术的优势在于可直接应用于活细胞，从而进一步减少人为假象，更真实地反映活细胞内代谢物的状态。然而，上述基于直接提取的方法将样品提取与分析过程分为两个步骤，导致分析过程中存在时间间隔，可能改变样品中代谢物的组成。
单探针，一种微型多功能装置，能够对生物组织切片进行高空间分辨率的常温质谱成像 15 近实时 原位 活体单细胞上的SCMS 16单探针采用一体化结构，由拉制的双孔石英毛细管与溶剂供给入口及熔融石英毛细管制成的纳米电喷雾电离（nano-ESI）发射器耦合而成，可在单一装置中实现溶剂输送与分析物提取。在常压质谱成像（MSI）模式下，将单探针置于样本组织表面，进行表面微萃取，从而获得高空间分辨率的光栅扫描质谱图像。特别是，单探针的锥形尖端足够细小，可插入活体真核细胞内进行操作。 原位 SCMS 分析中，从探针插入到质谱检测的代谢物检测耗时不到两秒，可实现近实时的化学信息采集。以下是单探针装置的制备方案，以及利用单探针质谱技术进行常压质谱成像（MSI）和 SCMS 模式检测的操作流程。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;单探针制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>双孔石英毛细管，1.120&amp;rsquo;&amp;rsquo; &amp;times; 0.005&amp;rdquo; &amp;times; 12&amp;rdquo;</td><td>Friedrich &amp; Dimmock, Inc, Millville, NJ&amp;nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>微电极激光拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato, CA&amp;nbsp;</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英毛细管，内径：40&amp;nbsp;&amp;micro;m，外径：110&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>紫外固化树脂&amp;nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA</td><td>Item No. 006.030</td><td></td></tr><tr><td>LED紫外灯</td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Devcon, Danvers, MA&amp;nbsp;</td><td>Part No. 20945</td><td></td></tr><tr><td>在线微滤器&amp;nbsp;</td><td>IDEX Health &amp; Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>微型连接头&amp;nbsp;</td><td>IDEX Health &amp; Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（玻璃）</td><td>C &amp; A Scientific - Premiere, Manassas, VA&amp;nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>注射器&amp;nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;质谱仪&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&amp;nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 软件</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&amp;nbsp;</td><td>XCALIBUR21</td><td></td></tr><tr><td>Fance 阶段控制</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;触点闭合装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>USB-6009 多功能数据采集设备</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS 继电器</td><td>Panasonic, Kadoma, Japan&amp;nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>逻辑门 50 欧姆线路驱动器</td><td>Texas Instruments, Dallas, TX&amp;nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;单探针装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>电动线性位移台及控制器（3套）</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>微型XYZ位移台</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY平移位移台</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 和 PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL 离子源接口法兰</td><td>New Objective, Woburn, MA&amp;nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>数字立体显微镜，250X - 2,000X</td><td>Shenzhen D&amp;F Co., Shenzhen, China</td><td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>USB数字摄影显微镜&amp;nbsp;</td><td>DX.com, HongKong, China</td><td>S02 25~500X&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx Inc., Stafford, TX&amp;nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>实心铝制光学平台，8&quot; x 8&quot; x 1/2&quot;</td><td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>柔性夹具支架</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;溶剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% 热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES（pH 7.4）&amp;nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&amp;nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning Inc., Corning, NY&amp;nbsp;</td><td>Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Corning Inc., Corning, NY&amp;nbsp;</td><td>Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>圆形显微镜盖玻片，1号</td><td>VWR International, Radnor, PA&amp;nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>VWR International, Radnor, PA&amp;nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;组织成像&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 最佳切割温度（OCT）包埋剂&amp;nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（聚碳酸酯）</td><td>Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

单探针的应用：常温条件下的质谱成像与单细胞分析

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

质谱成像（MSI）和 原位 在常温常压条件下进行的单细胞质谱（SCMS）分析是两个具有广阔前景的新兴领域，可实现对生物样品中生物分子的高精度质谱（MS）分析。单探针是一种微型化装置，集成了取样与电离功能，能够同时执行常温质谱成像（ambient MSI）和 原位 SCMS分析。在常压质谱成像（ambient MSI）中，单探针通过表面微萃取技术对样品进行连续的质谱分析，该方法能够从生物样品（如小鼠脑和肾组织切片）获得具有高空间分辨率（8.5 µm）的质谱图像。常压质谱成像的优势在于分析前几乎无需样品预处理，从而减少了数据采集过程中潜在的人为假象，使样品的分析结果更具代表性。对于 原位 SCMS中，由于采样探针尖端尺寸较小，单探针尖端可直接插入活体真核细胞（如HeLa细胞）内&lt; 10 µm），并且该技术能够在接近实时的条件下检测单个细胞内多种多样的代谢物。单细胞质谱技术（SCMS）能够在单细胞水平上获得更高灵敏度和准确性的化学信息，从而加深我们对生物过程在比以往更基础层面上的理解。该单探针装置可与多种质谱仪联用，适用于广泛的空间代谢组学成像（MSI）和单细胞质谱（SCMS）研究。

单探针已成功用于小鼠肾脏组织切片的常温质谱成像分析 15该装置采用表面液体微萃取机制（图1a），可从小面积区域高效提取分析物，从而在质谱成像结果中产生丰富的离子信号强度。例如，超过10种分析物的信号强度7 一些丰度较高的代谢物已实现该目标（图2a检测到大量代谢物，包括多种鞘磷脂（SM）和磷脂酰胆碱（PC）种类，例如 [SM (34:1) + Na]+ (725.5575 m/z），[PC (32:0) + H]+ (734.5700 m/z），[PC（34:1）+ Na]+ (782.5696 m/z），以及 [PC (38:5 + Na)]+ (814.5726 m/z）。当与高分辨质谱仪联用时，这些化合物可通过高分辨率和高质量精度进行鉴定。例如，鉴定质量偏差小于4 ppm m/z 质量准确性（即，每个代谢物的观测值与理论值之间的差异）图2b）在本文所示结果中。此外，串联质谱分析（即此外，还进行了串联质谱（MS/MS）分析，以更可靠地鉴定目标物种。15
由于单探针装置能够在小面积区域上高效地进行液体微萃取，因此可在常温常压条件下用于执行高空间分辨率的质谱成像实验15例如，已获得小鼠肾脏切片的详细质谱图像，展示了所选代谢物的空间分布（图2c）。质谱成像的空间分辨率被确定为 8.5 µm，依据广泛使用的标准，即质谱信号强度在20%至80%变化范围内确定尖锐特征峰的转变点。 18 对于磷脂 [PC (38:5 + Na)] 的情况+ 在小鼠肾脏切片上, 内髓与外髓之间的特征过渡在时序图的一个扫描周期内完成，显示出强度变化超过20%至80%的范围。根据样品移动速度（10.0 µm/sec）以及质谱数据采集速率（0.85 秒/谱图），在一次质谱扫描周期内样品的移动距离（8.5 µm), 即，MSI的空间分辨率，可以计算（图 2d该空间分辨率在针对生物样本的常压质谱成像技术中已达到最高水平之一。
对于单细胞质谱分析（SCMS），单探针能够实现对单个活体HeLa细胞的分析16。单探针的尖端尺寸通常小于10 µm（图3a），足够小，可直接插入多种直径约为10 µm的真核细胞中，用于细胞内物质的提取和质谱分析。探针尖端插入细胞的过程可通过数字体视显微镜进行可视化监测（图3b），而细胞膜穿刺可通过质谱信号从PBS（或新鲜细胞培养基）迅速且显著地转变为细胞内化合物来确认（图3c和3d）。实验可在正离子和负离子模式下进行，以检测更广泛的分子种类。例如，在正离子模式下鉴定出18种不同的脂质种类，包括鞘磷脂（SM）和磷脂酰胆碱（PC），而在负离子模式下检测到腺苷磷酸类物质（AMP、ADP和ATP）（图3c和3d）。单探针插入细胞至信号检测之间的时间延迟通常小于两秒，从而实现了对细胞代谢物的近实时检测。SCMS还被应用于细胞经抗癌药物（例如，OSW-1、紫杉醇和多柔比星）处理的实验中19]。在DMSO（二甲基亚砜）中以一系列浓度（即，10 nM、100 nM、1 µM和10 µM）处理4小时后，可在HeLa细胞内检测到相应药物，未处理组细胞（仅添加DMSO）作为对照。药物的质谱信号在细胞外PBS或对照组中均未出现（图3e），但通过单探针质谱技术可在单个细胞内检测到（仅显示100 nM处理结果，见图3f）。由于细胞经PBS（或新鲜细胞培养基）冲洗以去除细胞外化合物和污染物，因此对内源性代谢物（例如，细胞脂质和腺苷磷酸）和外源性化合物（例如，抗癌药物）的检测表明，单探针质谱技术可用于分析细胞内化合物。
<img alt="用于质谱分析的纳米电喷雾单探针装置；包含示意图和数码显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于常压质谱成像（MSI）和单细胞质谱分析（SCMS）的单探针的制备与装置。 a) 单探针的制备流程。b) 固定在玻璃载片上的已制备单探针的照片。c) 将单探针装置连接至质谱仪的照片。d) 单探针装置与质谱仪耦合的示意图。实验过程中，采样溶剂由注射器持续供给，电离电压从质谱仪端施加至导电接头，两个数码显微镜用于监测样品位置，电动XYZ三维移动平台用于控制样品运动，质谱仪用于分析。e) 定制的数码体视显微镜系统的照片。f) 数码体视显微镜通过光学板连接至离子源接口法兰的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析；m/z 图谱、磷脂表格、肾脏组织成像；离子强度比较。" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠肾脏切片的常压质谱成像研究结果，具有高空间和高质量分辨率。 a) 单探针质谱成像获得的代表性质谱图。检测到的代谢物最大强度可达 3.39 × 107（任意单位）。 b) 所检测代谢物的部分结果及其质量精度。 c) 小鼠肾脏切片中 [PC(32:0) + H]+ 和 [PC(34:1) + Na]+ 的质谱成像，空间分辨率为 8.5 µm。PC：磷脂酰胆碱。比例尺：2 mm；插图中为 0.20 mm。 d) [PC(38:5) + Na]+ 质谱成像空间分辨率的测定（经参考文献15许可改编）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HeLa细胞质谱分析；单探针装置；代谢物数据；谱图比较图表" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 高分辨质谱成像对药物处理的HeLa细胞进行常温SCMS分析的结果。 a单探针尖端的放大照片，显示典型尺寸 &lt; 10 µm 直径。 b单探针插入HeLa细胞时拍摄的照片。比例尺： 50 µm. c典型的正离子模式质谱图，显示多种磷脂酰胆碱（PC）分子的鉴定结果。 d人宫颈癌细胞（HeLa细胞）在正离子和负离子模式下通过SCMS分析检测到的代谢物代表性列表。 e-f对照组和经处理（100 nM OSW-1）细胞的质谱图（经参考文献16许可改编）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
图S1。用于产生接触闭合信号以使质谱仪采集数据的电子设备电路图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">请点击此处查看或下载该图。</a>

本文介绍了对组织进行常温质谱成像（MSI）的实验方案 原位 使用单探针（一种用于质谱分析的微型多功能装置）进行活体单细胞质谱（SCMS）分析。

质谱成像（MSI）和常温条件下原位单细胞质谱分析（SCMS）是两个具有广阔前景的新兴领域……

本方法的总体目标是构建一种微尺度采样装置——单探针（Single-probe），用于在常温常压条件下通过质谱技术分析活体单细胞，并实现对生物组织的高空间分辨率常温质谱成像。该方法有助于解答生物与药物研究中的关键问题。例如，活体单细胞中存在哪些分子，以及这些分子在组织中的分布情况。该技术的主要优势在于，单探针是一种多功能装置，可用于活体单细胞分析以及高分辨率常压质谱成像实验。尽管该方法可用于分析单细胞和组织，但也可应用于其他需要微尺度取样的体系，例如化学物质的微区分析、活体微菌落和生物膜。与我一同演示该操作的是我实验室的博士后魏 Rao。将感兴趣的小鼠完整器官置于小型塑料孔板中央。加入组织包埋剂，使器官完全浸没，液面高度约为10 mm。立即将组织放入液氮中进行速冻。制备小鼠组织切片时，取冻存的小鼠器官，在温度可控的冷冻切片机中将其解冻至15摄氏度。用约500微升组织包埋剂将组织固定在钢制底座上，并置于冷冻切片机切片架上，使所需切面方向正对刀刃。将组织切成12微米厚度。然后将切好的组织片放置在聚碳酸酯显微镜载玻片上，在室温下干燥30分钟。取一份细胞样品，例如1毫升HeLa细胞悬液，加入到标准的10厘米细胞培养皿中的9毫升完全细胞培养基中。将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下培养两至三天，直至细胞培养板上的生长表面覆盖率达到70–80%。在细胞培养板中进行细胞传代。操作时，吸除生长培养基，并用5 mL 1×磷酸盐缓冲液冲洗细胞。使用无菌吸头移除 PBS，并加入 2.5 mL 胰蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟，使细胞从培养板上脱落。加入 7.5 mL 完全细胞培养基以终止胰蛋白酶活性，然后将细胞均匀重悬。为了准备单细胞质谱（SCMS）实验的细胞样本，首先将单个微型盖玻片放入 12 孔板的各个孔中。然后，向孔中加入 1.8 mL 细胞培养基和 0.2 mL 细胞悬液。在 37 摄氏度、5% CO2 环境中孵育约 24 小时前，轻轻振荡培养板，使细胞充分混匀。如需对培养的细胞进行药物处理，可将药物化合物溶液加入 12 孔细胞培养板中。将双孔石英毛细管放入激光显微拉针仪中，拉制双孔石英微针。初始参数设置如下：加热值设为400，灯丝值设为3，拉速设为80，延迟设为150，拉力设为250。切割拉制后的尖端，使另一端保留约5 mm未拉制的双孔石英毛细管。截取一段80 mm的熔融石英毛细管作为供溶剂用的毛细管，然后将其插入双孔石英针扁平端的一个孔中。用火焰拉制熔融石英毛细管制成纳米电喷雾电离（nanoESI）发射器，切割至7–10 mm长，并将其插入双孔石英针扁平端的另一个孔中。在双孔石英针的平端涂抹少量紫外固化树脂。使用LED紫外灯照射约20秒，以固定溶剂供给毛细管和纳米电喷雾发射器。随后，将标准显微镜载玻片沿长边方向纵向切成两半。然后，将单探针放置在玻片的一端，使纳米电喷雾发射器朝向外侧。在单探针的主体上涂抹普通环氧树脂，将其固定在玻片上，随后静置过夜使其固化。该系统包括一个定制的质谱仪离子源接口法兰，以及一个安装有USB数字显微镜、微型手动XYZ平移台和电动XYZ平移台系统的铝制光学平台。按照文本方案中的描述，修改质谱仪的离子源接口法兰，并制作数字体视显微镜的支架。将改装后的数字体视显微镜、USB 数字显微镜、带柔性夹持器的微型手动 XYZ 平移台以及电动 XYZ 平移台系统安装到铝制光学板上。使用柔性夹持器固定附有单探针的载玻片。然后，将单探针装置连接至质谱仪。调节柔性夹持器和微型XYZ位移台，使单探针的发射端位于质谱仪进样口前方。在室温下解冻样本切片，并将其放置于单探针下方的电动XYZ平移台系统上。通过更改控制软件中的坐标来调整样品位置。使用注射器以适当的流速泵送采样溶剂。然后，施加电离电压。调节单探针的高度，使其刚好位于样品表面之上，并能够对代谢物进行表面提取。小心地提升Z轴载物台，然后使用USB数字显微镜监测单探针尖端与组织表面之间的距离变化。设置在样品感兴趣区域进行光栅扫描的参数。对于本实验所展示的小鼠肾脏切片，采用每秒10微米的光栅扫描速度，以及每条扫描线之间20微米的间距。在样本中对目标区域设置相应的光栅扫描参数。对于本实验所展示的小鼠肾脏切片，采用每秒10.0微米的光栅扫描速度，以及每条扫描线之间20微米的间距。建立一种从质谱仪自动采集质谱（MS）数据的方法。对小鼠肾脏样本进行高分辨率质谱成像（MSI）时，采用60,000的质量分辨率、5 kV正离子模式、1次微扫描、最大离子注入时间150毫秒，并开启自动增益控制。启动MSI数据采集，然后按照文本方案中所述方法从原始质谱文件构建质谱图像。根据 MSI 的说明设置单探针系统，并调节溶剂流速。用 PBS 清洗贴壁生长在微型盖玻片上的培养细胞，以去除培养基和细胞外药物成分。然后将含有细胞的玻片放置于电动 XYZ 平移台系统上进行实验。将数字体视显微镜聚焦于样品上方的单探针尖端，以在分析过程中监测细胞穿刺情况。利用单探针侧方的USB数字显微镜，监测单探针上纳米电喷雾电离（nanoESI）发射器的工作状态。通过电动XYZ三维载物台控制程序和数字体视显微镜定位目标细胞，并精确地将单探针尖端置于样品上方。在将单探针尖端插入细胞之前，开始质谱数据采集。降低含有细胞的培养板，使单探针尖端从细胞中抽出。最后让溶剂持续流动约三分钟，以彻底冲洗单探针。对小鼠肾脏切片进行了常压质谱成像，检测到组织表面存在的大量分子。绘制了多种分子在组织表面的空间分布及相对丰度。通过观察质谱数据中特征信号的 sharp transition，实现了 8.5 微米的空间分辨率。制备具有尖锐尖端和开放通道的单探针对于单细胞分析至关重要。需要使用显微镜来定位目标细胞并监测细胞穿刺过程。质谱信号的变化也提供了额外信息，可用于确认细胞穿刺是否成功。已从活体单细胞中检测到大量分子。在用于抗癌药物研究时，需通过对照细胞实验来显示抗癌药物处理的差异。观看本视频后，您应能充分理解单探针的制备方法，以及该装置如何用于单细胞质谱分析和生物组织的常压质谱成像。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为需要详细的指导来制备单探针装置、搭建整个系统以及操作仪器。一旦掌握，即可对大量细胞连续进行单细胞分析，且每次分析耗时不到三分钟。完成一次常压质谱成像实验可能需要数小时，具体时间取决于样本大小、空间分辨率以及所使用的质谱仪。在进行该实验时，需牢记制备高质量的单探针是关键步骤。此外，仪器的调谐与操作对于实验的成功实施至关重要。可参照本文所述类似方法开发其他技术。例如，可将试剂加入样品溶剂中，进行反应性单细胞分析和常压质谱成像，以增强样品中分子的检测效果。该技术一经建立，便为在常温条件下开展单细胞分析和质谱成像研究的科研人员开辟了新的途径。该技术可潜在地用于细胞生物学研究、药理学研究以及临床检测。请注意，操作尖锐的石英毛细管和紫外固化环氧树脂可能存在危险，因此在进行该操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套和紫外防护眼镜。

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生物学

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探针电喷雾电离质谱分析的样品制备

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荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

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单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：细胞洗涤、淬灭、干燥与储存的联合操作

本方案描述了利用解吸电喷雾电离耦合轨道阱质谱仪进行OVCAR-8细胞单细胞质谱成像，以实现高空间分辨率的代谢组学分析。...

使用解吸电喷雾电离耦合轨道阱质谱仪进行单细胞质谱成像

了解单探头技术在常压质谱成像和活细胞单细胞分析中的应用。该方法利用微型多功能装置实现高分辨率生物样品分析，无需复杂样品制备即可研究活细胞和组织中的分子分布。

单探针的应用：常温条件下的质谱成像与单细胞分析

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