清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

本实验的总体目标是通过在清醒动物中进行神经活性物质的微离子电泳注射，调控突触输入对神经元处理的影响。该方法有助于解析感觉系统中的关键功能，例如神经递质及其相互作用在感觉刺激与编码中的作用。该技术的主要优势在于，它能够在不受麻醉干扰的情况下，对目标脑区的局部突触输入进行调控，并研究神经元的调节系统。

尽管这种电极最初是在活动受限的小鼠中使用的，但它也可用于其他哺乳动物，如蝙蝠、大鼠或豚鼠。开始该操作时，将钨丝放入定制的对准工具中以进行切割。用胶带小心固定钨丝的松散端，并将其剪至所需长度。

接下来，轻轻拉动胶带，将钨丝从对准工具上取下，确保所有钨丝仍附着在胶带上。然后，将胶带卷到一根抛光的黄铜芯轴上，并将钨丝牢固地压在芯轴表面，以确保良好的电接触。

随后，将转轴连接到工作站内的5 RPM电机上。转轴的接入角度相对于刻蚀液表面为45度。接着，将三分之一的导线浸入溶液中。

接下来，将碳棒电极浸入蚀刻液中以闭合电路。开启工作站，使转轴开始旋转，然后调节通过电极和蚀刻液的电流至250毫安。当电流降至200毫安时，停止尖端蚀刻，以便将导线尖端蚀刻成极细的点状。

现在，将一根金属丝插入一根下端用橡皮泥封堵的硼硅酸盐玻璃毛细管中。使用加热线圈和悬垂的活塞夹持移液管。在将装置置于显微镜下之前，先将包有玻璃的金属丝固定在载玻片上。

调整尖端，使硼酸珠处于焦点位置。然后加热硼酸珠，直至其略微熔化。随后，将约10至15微米的金属丝尖端插入，并关闭加热电位器。

当微珠冷却后，将电极尖端的玻璃移除，以暴露钨丝。为获得约15毫米的尖端，将拉制仪设定为适当的参数。牵拉毛细管，得到两个尖端隔离的移液器。

使用油灰将杆状移液管固定在载玻片上，并用精细剪刀、镊子或手术刀的平面端将其尖端折断。轻微调整电极与多通道管之间的角度，以获得更好的结合效果和更细的整体结构。在显微镜下，仔细将钨电极对准多通道管的尖端。

对齐后，降低电极直至其接触多管微管。将电极嵌入上部两根微管之间的凹槽，然后滑动电极尖端，使其突出于多管微管尖端15至20微米。现在，在距离钨丝和多管微管组件尖端约5毫米处，滴加少量光固化胶粘剂。

避免胶水到达尖端，以防堵塞多通道管，然后使用蓝光LED灯固化胶水。现在，将麻醉后的动物置于加热毯上，使其体温维持在38摄氏度，并用立体定位仪的两个耳杆和一个咬合杆固定动物头部。随后，涂抹眼用凝胶以保护眼睛。接下来，剃除头皮毛发，并使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并将覆盖在顶骨及枕骨较前部区域的骨膜剥离。

接下来，在颅骨和头柱基部涂抹一层薄薄的光固化胶。等待10秒，然后将头柱放置在顶骨前部区域的中线上。使用蓝光源照射20秒以固化胶水，确保获得有效的粘接强度。

随后，使用小钻头在头柱基部周围和后方钻两个孔。将一枚表用螺丝放入钻好的孔中，作为颅骨与头固定装置之间的额外接触点。旋转一圈半，使螺丝紧密贴合，并用镊子测试，确保其无松动。

然后，将银质接地线的尖端插入第三个孔中，并确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水氰基丙烯酸酯胶水，将导线固定于颅骨上。随后，使用光固化复合树脂覆盖头固定柱的基部、银线的下部以及螺钉，以增强头固定柱与颅骨之间的结合强度。

注意不要超过人字缝，以便在记录过程中留出操作空间，并使用蓝光源固化复合材料。然后，向后牵拉颈部后方靠近颅骨附着点处的肌肉。使用小型环钻，在人字缝下方、中线外侧钻出一个圆形窗口，以暴露下丘。

在此步骤中，将动物的身体放入定制的泡沫垫固定装置中。将头部固定杆连接至立体定位仪框架上的固定夹具。此时可给予动物液体奖励。

接着，用棉质毯子覆盖动物的身体，并使用塑料半圆筒和胶带松散固定。使用带有柔性尖端的注射器将选定的药物注入多管电极的各管中。利用显微操作器，将多管电极放置在其电极架上。

接下来，将一根未编码的银丝放入每个筒内，使其一端与溶液接触，另一端可连接。然后将这些端连接至微离子电渗装置。之后，将正极端连接至钨电极的末端，将接地端连接至与硬脑膜接触的银丝。

随后，移动多管电极，直至其尖端接触脑表面。滴加温热的无菌生理盐水，以防止脑组织干燥。此时，在寻找单个神经元活动的同时，施加保持电流，以避免药物从电极管尖端泄漏。

记录神经活动及加巴嗪的离子电渗应用。图中显示了在小脑下丘记录的四个神经元在加巴嗪微离子电渗注射前后对频率的响应区域。黑色十字标记了被选作稀有和重复声音呈现的频率。

以下是呈现所有频率和强度刺激前后，在注射加巴嗪前和注射期间神经反应的累积刺激前时间直方图。黑色条形表示声音持续时间。下图为在加巴嗪应用前后，对一对频率刺激产生的放电反应的点阵图，其中稀少刺激以红色显示，重复刺激以蓝色显示。

阴影背景表示刺激的持续时间。这些点阵图显示了当不同频率的相对概率发生切换时的神经反应。该图展示了单个神经元对七组频率的反应，这些频率在给予加巴喷丁之前和期间分别作为稀有声音和重复声音呈现。

该图显示了在施加加巴青（gabazine）之前和期间，神经反应对罕见声和重复声的SSA指数。一旦掌握，所述方法即可根据目标神经结构和神经元类型，调整特定参数。在尝试固定动物头部进行记录时，必须牢记记录时间由动物的适应程度决定并受其限制；但一个重要优势是，可在同一只动物上间隔数天进行多次记录切口，从而最大限度地减少动物使用数量。

通过使用背负式电极进行微电泳，可结合其他操作（如神经递质注射），以回答更多问题，例如记录位点内神经元的输入来源及其投射靶区。在清醒动物实验中，一个关键问题是动物的福利，因此绝不能超过实验方案中批准的清醒时长，并请持续监测动物是否出现任何不适迹象。一旦发现异常，必须立即停止记录。