清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

本实验的总体目标是通过在清醒动物体内进行神经活性物质的微离子电渗入注射，调控突触输入对神经元处理的影响。该方法有助于利用感觉系统解析关键功能，例如神经递质在感觉刺激与编码中的作用及其相互作用。该技术的主要优势在于，可在不受麻醉干扰的情况下，对目标区域的局部突触输入进行调控，并研究神经元调节系统。

尽管该装置在此处用于活动受限的小鼠，但它也可用于其他哺乳动物，如蝙蝠、大鼠或豚鼠。开始此操作时，将钨丝放入定制的对准工具中进行切割。用胶带小心固定钨丝的松散端，并将其剪至所需长度。

接下来，轻轻拉动胶带，以将钨丝从对准工具上取下，确保所有钨丝仍附着在胶带上。然后，将胶带缠绕到一根抛光的黄铜芯轴上，并将钨丝紧贴芯轴固定，以确保良好的电接触。

随后，将转轴连接至工作站内的5 RPM电机。转轴入口相对于蚀刻液表面呈45度角。接着，将三分之一的导线浸入溶液中。

接着，将一根碳棒电极浸入刻蚀液中以闭合电路。打开工作站，使转轴开始旋转，然后调节通过电极和刻蚀液的电流至250毫安。当电流降至200毫安时，停止尖端刻蚀，以将导线尖端刻蚀成非常细小的点状。

将一根金属丝放入末端用油泥封堵的硼硅酸盐玻璃毛细管中。使用加热圈和悬挂式活塞夹持移液管。在将装置置于显微镜下之前，先将带玻璃包被的金属丝固定在载玻片上。

将尖端对准并轻触硼酸珠，使其处于焦点位置。然后加热硼酸珠，直至其略微熔化。随后，插入约10至15微米的金属丝尖端，并关闭加热电位计。

当玻璃珠冷却后，从电极尖端移除玻璃，以暴露钨丝。为获得约15毫米的尖端，将极板调节至适当参数。牵拉毛细管，得到两根尖端封闭的移液器。

使用油灰将杆状移液管固定在载玻片上，并用精细剪刀、镊子或手术刀的平面端将其尖端折断。轻微调整电极与多通道管之间的角度，以获得更好的结合效果和更细的整体结构。在显微镜下，将钨电极小心地对准多通道管的尖端。

对齐后，降低电极直至其接触多通道管。将电极嵌入上部两个通道管之间的凹槽，然后滑动电极尖端，使其突出于多通道管尖端15至20微米。现在，在距离钨丝和多通道管组件尖端约5毫米处，滴加少量光固化胶粘剂。

避免胶水到达尖端，以防堵塞多通道管路，并使用蓝光LED灯固化胶水。接下来，将麻醉后的动物置于加热毯上，使其体温维持在38摄氏度，并用立体定位仪的两个耳杆和一个咬合杆固定动物头部。然后涂抹眼用凝胶以保护眼睛。随后，剃除头皮毛发，并使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并剥离覆盖在顶骨及更靠前的枕骨区域的骨膜。

接着，在颅骨和头固定柱的基部涂抹一层薄薄的光固化胶。等待10秒，将头固定柱沿中线置于顶骨的前部区域。使用蓝光源照射20秒，以实现有效的粘接强度。

随后，使用小钻头在头柱基部周围和后方钻两个孔。将一枚表用螺丝放入钻好的孔中，作为颅骨与头固定装置之间的额外接触点。拧紧约一圈半，使螺丝牢固贴合，并用镊子测试，确保其无松动。

然后，将银质接地线的尖端插入第三个孔中，并确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水型氰基丙烯酸酯胶水，将导线固定于颅骨上。随后，涂抹光固化复合树脂，覆盖头部固定柱的基部、银线的下部以及螺钉，以增强头部固定柱与颅骨之间的结合强度。

注意不要超过人字缝，以便在记录过程中留出操作空间，并使用蓝光源固化复合材料。然后，向后牵拉颈部后方靠近颅骨附着处的肌肉。使用小型环钻，在人字缝下方、中线外侧钻出一个圆形窗口，以暴露下丘。

在此步骤中，将动物的身体放入定制的泡沫垫固定装置中。将头部固定杆连接至立体定位仪框架上的固定夹具。此时可给予动物液体奖励。

接下来，用棉质毯子覆盖动物的身体，并使用塑料半圆筒和胶带 loosely 固定。使用带有柔性尖端的注射器将选定的药物注入各管腔中。利用显微操作器将多管电极放置在其电极架上。

接着，将一根未编码的银丝放入每个筒内，使其一端与溶液接触，另一端可连接。然后将这些端连接至微电泳装置。之后，将正极端连接至钨电极的末端，接地端连接至接触硬脑膜的银丝。

随后，移动多管电极，直至其尖端接触脑表面。滴加温热的无菌生理盐水，以防止脑组织干燥。此时施加保持电流，防止药物从电极管尖端泄漏，同时寻找单个神经元的放电活动。

记录神经活动及离子电渗法施加加巴喷丁。图中显示了在小脑下丘记录的四个神经元在加巴喷丁微离子电渗注射前后的声音频率反应区。黑色十字标记了被选作稀有且重复呈现的声音频率。

此处显示的是在给予加巴嗪（gabazine）注射前和注射期间，神经对所有呈现的频率和强度刺激的反应区域所累积的刺激前时间直方图。黑色条形表示声音持续时间。此处还显示了在给予加巴嗪前和给予期间，对一对频率刺激产生的放电反应的点阵图，其中稀有刺激以红色表示，重复刺激以蓝色表示。

阴影背景表示刺激的持续时间。这些点阵图显示了当偏好频率的相对概率发生切换时的神经反应。该图展示了单个神经元对七对频率的反应，这些频率在给予加巴喷嗪之前和期间分别作为稀有声音和重复声音呈现。

该图显示了在施加加巴青定前和施加期间，神经元对稀有声和重复声反应的SSA指数。一旦掌握，所述方法可根据感兴趣神经结构和神经元类型，调整特定参数。在尝试进行动物头部固定记录时，必须注意记录时间取决于动物的适应程度并受其限制；但一个重要优势是，可在同一只动物上间隔数天进行多次记录切口，从而最大限度减少实验动物的使用数量。

通过使用背负式电极进行微电泳，可结合其他操作，例如神经晶体管的注射，以回答更多问题，例如记录位点内神经元的输入来源及其投射靶区。在清醒动物实验中，一个关键问题是动物的福利，因此绝不能超过实验方案中批准的清醒时间，并请持续监测是否存在任何不适迹象。一旦发现，必须立即停止记录。