Name: 神经元电活动外记录与神经活性物质在清醒小鼠微电泳应用相结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习在清醒小鼠中进行微电泳注射神经活性物质的方法，以操纵突触输入并研究神经递质在感觉处理中的作用。该技术可在无麻醉条件下分析神经元调节系统。

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本项目由 MINECO 基金（项目编号 BFU201343608-P 和 PSI2013-49348-EXP）、JCYL 基金（项目编号 SA343U14）资助，MSM 和 ARP 获得 MRC 核心资金支持。YAA 获得 CONACyT（编号 216106）和 SEP 奖学金资助。

所有实验操作均在萨拉曼卡大学进行，并获得萨拉曼卡大学动物护理委员会以及欧盟（指令 2010/63/EU）关于神经科学研究中使用动物的标准批准，且所采用的方法均符合上述机构的标准。&#160;
1. 钨电极
注意：钨电极的制备基于Merrill和Ainsworth27以及Ainsworth et al.28所述的原始技术，并采用Bullock et al.17中描述的工作站装置进行。
<ol>
	<li>为记录IC神经元的单细胞胞外活动，应使用尖端阻抗为1.5 - 2.5 MΩ的电极。此处仅简要描述钨电极的制备步骤，详细说明可参见上述参考文献。</li>
	<li>将钨丝放入定制的对准工具中（图1A）以帮助将其切割至所需长度。对齐工具由30根针头（25 G）平行粘合而成，针头间距为2 mm，一端设有止挡，用于限制导线长度约为40 mm。用胶带小心固定导线的松散端，然后用锋利的剪刀剪去多余的导线部分。</li>
	<li>轻轻地从胶带上取下钨丝，确保所有钨丝仍附着在胶带上。将胶带卷到一根抛光的黄铜芯轴上图1B，C），将导线紧贴主轴，确保形成良好的电连接。</li>
	<li>将纺锤体连接至工作站内的5 rpm电机，并将外露的金属丝尖端浸入蚀刻液（KNO₃）中。2，每80毫升溶液含90克）。将旋转轴倾斜至与蚀刻液表面成45°角。浸入导线尖端，使约1/3的导线与溶液接触。</li>
	<li>将碳棒电极浸入蚀刻液中以闭合电路。在主轴旋转的同时，使用弹簧铜编织刷将蚀刻电源施加到主轴上。调节通过电极和蚀刻液的电流至250 mA。当电流降至200 mA时，停止尖端蚀刻。导线尖端将被蚀刻成非常细小的尖点。</li>
	<li>将一根锋利的金属丝穿过火焰，以去除油脂和粘合剂残留物。将金属丝（钝端朝前）插入一支硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 mm）中 下端用油泥封堵。将移液管在顶部和底部垂直夹紧。使用加热线圈（直径5 mm，深度5 mm）和悬挂的活塞牵拉移液管。当金属丝因活塞的重量被向下牵拉时，熔融玻璃在金属丝周围形成一层极细的涂层。</li>
	<li>使用四硼酸钠熔融小珠去除电极尖端锐利端部覆盖的玻璃。制备小珠时，将四硼酸钠（约0.25 g）与少量水（约0.5 ml）混合，缓慢置于加热元件上，加热至熔化形成直径约2 mm的小珠。加热元件的温度由电位计控制。将小珠和加热元件放置在固定于台面的操纵臂上，移动操纵臂，使小珠在低倍显微镜下聚焦。</li>
	<li>将带玻璃涂层的金属丝固定在载玻片上，并置于显微镜下。使用载物台调节旋钮移动载玻片，直至金属丝尖端和四硼酸盐小珠清晰对焦。加热小珠至轻微熔化，将金属丝尖端插入约10–15 µm。关闭加热电位计。随着小珠冷却，其体积收缩，从而去除电极尖端的玻璃涂层，暴露出底层的钨金属。此时钨电极已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
2. 多通道玻璃移液管的制备
<ol>
	<li>用热缩管保护多管玻璃毛细管（五管H型配置）的末端，以增强拉制仪夹具的抓握力并防止断裂，然后将一根毛细管放入垂直拉制仪中。</li>
	<li>为获得约15&#160;mm的尖端长度，将拉制仪参数设置如下：加热温度：84，辅助磁力：49，主磁力：38。根据具体设备配置以及更换加热元件后的情况，对这些参数进行微调。</li>
	<li>拉制毛细管，得到两根尖端封闭的移液管。使用模型胶将一根移液管固定在载物片上，在显微镜下用精细剪刀或镊子，或手术刀的平面端，将移液管尖端折断至外径约为20 - 30 µm。若断裂边缘过于粗糙，可采用第1.7步所述的四硼酸盐珠技术进行修整。</li>
	<li>将一根钨电极（来自第1节）安装在固定于显微镜载物台上的微型三维微操纵器末端的20 G针头制成的夹具中。用镊子将电极尖端距顶端约30 mm处弯曲5 - 10°。</li>
	<li>在显微镜下，仔细将钨电极对准多管毛细管的尖端。对准后，缓慢下放电极直至其接触多管毛细管，并嵌入上部两根毛细管之间的凹槽中。滑动电极尖端，使其从多管毛细管尖端伸出约15 - 20 µm。尽可能减小电极与多管毛细管之间的夹角，以实现更好的结合和更小的整体直径。</li>
	<li>在距离尖端约5 mm处施加少量光固化胶粘剂。注意避免胶水接触尖端，以防堵塞多管毛细管的通道。</li>
	<li>使用蓝色LED灯固化胶水。如有需要，可重复进行胶水涂抹和固化，以增强结合强度。</li>
	<li>轻柔移动显微镜载物台，使钨电极末端从夹具中释放。将组合电极从载物片上取下。</li>
	<li>用一小段热缩管包裹组合电极的中部，并在玻璃表面涂上快速固化的环氧树脂，以进一步加固钨电极与多管毛细管的连接。</li>
</ol>
3. 用于微离子电渗的药物
注意：用于微离子电渗的药物在水中溶解后必须带有电荷。请查阅文献以确认目标药物是否适用于本实验方法。此处以 GABAA 受体拮抗剂加巴嗪（gabazine）为例描述该操作流程。
<ol>
	<li>使用 0.2 µm 注射器滤器过滤蒸馏水，以对水进行灭菌并确保不含溶质。用此蒸馏水配制约 1,000 µl&#160;的 20 mM gabazine 溶液。</li>
	<li>使用细尖 pH 电极，并用经 0.2 µm 滤膜过滤的 NaOH 将稀释液的 pH 调整至 4。</li>
	<li>将 100 - 200 µl&#160;分装液储存于 -20 ºC。在记录当天解冻。当天，在固定动物之前，使用装有柔性塑料针头的 100 µl&#160;微量注射器，向多管电极的管腔（每管 3 - 5 µl）中填充药物。</li>
</ol>
4. 手术与头固定装置植入
<ol>
	<li>在两只雄性CBA/J小鼠（Mus musculus）中进行实验，体重分别为27 g和30 g。遵循Bryant及其同事29、Portfors及其合作者30-32以及Duque和Malmierca26的手术和记录操作流程。</li>
	<li>在手术前数天，对动物进行抓握训练，并通过让其自由探索来使其适应记录室环境。每天进行3次训练，每次持续至少30分钟，以使动物在记录过程中更加镇静和舒适。</li>
	<li>通过肌肉注射给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以麻醉小鼠。该剂量可使动物深度麻醉约1小时。根据需要，追加初始剂量三分之一的补充剂量。</li>
	<li>将动物置于设定温度为38 ± 1 ºC的加热毯上，并使用两个耳杆和一个咬合杆将动物头部固定在立体定位仪中。注意避免耳杆刺破鼓膜。</li>
	<li>通过滴加一滴眼用凝胶保护眼睛。</li>
	<li>使用剪刀剃除头皮毛发，并用聚维酮碘对皮肤进行消毒。</li>
	<li>使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并剥离覆盖顶骨及枕骨前部的骨膜。</li>
	<li>将一个轻质硬铝头固定柱（重量约0.65 g，长度30 mm，图2A）粘接到颅骨上，其底部为圆形平面（直径5 mm）。将一根银丝粘接在头固定柱中部，两端保持自由。该银丝将作为电生理记录的参考电极。</li>
	<li>在颅骨和头固定柱基部涂一层光固化粘合剂。等待10秒后，将头固定柱放置于顶骨前部区域的中线上。</li>
	<li>为获得有效的粘结强度，使用蓝光光源照射粘合剂20秒进行光固化。</li>
	<li>使用电钻和小型钻头，在头固定柱基部周围及后方钻三个孔。</li>
	<li>将两枚手表螺丝（长约2 mm）旋入已钻好的孔中，作为颅骨与头端之间的额外接触点。螺丝需旋转1½圈以确保紧密贴合。使用镊子测试螺丝，确保其无松动。</li>
	<li>将银质接地线的末端插入第三个孔中，确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水型氰基丙烯酸酯胶水将导线固定于颅骨上。</li>
	<li>使用光固化复合树脂加固头固定柱与颅骨之间的连接。覆盖头固定柱基部、银丝下部及螺丝，注意不要延伸至人字缝后方，以便记录时留出操作空间。使用蓝光光源进行固化。</li>
	<li>牵开颈部后方肌肉靠近颅骨附着处的部分。使用小型环钻（直径2.35 mm）在人字缝下方、偏离中线处钻一个圆形窗口，以暴露下丘（IC）。当骨缘松动后，用精细镊子轻轻提起覆盖骨片。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗止血。</li>
	<li>用复合树脂在窗口周围制作一个小型围堰（约1 mm宽，约1 mm高），并进行光固化。</li>
	<li>用抗生素软膏覆盖暴露的颅骨和肌肉。然后用无菌生理盐水润湿暴露的下丘表面，并用凡士林覆盖，填满围绕记录窗口所形成的凹槽。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺&#160;（0.03 mg/kg，用无菌生理盐水稀释1:10）作为镇痛剂。</li>
	<li>将动物留在加热毯上直至苏醒，随后将其放回饲养笼中恢复三天后再进行记录实验。将动物单独饲养于大鼠饲养笼中，以防止同笼动物清除凡士林或头固定柱触碰金属网盖。当动物单独饲养时，应在笼内提供一定的环境丰富化物品。同时每日更换木屑以预防感染，并仔细检查动物恢复情况，确保无任何不适表现。还需检查凡士林是否覆盖记录窗口，以保护暴露的脑组织。</li>
</ol>
5. 电生理记录与微离子电渗入
<ol>
	<li>恢复后，让动物有足够时间适应记录环境及其头部被固定的状态。通过将头柱固定在支架上，使小鼠坐在为其体型定制的软质泡沫固定装置上来完成适应过程。&#160;大小（图2B这将限制小鼠的活动，有助于其保持安静。</li>
	<li>从10分钟的训练开始，逐步增加时长至120分钟。在训练过程中，按照固定时间间隔以甜味液体（如炼乳，按30:70比例用水稀释）奖励动物。33随后，在记录期间，于记录开始时、结束时或未分离出神经元时给予相同的奖励。</li>
	<li>如果动物在记录前非常兴奋，可注射少量镇静剂乙酰丙嗪（2 mg/kg，腹腔注射）。镇静剂可能影响目标神经系统的实验结果。</li>
	<li>让动物在记录室内自由探索5 - 10分钟。</li>
	<li>将动物身体放入泡沫材质的定制缓冲固定装置中（图2B).</li>
	<li>将头固定装置固定到与立体定位仪框架相连的支架上（图2C此时可给予动物液体奖励。</li>
	<li>用棉质毯子覆盖动物身体，并使用塑料半圆筒和胶带松散固定。</li>
	<li>去除记录窗口处的凡士林，并用温热的无菌生理盐水冲洗。</li>
	<li>记录神经活动并进行加巴青的离子电渗应用。
	<ol>
		<li>将多管电极放置在其由微驱动器控制并连接至显微操作仪的电极架上。</li>
		<li>使用小型鳄鱼夹连接记录用导线。将正极端连接至钨电极末端，接地端连接至与硬脑膜接触的银丝。</li>
		<li>将一根未包被的银丝放入每个管腔内，使其一端与溶液接触，另一端可连接至微离子电渗仪。按照仪器制造商的说明，将这些端部连接至微离子电渗装置。</li>
		<li>将多管电极移动至其尖端接触脑表面。滴加温热的无菌生理盐水以防止脑组织干燥。此时施加保持电流（加巴喷丁为 -10 nA，具体药物请参考相关文献）以防止药物从电极管尖端泄漏，同时寻找单细胞单位放电活动。</li>
		<li>使用标准技术分离单个神经元的细胞外活动。获取该神经元的频率响应区域（FRA）。 即能够引发神经元反应的声音频率和强度组合，因为该神经元对这些声音具有敏感性34-36.</li>
		<li>选择两个能引发相似放电频率和放电模式的频率（f1 和 f2）。在奇球范式下，将这两个频率分别作为稀有刺激和重复刺激呈现。 
		注意：简而言之，在失匹配范式中，一个频率（f1）作为高频出现的重复刺激呈现，而第二个频率（f2）则作为罕见出现的偏差刺激，随机穿插在重复刺激之中。在第二个失匹配序列中，两种刺激的相对概率被反转。该刺激范式的详细信息此前已有描述22,37.</li>
		<li>通过将电流切换至正值（10 - 20 nA）来释放加巴嗪。再次获取频率响应面积（FRA），并在加巴嗪作用下重复 oddball 范式。持续施加电泳直至在放电率上观察到明显效应；通常需要 5 - 20 分钟，具体时间取决于所用药物、其浓度以及电泳电流的大小。重复记录流程以获得药物作用下的数据值。</li>
		<li>通过将电流恢复至维持水平来停止注射。通过监测FRA或对oddball范式的反应是否恢复至对照水平，以等待药物效应被洗脱。 
		注意：记录会话可持续 2 - 3 小时&#160;每天一次，若动物出现任何不适或挣扎迹象则应提前终止。给予奖励液体，并用凡士林覆盖记录腔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>在加巴喷丁注射前后以及注射期间测量FRA和SSA水平。</li>
	<li>通过常用-SSA指数（CSI）和频率特异性SSA指数（SI）来量化SSA反应的强度，具体方法如下所述&#160;此前19,22,23,38,39CSI 和 SI 反映了神经元对罕见刺激的反应与对重复刺激反应之间的归一化差异。CSI 和 SI 的正值表明，神经反应（每刺激的放电次数）在罕见音调下高于重复音调。</li>
	<li>比较对照组与药物喷射条件下的数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在清醒动物中进行神经活性物质的微电泳是一种强大的技术，可用于探究和解析特定突触输入对单个神经元活动的作用40,41。更重要的是，该方法能够在不受麻醉剂潜在干扰的情况下，确定神经递质和神经调质对神经环路的影响。在此，我们证明了在清醒小鼠的下丘（IC）中施加加巴赞（gabazine）可显著改变其频率调谐特性（图4A）、时间反应模式（图4B）以及显著性刺激适应（SSA）（图5）。
所述实验方法的主要局限性在于记录时间相对较短（约3小时），这取决于动物对记录过程的习惯化程度。另一方面，可在同一只动物上进行多次记录。使用微离子电渗法时，尚不明确所施加的神经活性物质在周围组织中的扩散距离。因此，这种操作可能不仅影响被记录的神经元，还可能影响周围的胶质细胞和神经元，从而引发对神经网络活动的潜在效应。例如，Candy 及其同事42已证明，某些通过离子电渗递送且未被快速清除的分子可扩散至多达600 µm的距离。在小鼠的下丘（IC）中，这一范围将覆盖大部分树...

神经元兴奋与抑制之间的相互作用对于感觉信息的处理至关重要1。已知麻醉对皮层激活的动力学特性以及突触输入的时间模式具有显著影响2,3。例如，已有研究发现麻醉剂会改变皮层神经元视觉诱发电反应的持续时间3,4。此外，麻醉状态与清醒状态下兴奋性和抑制性突触输入之间的比例存在差异4,5，从而改变了诱发电活动和自发活动的速率6,7。通过测量突触电导，Haider 及其同事4发现，在麻醉状态下，抑制与兴奋的幅度相当；而在清醒状态下，抑制强于兴奋。这些发现促使人们发展出新的实验方法，以研究特定突触输入对清醒动物感觉处理的影响。
通过施加微小电流（数量级为纳安，nA）来精确控制带电神经活性物质的喷射，已被广泛用于研究突触输入的贡献以及假定细胞受体在感觉信息处理中的作用8-13。该技术称为微离子电渗法（microiontophoresis），可在记录神经元附近局部施加药物，从而实现快速且局限的作用效果。与其他实验干预方法（如系统性注射、微透析或光遗传技术）引起的广泛效应相比，该方法更适用于研究神经活性物质的局部效应。通常采用“背负式”电极配置14,15，以同时记录目标神经元并递送感兴趣的神经活性物质。该配置由一个记录电极与携带神经活性物质的多通道移液管组合而成。已有多种对Havey和Caspary14最初描述的实验流程的改进方法被采用。例如，可使用钨电极代替玻璃电极&#160;来记录神经活动16。已有文献报道的钨电极制备方法17,18主要包括三个步骤：钨丝尖端的电解蚀刻、玻璃绝缘层包被，以及调节尖端暴露长度以满足记录需求。
听觉神经科学中一个有趣且新兴的研究领域是刺激特异性适应（stimulus-specific adaptation，SSA19）的研究。SSA 是指神经对重复出现的声音刺激反应特异性降低，而对其他罕见呈现的声音刺激的反应并不产生类似降低。SSA 的重要性在于其可能作为听觉脑中偏差检测的神经机制，以及可能作为听觉诱发电位中晚期失匹配负波成分的神经相关基础20,21。SSA 现象从下丘（IC）一直延伸至听觉皮层19,22-24。已有研究表明，GABAA 受体介导的抑制作用可作为调控 SSA 的增益控制机制7,16,25，且该过程也被证实会受到麻醉的影响26。本文介绍了一种实验方案，结合了先前描述的方法，用于在清醒小鼠中记录下丘神经元的单细胞放电活动，并在选择性 GABAA 受体拮抗剂给药前后进行比较。首先，我们描述了“背负式”电极的制备方法，随后介绍了手术操作与记录技术。为验证药物释放的有效性，我们比较了微离子电渗给药加巴嗪（gabazine）前后下丘神经元的感受野特性及其 SSA 水平。

<table><tbody><tr><td>钨丝</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>33-0099</td><td>0.005 英寸 × 3 英寸</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>30-0053</td><td>无灯丝标准壁硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长 100 mm</td></tr><tr><td>多通道玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>5B120F-4&amp;nbsp;</td><td>5 通道毛细管，长 4 英寸，外径 1.2 mm，带灯丝</td></tr><tr><td>Diaplus</td><td>DiaDent</td><td>2001-2101</td><td>光固化粘合剂，用于将钨电极固定在玻璃多通道移液管上</td></tr><tr><td>G-Bond</td><td>GC Corporation</td><td>2277</td><td>光固化粘合剂，用于将头固定装置粘附至动物颅骨</td></tr><tr><td>Charisma</td><td>Heraeus Kulzer</td><td>66000087</td><td>光固化复合材料，用于增强头固定装置与颅骨之间的粘结强度</td></tr><tr><td>Araldit Cristal</td><td>Ceys</td><td></td><td>双组分环氧树脂，用于进一步加固钨电极与玻璃多通道移液管的连接</td></tr><tr><td>加热毯</td><td>Cibertec</td><td>RTC1</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Narishige</td><td>SR-6N</td><td>适用于小鼠的改装型号</td></tr><tr><td>微离子电渗装置</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>Neurophore BH-2</td><td>包含 IP-2 离子电渗泵（每个药物输送通道各一个）和平衡模块</td></tr><tr><td>多通道玻璃移液管拉制仪</td><td>Narishige</td><td>Model PE-21</td><td></td></tr><tr><td>LED 灯</td><td>Technoflux</td><td>CV-215</td><td>5 W，波长 430–485 nm</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>柔性塑料针头，34 AWG</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Merial</td><td></td><td>氯胺酮，100 mg/mL</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td></td><td>赛拉嗪，20 mg/mL</td></tr><tr><td>加巴青 / SR-95531</td><td>Sigma</td><td>S106</td><td>用蒸馏水配制约 1000&amp;micro;L 的 20 mM 加巴青溶液，并将 pH 调至 4</td></tr></tbody></table>

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

在麻醉和清醒动物之间，神经递质与神经调质的活性存在差异，从而导致不同的神经反应。因此，需要能够在清醒动物中操控突触系统的方法，以确定突触输入对神经元信息处理的贡献，同时避免麻醉剂的干扰。本文介绍了用于制备电极的技术方法，可在清醒小鼠中同步记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。通过结合这些操作步骤，我们在头部固定的小鼠下丘神经元中实施了微离子电泳注射 gabazine，以选择性阻断 GABAA 受体。Gabazine 成功改变了神经元的反应特性，如频率反应区和刺激特异性适应。因此，我们证明了本方法适用于记录单个神经元活动，并可用于解析特定神经递质受体在听觉信息处理中的作用。
所述实验方法的主要局限性在于记录时间相对较短（约3小时），这取决于动物对记录过程的习惯化程度。然而，可在同一只动物上进行多次记录。与用于调控神经传递或神经调制水平的其他实验方法（如全身给药或光遗传学模型）相比，该技术的优势在于药物效应局限于目标神经元的局部突触输入。此外，电极可定制生产，能够根据目标神经结构和神经元类型（例如，调整尖端电阻以提高记录信号的信噪比）调节特定参数。

我们记录了下丘（IC）中4个分离良好的单个神经元的单细胞活动。清醒小鼠中进行细胞外记录时获得的典型信噪比见图3B。图4A展示了每个神经元在使用加巴嗪阻断GABAA受体前后其频率响应区域（FRA）的变化。观察到反应强度（每刺激脉冲数）增加，同时频谱调谐范围变宽。在由所有呈现的频率和强度刺激所诱发的神经反应累积的刺激前-后时间直方图中，诱发放电反应的增强也十分明显（图4B）。
在神经元的频率反应区（FRA，见图4A中的叉号）内选择一个或两个频率对，作为重复或稀有声音在奇球范式中呈现，以研究其反应中的显著性刺激适应（SSA）水平。对于两个示例神经元，声音诱发的对每个频率（f1 和 f2）的反应在注射加巴嗪前和注射期间的情况以点阵图形式显示在图5A,B中。对于这两个示例神...

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。

麻醉状态与非麻醉状态之间，神经递质和神经调质的活性存在差异，从而导致不同的神经反应。

本实验的总体目标是通过在清醒动物体内进行神经活性物质的微离子电渗入注射，调控突触输入对神经元处理的影响。该方法有助于利用感觉系统解析关键功能，例如神经递质在感觉刺激与编码中的作用及其相互作用。该技术的主要优势在于，可在不受麻醉干扰的情况下，对目标区域的局部突触输入进行调控，并研究神经元调节系统。尽管该装置在此处用于活动受限的小鼠，但它也可用于其他哺乳动物，如蝙蝠、大鼠或豚鼠。开始此操作时，将钨丝放入定制的对准工具中进行切割。用胶带小心固定钨丝的松散端，并将其剪至所需长度。接下来，轻轻拉动胶带，以将钨丝从对准工具上取下，确保所有钨丝仍附着在胶带上。然后，将胶带缠绕到一根抛光的黄铜芯轴上，并将钨丝紧贴芯轴固定，以确保良好的电接触。随后，将转轴连接至工作站内的5 RPM电机。转轴入口相对于蚀刻液表面呈45度角。接着，将三分之一的导线浸入溶液中。接着，将一根碳棒电极浸入刻蚀液中以闭合电路。打开工作站，使转轴开始旋转，然后调节通过电极和刻蚀液的电流至250毫安。当电流降至200毫安时，停止尖端刻蚀，以将导线尖端刻蚀成非常细小的点状。将一根金属丝放入末端用油泥封堵的硼硅酸盐玻璃毛细管中。使用加热圈和悬挂式活塞夹持移液管。在将装置置于显微镜下之前，先将带玻璃包被的金属丝固定在载玻片上。将尖端对准并轻触硼酸珠，使其处于焦点位置。然后加热硼酸珠，直至其略微熔化。随后，插入约10至15微米的金属丝尖端，并关闭加热电位计。当玻璃珠冷却后，从电极尖端移除玻璃，以暴露钨丝。为获得约15毫米的尖端，将极板调节至适当参数。牵拉毛细管，得到两根尖端封闭的移液器。使用油灰将杆状移液管固定在载玻片上，并用精细剪刀、镊子或手术刀的平面端将其尖端折断。轻微调整电极与多通道管之间的角度，以获得更好的结合效果和更细的整体结构。在显微镜下，将钨电极小心地对准多通道管的尖端。对齐后，降低电极直至其接触多通道管。将电极嵌入上部两个通道管之间的凹槽，然后滑动电极尖端，使其突出于多通道管尖端15至20微米。现在，在距离钨丝和多通道管组件尖端约5毫米处，滴加少量光固化胶粘剂。避免胶水到达尖端，以防堵塞多通道管路，并使用蓝光LED灯固化胶水。接下来，将麻醉后的动物置于加热毯上，使其体温维持在38摄氏度，并用立体定位仪的两个耳杆和一个咬合杆固定动物头部。然后涂抹眼用凝胶以保护眼睛。随后，剃除头皮毛发，并使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并剥离覆盖在顶骨及更靠前的枕骨区域的骨膜。接着，在颅骨和头固定柱的基部涂抹一层薄薄的光固化胶。等待10秒，将头固定柱沿中线置于顶骨的前部区域。使用蓝光源照射20秒，以实现有效的粘接强度。随后，使用小钻头在头柱基部周围和后方钻两个孔。将一枚表用螺丝放入钻好的孔中，作为颅骨与头固定装置之间的额外接触点。拧紧约一圈半，使螺丝牢固贴合，并用镊子测试，确保其无松动。然后，将银质接地线的尖端插入第三个孔中，并确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水型氰基丙烯酸酯胶水，将导线固定于颅骨上。随后，涂抹光固化复合树脂，覆盖头部固定柱的基部、银线的下部以及螺钉，以增强头部固定柱与颅骨之间的结合强度。注意不要超过人字缝，以便在记录过程中留出操作空间，并使用蓝光源固化复合材料。然后，向后牵拉颈部后方靠近颅骨附着处的肌肉。使用小型环钻，在人字缝下方、中线外侧钻出一个圆形窗口，以暴露下丘。在此步骤中，将动物的身体放入定制的泡沫垫固定装置中。将头部固定杆连接至立体定位仪框架上的固定夹具。此时可给予动物液体奖励。接下来，用棉质毯子覆盖动物的身体，并使用塑料半圆筒和胶带 loosely 固定。使用带有柔性尖端的注射器将选定的药物注入各管腔中。利用显微操作器将多管电极放置在其电极架上。接着，将一根未编码的银丝放入每个筒内，使其一端与溶液接触，另一端可连接。然后将这些端连接至微电泳装置。之后，将正极端连接至钨电极的末端，接地端连接至接触硬脑膜的银丝。随后，移动多管电极，直至其尖端接触脑表面。滴加温热的无菌生理盐水，以防止脑组织干燥。此时施加保持电流，防止药物从电极管尖端泄漏，同时寻找单个神经元的放电活动。记录神经活动及离子电渗法施加加巴喷丁。图中显示了在小脑下丘记录的四个神经元在加巴喷丁微离子电渗注射前后的声音频率反应区。黑色十字标记了被选作稀有且重复呈现的声音频率。此处显示的是在给予加巴嗪（gabazine）注射前和注射期间，神经对所有呈现的频率和强度刺激的反应区域所累积的刺激前时间直方图。黑色条形表示声音持续时间。此处还显示了在给予加巴嗪前和给予期间，对一对频率刺激产生的放电反应的点阵图，其中稀有刺激以红色表示，重复刺激以蓝色表示。阴影背景表示刺激的持续时间。这些点阵图显示了当偏好频率的相对概率发生切换时的神经反应。该图展示了单个神经元对七对频率的反应，这些频率在给予加巴喷嗪之前和期间分别作为稀有声音和重复声音呈现。该图显示了在施加加巴青定前和施加期间，神经元对稀有声和重复声反应的SSA指数。一旦掌握，所述方法可根据感兴趣神经结构和神经元类型，调整特定参数。在尝试进行动物头部固定记录时，必须注意记录时间取决于动物的适应程度并受其限制；但一个重要优势是，可在同一只动物上间隔数天进行多次记录切口，从而最大限度减少实验动物的使用数量。通过使用背负式电极进行微电泳，可结合其他操作，例如神经晶体管的注射，以回答更多问题，例如记录位点内神经元的输入来源及其投射靶区。在清醒动物实验中，一个关键问题是动物的福利，因此绝不能超过实验方案中批准的清醒时间，并请持续监测是否存在任何不适迹象。一旦发现，必须立即停止记录。

extracellular-recording-neuronal-activity-combined-with

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

神经元电活动外记录与神经活性物质在清醒小鼠微电泳应用相结合

神经元反应的电生理表征对于理解脑功能以及指导通路示踪染料的放置具有重要意义。然而，许多研究是在麻醉动物中进行的。为了在无麻醉条件下理解脑功能，我们建立了一种在清醒小鼠中记录神经元反应特性并注射染料的方法。...

清醒小鼠的制备以记录神经反应和注射示踪剂

本视频展示了对小鼠大脑中处理听觉刺激的特定区域的神经元活动的研究。该技术包括施加一种抑制性神经传递阻断剂，并在药物作用于局部脑区前后，比较神经元对听觉刺激的反应。...

在清醒小鼠中研究抑制性神经递质阻断剂存在下的听觉神经元反应

来源：Moore, J. D., 等. 在清醒、头部固定的大鼠皮层下脑结构中对单个神经元进行细胞外邻近记录与定位. J. Vis. Exp.

清醒大鼠中用于精确定位神经活动的紧密细胞记录与染色技术

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

本方案描述了一种用于在清醒大鼠中监测皮层下脑区神经元活动的头部固定装置的设计与外科植入方法。该方案详细说明了通过邻细胞记录配置分离单个神经元并有效确定其解剖位置的操作步骤。...

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位

关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

本研究介绍了在乌拉坦麻醉条件下对超直接通路进行多部位体内电生理记录的方法学。...

急性麻醉大鼠超直接通路局部场电位与多单元活动的体内电生理记录

本研究介绍了一种使用定制玻璃光导电极在清醒小鼠中可靠地进行光遗传学单细胞记录的方法。...

清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

该方案描述了在运动皮层（MC）进行细胞外记录的方法，以揭示自由活动的清醒小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFPs）和锋电位的数据分析方法，这对于评估与特定行为相关的神经网络活动具有重要意义。...

自由移动小鼠中的多通道胞外记录

提出一种低成本脑电图记录系统，并结合毫米级线圈，用于在活体小鼠大脑中进行经颅磁刺激。in...

低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

学习在清醒小鼠中进行微电泳注射神经活性物质的方法，以操纵突触输入并研究神经递质在感觉处理中的作用。该技术可在无麻醉条件下分析神经元调节系统。

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

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