使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

该成像技术的总体目标是监测血管平滑肌细胞中钙释放剂对肌浆网腔内钙离子水平波动的影响。该方法有助于更直接地阐明细胞内钙循环机制。例如，了解肌浆网中的钙转运与内质网应激之间的关系至关重要。

该技术的优势在于，我们可以直接测量肌浆网腔内的钙离子浓度，而无需通过细胞质中钙离子变化的间接测量结果来推算。接下来由我实验室的研究生 Gabriela Ziomek 演示该技术。开始此操作前，需在 DMEM 中配制蛋白混合物的 1:25 稀释液。

随后，将 200 微升蛋白混合物 DMEM 加入每个 35 毫米玻璃底培养皿中，以完全覆盖底部内侧的玻璃圆面。将培养皿置于生物安全柜内室温条件下静置至少 30 分钟。在此期间，将含 10% NCS 的 DMEM 在水浴中预热至 37 摄氏度。

随后，使用玻璃移液管将 DMEM 从培养瓶中移除。接着，用温热的无菌 PBS 冲洗培养瓶底部，以去除残留的 DMEM。为使培养的平滑肌细胞从瓶底脱落，用一毫升胰蛋白酶快速冲洗培养瓶，然后将其移除。

然后加入另一毫升胰蛋白酶。轻轻晃动培养瓶约30至60秒，确保酶液接触瓶底全部表面后再移除。待细胞经胰蛋白酶消化脱落后，向培养瓶中加入含10% NCS的新鲜DMEM以终止胰蛋白酶反应。

将烧瓶中得到的细胞悬液转移至一个洁净并已标记的50毫升锥形管中。然后向每块待处理的培养板中加入1毫升新鲜DMEM培养基，其中含有10% NCS。随后，轻轻反复倒置含有细胞悬液的锥形管数次，以充分分散可能形成的细胞沉淀。

将充分混匀的细胞悬液用移液器吸取所需体积，加入各孔板中。随后，将每孔板彻底顺时针或逆时针轻轻摇晃，以确保细胞在孔板底部玻璃表面均匀分布。需向孔板中加入足量的细胞，以确保在接下来的48小时内细胞达到足够高的汇合度，便于有效成像。

在向每块培养板中加入培养基和细胞悬液后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少一小时，以使细胞充分贴附于玻璃底表面。每隔15分钟在显微镜下观察一次培养板，直至细胞明显贴壁。随后，从-80摄氏度冰箱中取出腺病毒D1 SR分装样品，并将其置于移动冰浴中转移至生物安全柜内。

将所需剂量的预冷D one SR用移液器加入每块培养板中，并在37摄氏度下孵育感染的细胞过夜。次日，用一毫升含10% NCS的新鲜DMEM重新补充细胞。随后，将培养板置于含5%二氧化碳的湿润培养箱中，在37摄氏度下继续孵育过夜。

经过过夜孵育后，从培养板中移除培养基。用一毫升温热的生理 HEPES-PSS 缓冲液洗涤培养板三次。接着，在记录前立即加入一毫升新鲜的温热 HEPES-PSS 缓冲液。

使用FRET SE应用程序进行初始成像：打开共聚焦显微镜的配套软件。应用程序启动后，点击“setup”选项卡以调整所需的实验设置。手动更改通道设置，使细胞依次在440纳米波长下激发供体和FRET，在513纳米波长下激发受体。

然后将供体的发射波长设置为488纳米，FRET和受体的发射波长设置为535纳米。随后，将光照强度设置为15%透光率，细胞激发曝光时间为150毫秒，每次曝光间隔为10秒。接下来将培养板固定在显微镜载物台上。

使用实时按钮检查图像分辨率。根据需要进一步调整设置以获得理想的分辨率。在设置选项卡下，点击捕获图像按钮拍摄样品图像。

现在切换到评估选项卡，为正在进行的实验选择合适的FRET效率计算方法。对于涉及Cameleon类探针（如D one SR指示剂）的实验，推荐使用方法三，即基于比率的计算方法。之后，切换至图表选项卡，以图形形式观察记录的荧光强度值。

如有需要，可在图像查看器中绘制一个感兴趣区域（ROI），以观察该区域在图中对应的平均荧光强度。开始记录并至少采集三分钟的数据，以确保在加入目标试剂前获得稳定的基线信号。随后，加入钙离子移动试剂，通过将其直接施加到记录区域附近的孔板中，作为耗竭肌浆网（SR）钙离子的工具。

在处理后继续记录所需时长。随后，使用共聚焦倒置显微镜结合FRET SE应用程序采集比率型FRET序列图像。在此步骤中，为准备大鼠主动脉平滑肌细胞的培养板，用一毫升温热的生理HEPES-PSS缓冲液洗涤培养板三次。

然后，将指示剂与1 mL温热的HEPES-PSS混合，加入培养板中。在室温下用指示剂孵育平滑肌细胞1小时。1小时后，从培养板中移除指示剂，并用1 mL温热的生理Hepes-PSS缓冲液洗涤3次。

然后，在记录前立即加入1毫升新鲜的温热HEPES-PSS缓冲液。使用共聚焦倒置显微镜采集连续图像。随后加入钙离子移动剂作为耗竭肌浆网钙的工具，并在处理后继续记录所需时长。

图中显示了使用CFP、FRET和YFP带通滤光片对转染了D one SR指示剂的平滑肌细胞的代表性图像。该图展示了转染了D one SR的大鼠主动脉平滑肌细胞在培养过程中的实时伪彩图像。用2 µM毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理后，信号强度下降，表明由于毒胡萝卜素诱导的钙释放，肌浆网（SR）内的钙含量显著降低。该图还显示了经2 µM毒胡萝卜素处理的培养平滑肌细胞中归一化的D one SR比值的代表性曲线，进一步证实了肌浆网钙含量的显著下降。

以下是培养的大鼠主动脉平滑肌细胞加载细胞质钙离子指示剂并用 2 µM 毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理后的代表性图像。如图所示，毒胡萝卜素可引起细胞质内信号强度显著升高，这是由于钙离子从肌浆网（SR）中释放所致。该图显示了经 2 µM 毒胡萝卜素处理的培养平滑肌细胞中归一化的 Fluo-4 AM 草比率的代表性曲线。所观察到的钙信号增加被认为与从肌浆网释放的钙离子量成正比。一旦掌握该技术，若操作得当，从开始到结束约需 48 小时即可完成。

在进行该实验操作时，必须将细胞保持在所述条件下，以确保其在转染钙指示剂之前的细胞活性。观看本视频后，您应能够清楚地了解如何制备培养细胞，以便利用 D one SR 指示剂检测肌浆网腔内的钙离子水平。