一种靶向并分离小鼠气道支配感觉神经元的方法

本实验的总体目标是标记并分离支配气道的迷走神经结状神经元。该方法有助于回答外周神经生物学领域中的关键问题，例如，支配气道的神经元具有哪些鉴定特征？

该技术的主要优势在于，它为靶向和分离特定神经元群体提供了一种稳健且高通量的方法。在收获感觉神经节后，从每根试管中吸取500微升神经节解离液，注意不要扰动神经节。接着，向每个样本中加入1毫升PBS，并等待神经节沉降至试管底部。

然后，移除 PBS，并向神经元中加入一毫升含有消化酶的神经节消化液，随后向阳性对照管中加入 20 微升 Fast Blue。根据消化酶的使用年龄，将各管在 37 摄氏度下孵育适当时间。每 15 分钟轻轻振荡并轻弹管壁数秒，以确保神经节被消化液充分覆盖。

在消化神经细胞的同时，每份样品取一支1.5毫升离心管，将400微升新配制的12%密度溶液缓慢而小心地加至400微升28%密度溶液上方。应可见两层清晰的液层，其中一层颜色较另一层更深。接着，为分选过程标记1.5毫升收集管，每份分选样品需准备一支Fast Blue阳性管和一支Fast Blue阴性管。

消化结束后，弃去消化酶，并用一毫升 PBS 如上所述将神经节清洗两次。第二次清洗后，向每根试管中加入 200 微升新鲜的神经节分离液。然后，将 200 微升移液器调至 100 微升体积，反复吹打神经节数次，使细胞解离成单细胞悬液，注意避免产生气泡。

当看不到完整的组织碎片时，用一只手牢牢握住70微米的细胞筛，将消化后的细胞溶液用移液器滴加到筛网中央。然后用100微升新鲜的神经节消化液冲洗消化管，以收集残留的细胞。将冲洗液经细胞筛过滤，并使用新的移液枪头吸取筛网下方残留的含细胞溶液，将其加入细胞悬液中。

现在将全部300微升细胞小心地铺在先前制备好的密度梯度液上方，并通过离心收集神经节细胞。在细胞离心的同时，向Fast Blue阳性收集管中加入300微升 freshly prepared 裂解缓冲液，向阴性收集管中加入600微升裂解缓冲液，以确保分选鞘液不会显著稀释裂解缓冲液。

离心结束后，小心移除上层700微升溶液，该溶液含有大部分细胞碎片。然后将700微升新鲜的神经节解离溶液与剩余细胞混合。通过离心收集细胞沉淀，并小心弃去上清液。

然后用1,000微升移液器（设定为200微升）将细胞重悬于200至300微升的分选神经节解离溶液中。将细胞置于冰上，直至准备进行分选。通过FACS纯化神经节细胞后，将神经元在裂解缓冲液中涡旋震荡一分钟以进行匀浆。

接下来，用一体积的70%乙醇将细胞反复混匀数次，并将最多700微升样品转移至离心柱中。在微量离心机中以8,000 × g离心15秒，弃去滤过液。当全部样品均通过离心柱后，按照标准RNA纯化流程提取RNA。

然后根据制造商的说明，使用微流控电泳系统检测 RNA 质量。在这些图中，显示了用于设定分选门的阴性与阳性 Fast Blue 对照。随后可将解离的 Fast Blue 标记的结状神经节细胞分选为 Fast Blue 阳性和 Fast Blue 阴性群体。

该方法的分选效率为73%至85%，平均收集到约1,500个或更少的Fast Blue阳性细胞以及近60,000个Fast Blue阴性细胞。如本代表性样本所示，通过微流控电泳获得的18S和28S峰可用于计算RNA完整性数值（RIN），以评估提取RNA的质量。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四个半小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要迅速完成各个步骤，并使用 freshly prepared 溶液进行 RNA 提取。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如神经元培养，以回答更多问题，例如：支配气道的神经元具有哪些独特的功能特性？该技术建立后，为外周神经生物学领域的研究人员探索迷走神经结状神经节中特定气道支配神经元群体的独特性质奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分掌握如何标记并分离结节神经节中的特定神经元，这些神经元随后可用于RNA测序，或接种用于功能研究。请务必注意，使用2-巯基乙醇具有极高危险性，操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套并在通风橱中进行操作。