Name: 从多能干细胞使用BMP拮抗剂Grem2心房心肌细胞分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习使用Grem2从多能干细胞分化心房心肌细胞的方法。该方案可高效产生均一的心房心肌细胞群体，适用于心脏发育和房性心律失常疾病研究，操作简便，适合不同经验水平的研究人员。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为HL083958和HL100398（A.K.H.），以及2T32HL007411-33&#34;心血管机制研究培训项目：研究培训&#34;（J.B.）。

1. 细胞培养基、溶液和试剂的准备。
<ol>
	<li>通过混合并经无菌过滤（0.2 μm）制备 500 ml 小鼠胚胎干细胞（mESC）培养基 &#956;m孔径）445 ml格拉斯哥最低必需培养基（GMEM），50 ml热灭活胎牛血清（FBS），5 ml 100倍浓缩L-谷氨酰胺替代液，5 &#181;l 重组小鼠白血病抑制因子（LIF）1 × 107 单位/毫升，以及 1.43 &#181;l β-巯基乙醇（终浓度为 50 &#181;M）。4 ℃保存 &#730;C，待使用时取出。</li>
	<li>通过混合并经无菌过滤 391 ml Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM）、100 ml 热灭活 FBS、5 ml 100X 浓缩 L-谷氨酰胺替代物、5 ml 100X 浓缩非必需氨基酸（NEAA）和 2.86 &#181;l β-巯基乙醇（终浓度为100） &#181;M）。4 ℃保存&#730; C，待使用时取出。</li>
	<li>将1 g猪皮明胶粉末与500 ml过滤蒸馏水混合，配制0.2% w/v的明胶溶液2O. 通过高压灭菌进行灭菌。注意，明胶在室温水中可能无法完全溶解。高压灭菌后，明胶应完全溶解。置于室温保存，待用时取出。</li>
	<li>通过将50的Grem2重组蛋白溶解，制备其分装液 &#181;100 中的 g 冻干 Grem2 小球 &#181;l 磷酸盐缓冲液（PBS），添加 0.1% BSA，配制成 0.5 &#181;g/&#181;l 原液。分装 20 &#181;将该储备液分装至五个无菌的 1.5 ml 离心管中，于 -80 ℃ 保存&#730; C，待用前保存。</li>
	<li>根据已发表的方案配制 PBS，或购买 10X 储存液，用过滤的蒸馏水按 1:10 稀释2O 以制备 1X 工作稀释液19. 使用前通过高压灭菌对 PBS 进行灭菌。室温保存至使用前。在某些步骤中，使用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 使用该试剂。此试剂以1X溶液形式购买。订购信息见试剂表。</li>
</ol>
2. 准备明胶包被的10 cm组织培养皿
<ol>
	<li>在无菌组织培养罩内，向每个10 cm组织培养皿中加入5 ml 0.2%明胶溶液进行包被。将培养皿置于37 ˚C培养箱中孵育至少30分钟，或最长可至4天。</li>
</ol>
3. 明胶包被的6孔组织培养板的制备
<ol>
	<li>在无菌组织培养操作台中，向6孔组织培养板的每个孔中加入1 ml 0.2%明胶。将培养板置于37 ˚C培养箱中孵育至少30分钟，或最长可至4天。</li>
</ol>
4. 胚胎干细胞培养
<ol>
	<li>解冻小鼠胚胎干细胞（mESCs）
	<ol>
		<li>在无菌的组织培养超净台中，将mESC培养基升温至室温（RT）。取10 ml室温培养基加入已包被明胶的10 cm培养皿中。</li>
		<li>从冻存中取出1管约含1 × 106个细胞的mESCs。用镊子夹住冻存管，放入37 ˚C水浴中，轻轻摇动直至细胞悬液完全解冻，仅在管中心残留微小冰晶。用一次性无尘擦拭布擦干冻存管表面，并用70%乙醇进行消毒。</li>
		<li>在无菌组织培养超净台中，使用P1000枪头将解冻后的细胞从冻存管中移出，转移至步骤4.1.1中准备好的10 cm培养皿中。</li>
		<li>将10 cm培养皿放入37 ˚C、含5% CO2的加湿细胞培养箱中，通过轻轻前后移动、再左右移动培养皿的方式使细胞均匀分布。让细胞贴壁过夜（O/N）或至少6小时。</li>
		<li>次日清晨首先使用明场显微镜检查细胞贴壁情况。培养基中可见少量细胞碎片和死亡细胞，此现象属正常。吸除培养皿中的培养基，更换为10 ml新鲜mESC培养基。</li>
		<li>每天持续更换培养基，以防止细胞发生分化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传代mESCs
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到60–70%时进行传代。吸除培养基，用5 ml无MgCl2和CaCl2的无菌1×DPBS冲洗一次。加入2 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，置于37 ˚C培养箱中孵育5分钟。</li>
		<li>细胞孵育期间，准备新的10 cm培养皿：吸除明胶溶液，加入10 ml室温mESC培养基。5分钟后检查细胞是否脱落。若细胞仍未脱落，继续以每次2分钟的间隔在37 ˚C培养箱中孵育，直至细胞完全脱落。</li>
		<li>加入3 ml mESC培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的作用。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟以收集细胞沉淀。吸除上清液，将沉淀重悬于10 ml mESC培养基中。</li>
		<li>根据所需的传代比例，将0.5–1.0 ml细胞悬液加入步骤4.2.2中准备好的每个培养皿中。将培养皿放入培养箱，通过轻轻前后移动再左右移动的方式使细胞均匀分布。让细胞贴壁过夜（O/N）或至少12小时。 
		注意：大多数mESC细胞系常用的传代比例为1:10至1:20。该比例可能因细胞系、传代次数及新培养皿中期望的融合度而有所不同。对于1:10的传代比例，可将1 ml细胞悬液加入9 ml mESC培养基中，接种至新制备的明胶包被10 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 胚状体的制备
注意：除离心步骤外，所有操作均须在无菌细胞培养罩内进行。
<ol>
	<li>在EB培养基中制备细胞悬液
	<ol>
		<li>当细胞达到70%汇合度时（通常为传代后24–48小时），用于拟胚体（EB）形成。通过按照第4.2.1）– 4.2.3）节所述方法进行消化和离心，制备用于拟胚体形成的细胞。 
		注意：细胞复苏后最好至少传代一次，并检查细胞状态（例如，极少的细胞死亡，无污染，形态正常）和旺盛的生长（例如每次传代间隔24-48小时，细胞数量翻倍，此状态下的细胞用于制备拟胚体（EBs）。</li>
		<li>将沉淀重悬于5 ml EB培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
		<li>在所需体积的EB培养基中稀释细胞悬液，使其终浓度为25个细胞/μL&#181;升（或 2.5 × 10）4 细胞/ml）。注意，每个培养皿盖可容纳约60个EB，需要约1.3 ml细胞悬液。在此步骤中，应准备足够体积的细胞悬液以生成所需数量的EB。例如，若实验需要240个EB，则准备5.2 ml浓度为2.5 × 10⁵细胞/ml的细胞悬液。4 细胞/毫升 
		注意：未用于拟胚体形成的mESC可通过离心、重悬于mESC培养基中，并按照4.2节所述方法接种，用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎体的制备
	<ol>
		<li>在每个无菌10 cm细菌培养皿底部加入2 ml 1×PBS，用于悬滴形成。</li>
		<li>将第5.1步中的EB悬液转移至无菌溶液盆中。</li>
		<li>从已准备好的培养皿中取下盖子，并小心地放入六十个、20 &#181;将EB悬浮液的液滴加到培养皿内表面。使用装有6个吸头的多通道移液器可高效完成此操作。每个20 &#181;l滴现在含有500个细胞。</li>
		<li>轻轻将培养皿盖盖回细菌培养皿的底部，注意不要碰落悬滴。将培养皿放入37 ℃细胞培养箱中&#730; C. 2天后，细胞即可按照5.3）中的描述进行洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎体的洗脱处理 
	注意：所有洗涤步骤均在无菌细胞培养超净台中进行。
	<ol>
		<li>2天后，EB即可进行洗涤并转移至6 cm细菌培养皿中。每皿预先将3 ml EB培养基平衡至室温。每个6 cm细菌培养皿可有效承接2个培养皿盖量的悬滴。 
		注意：此步骤务必使用未包被的培养皿（见材料表）。请勿使用组织培养皿或任何促进细胞贴附的表面。胚胎体（EBs）应保持悬浮于培养基中，直至按第6节所述准备接种。</li>
		<li>从培养箱中取出10 cm培养皿，放入无菌细胞培养操作台。小心取下含有拟胚体的皿盖，并将其倾斜至45度角。</li>
		<li>使用含有 3 ml 室温 EB 培养基的 5 ml 血清移液管，轻轻将拟胚体冲洗至培养皿盖底部的液体中。仔细检查皿盖表面是否有残留的拟胚体，必要时重新冲洗。</li>
		<li>洗涤所有拟胚体后，转移至6 cm培养皿中。</li>
		<li>重复步骤 5.3.2)–5.3.4) 处理所有拟胚体。每个 6 cm 培养皿应包含来自两个 10 cm 培养皿盖的拟胚体。将所有培养皿放回 37 ℃ 培养箱中 &#730;再于 C 条件下培养两天。 
		注意：悬浮培养中的EBs若距离过近，可能会相互粘连形成大的聚集体。这会负面影响心肌细胞分化效率，并显著减少可用的EBs数量。为防止聚集，应每天检查EBs，并通过轻轻前后移动再左右移动的方式将其分开。在早期分化阶段必须使用细菌培养皿，以防止EBs贴壁，从而使其能够在悬浮状态下生长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 胚状体接种与Grem2处理
<ol>
	<li>通过向RT EB培养基中加入适量体积的Grem2储备液（0.5 µg/µl），配制Grem2处理培养基，使其终浓度为1–5 µg/ml。 
	注意：EB处理的有效浓度取决于细胞系及当前批次Grem2的特异性活性。建议在使用前进行剂量滴定，以确定最大有效浓度。对于CGR8小鼠胚胎干细胞系，我们通常使用3–5 µg/ml的Grem2。用于心房肌细胞生成的有效Grem2浓度，应在第7–8天诱导出广泛分布于各孔且快速搏动的细胞。若在处理后的培养物中未观察到搏动表型，建议在上述范围内对Grem2剂量进行滴定调整。</li>
	<li>准备6孔组织培养板：吸除每孔中的明胶涂层溶液，并向每孔加入2 ml RT Grem2处理培养基。将EB从培养箱中取出，置于无菌组织培养超净台内。</li>
	<li>使用调至100 µl的P1000移液器，从6 cm培养皿中转移30个EB至每孔。将板放回培养箱，通过轻轻前后、再左右移动培养板，使EB均匀分散。
	<ol>
		<li>EB贴附于明胶包被的孔板后，每两天更换一次Grem2培养基，持续至第10天。第10天后停止Grem2处理，改为每两天添加新鲜EB培养基，以维持细胞健康状态。 
		注意：贴附后，EB将沿包被表面展平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 用于 RT-qPCR 分析的细胞解离
<ol>
	<li>使用胰蛋白酶-EDTA进行细胞解离
	<ol>
		<li>吸去每个孔中的培养基，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的无菌 DPBS 每孔 1 ml 洗涤两次。</li>
		<li>向需收集细胞的每个孔中加入 0.5 ml 无菌的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
		<li>将培养板置于 37 ˚C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
		<li>5 分钟后检查细胞解离情况。若细胞仍贴壁，可轻敲培养板以促进解离；若轻敲无效，则将培养板重新放回培养箱，每 2 分钟观察一次，直至细胞完全脱落。</li>
		<li>通过向每孔加入 0.5 ml EB 培养基中和胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
		<li>将全部 1 ml 细胞悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。</li>
		<li>&#160;在台式离心机中以 300 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>吸去上清液，立即进行裂解，或在 -70 ˚C 下保存沉淀直至裂解。不建议长期保存细胞沉淀，以免 RNA 降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解与分子分析
	<ol>
		<li>此时可使用商业化的柱提取试剂盒或按照制造商提供的方案使用 RNA 提取试剂进行 RNA 提取（参见材料表）。提取后，将 RNA 反转录为 cDNA，并采用标准技术进行 RT-qPCR 分析20, 21。 
		注：本实验室用于 RT-qPCR 的引物列于表 1。通过联合使用 RT-qPCR 检测心房和心室基因的表达，以及记录动作电位时程的电生理学方法（见第 8 节），确认细胞的心房特性。本方案中列出部分基因作为可靠的心房和心室标志物示例。有关多能干细胞分化背景下心房与心室基因表达的更多资料，参见文献14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 电生理学分析
<ol>
	<li>胶原酶消化细胞
	<ol>
		<li>吸去每孔中的培养基，并用每孔1 ml无菌PBS冲洗两次。</li>
		<li>向每孔中加入0.5 ml浓度为1 mg/ml的胶原酶溶液。</li>
		<li>将培养板放入37 ˚C培养箱中孵育10分钟。</li>
		<li>5分钟后检查细胞解离情况。若细胞仍相互粘连或附着于孔底，可轻轻敲击以松动。随后用P1000移液器轻柔吹打，进一步解离细胞。 
		注意：为便于进行膜片钳记录，应将细胞吹打至形成单细胞悬液。</li>
		<li>向每孔中加入0.5 ml胚胎体（EB）培养基，并通过移液混匀。</li>
		<li>将全部1 ml细胞悬液转移至1.5 ml微量离心管中。</li>
		<li>在台式离心机中以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>吸去细胞沉淀中的上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于500 µl含10% FBS的PBS中，确保通过吹打形成单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电生理学表征 
	注意：本期刊已发表多篇关于使用单细胞膜片钳技术测量细胞膜电位的优秀实验方案。初学者如需详细了解单细胞膜片钳操作，请参考这些方案21-24。以下内容为本实验方案中特定的操作信息，可帮助有经验的电生理学研究人员准备和处理由小鼠胚胎干细胞（mESC）分化而来的心肌细胞（CMs），以实现亚型鉴定。
	<ol>
		<li>配制细胞内记录液，成分如下：10 mM HEPES缓冲液、5 mM MgATP、2 mM EGTA、110 mM谷氨酸钾、10 mM KCl和10 mM NaCl。用NaOH调节溶液pH至7.2。</li>
		<li>配制细胞外记录液（灌流液），成分如下：2 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5.4 mM KCl和137 mM NaCl。用NaOH调节溶液pH至7.4。</li>
		<li>使用标准含丝硼硅酸盐玻璃毛细管制备玻璃电极，当用记录液反向充灌时，其电阻应为2-5 MΩ。</li>
		<li>用P200移液器将100 µl细胞悬液转移至含有细胞外记录液的记录 chamber 中。 
		注意：细胞可在悬浮状态下进行膜片钳记录，或为便于操作以及用于药物处理和/或灌流实验，可将细胞接种至明胶包被的盖玻片上，具体操作见8.2.5）。</li>
		<li>通过将直径为10 mm的玻璃盖玻片放入6孔板的每个孔中，并按本方案第3.1）节所述加入明胶溶液，制备明胶包被的玻璃盖玻片。
		<ol>
			<li>至少30分钟后&#160;，吸去明胶溶液，直接向盖玻片上加入100 µl细胞悬液，并将整个6孔板放入培养箱中孵育至少2小时，或直至细胞贴壁。细胞贴壁后，取出盖玻片并置于含细胞外记录液的记录 chamber 中。 
			注意：若使用αMHC-DsRed荧光心脏报告基因mESC系，可通过其红色荧光&#160;细胞核识别心肌细胞。若未使用心脏报告基因系，则可通过观察自发性收缩的细胞并将其分离用于记录。多能干细胞来源的心肌细胞通常体积较小且呈圆形，缺乏成熟成年心肌细胞特有的矩形形态。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>所有记录均在37 ˚C下进行。使用电阻为2-5 MΩ的硼硅酸盐玻璃电极，以电流钳模式进行单细胞全细胞膜片钳记录。施加轻柔的负压以形成吉欧姆密封，随后在获得全细胞构型前施加快速负压以破裂膜片，实现全细胞接入，再开始记录膜电位。</li>
		<li>通过4&#160;ms的去极化电流注入诱发动作电位。 
		注意：对于多能干细胞（PSC）来源的心肌细胞，诱发可重复动作电位所需的电流强度可能有所不同。为确定最佳阈值电流，建议从较低电流开始，逐步增加刺激电流幅度，直至获得可重复的动作电位。 
		注意：Grem2诱导的房性心肌细胞的动作电位持续时间通常在20-40 ms范围内，且无平台期（图6B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本文作者不存在竞争性经济利益。

该方案通常可获得高比例的心肌细胞（CMs），这些细胞具有心房谱系的特征。与任何分化方案一样，分化前小鼠胚胎干细胞（mESCs）的质量需特别关注。应常规监测mESCs是否具有正常的形态学特征（图1A）。在拟胚体（EBs）形成前若出现任何自发分化，将显著降低心脏分化效率，因此在传代前应将其清除（图1B）。EB的大小也会影响心脏分化效率。每EB接种200至1,000个细胞的条件已进行过测试，通常每EB 500个细胞可获得最多数量的心肌细胞。在EB形成前一天进行传代的细胞通常也具有更高的分化效率。
本方案中采用&#34;悬滴&#34;法生成拟胚体（EBs）25。已有文献报道其他用于心肌分化的拟胚体生成方法26-29。该&#34;悬滴&#34;法操作简便、成本低廉，任何配备常规细胞培养设备和材料的实验室均可轻松实施，且具备细胞培养经验的人员均可操作。该方法还具有良好的灵活性，所生成的拟胚体可根据研究人员的需求方便地进行操作、转移、接种或收集用于RNA分析。此外，该方法具有可扩展性，...

多能干细胞是基础研究和临床前研究中用于生成和研究难以获取的组织细胞的有力工具，尤其在人类研究中具有重要意义1-5。通过适当调控发育相关的信号通路，可引导多能干细胞向特定表型命运分化。目前已有多种方案被开发用于从多能干细胞生成心肌细胞（CMs）6-14。这些方案通常通过定时添加外源性生长因子和/或小分子，调控TGFβ超家族（包括Activin、BMP和TGFβ）以及Wnt信号通路10,12-15。这些方法通常能有效提高分化为心肌细胞的细胞比例，但特异性不足，常产生包含心房、心室以及结节/传导系统谱系的混合细胞群体。为了研究特定的心脏亚型，需要采用更具靶向性的分化策略。
Gremlin2（Grem2，也称为与Dan和Cerberus相关的蛋白，简称PRDC）是一种分泌型BMP拮抗剂，是必需的&#160;在斑马鱼心脏发育过程中，实现正常的心脏分化和心房腔室形成16在分化第4天（即中胚层标志物T-Brachyury和Cerberus like 1表达达峰后）用Grem2处理正在分化的胚胎干细胞，可提高心肌细胞产量，并产生以心房谱系为主的细胞群体14.
重组Grem2可用于处理正在分化的细胞，可通过标准蛋白质生产技术制备17，也可商业购买。该蛋白在水溶液中具有高溶解性，可根据需要在特定时间点外源性地添加到细胞培养体系中。
可通过RT-qPCR定量心血管前体细胞、心脏前体细胞及终末分化的心肌细胞代表性标志物的表达，以追踪分化过程。此外，也可利用免疫荧光技术鉴定并可视化展示不同类型心脏细胞的空间分布。
在需要纯细胞群体的应用中，使用报告系统来识别和分离心肌细胞（CMs）更为便捷。为此，我们已将αMHC-DsRedNuc构建体导入小鼠CGR8胚胎干细胞系14。CGR8细胞无需饲养层细胞即可生长并维持其多能性，有利于扩增和分化实验的开展18。该胚胎干细胞系包含一个DsRed荧光蛋白编码序列，其受控于心脏特异性的α肌球蛋白重链基因启动子（αMhc 或 Myh6），并带有核定位信号。利用这些细胞，可方便地识别和分离心肌细胞，用于定量分析&#160;、细胞分选&#160;、电生理学研究、药物筛选以及心房分化机制的探讨。

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细菌培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 细菌培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 重组蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>明胶（来自猪皮）</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS，无菌</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

利用bmp拮抗剂grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

从多能干细胞生成心肌细胞群体的方案已有报道，但这些方法通常产生表型混合的细胞。对于希望开展特定心肌细胞亚型研究的研究人员而言，需要采用更为定向的分化策略。通过使用Grem2处理小鼠胚胎干细胞（ES细胞），Grem2是一种分泌型BMP拮抗剂，在心房腔室形成过程中具有必要作用 体内，可生成大量具有心房表型的心脏细胞。利用经基因工程改造的Myh6-DSRed-Nuc多能干细胞系，可实现对心肌细胞的识别、筛选与纯化。本方案中，采用悬滴法由Myh6-DSRed-Nuc细胞生成拟胚体，并在悬浮状态下培养至分化第4天（d4）。在d4时，细胞经Grem2处理后接种于明胶包被的培养板上。在d8至d10期间，培养物中出现大面积收缩区域，并持续扩展和成熟至d14。分子、组织学及电生理学分析表明，经Grem2处理的细胞获得类似心房的特征，提供了一种 体外 用于研究心房心肌细胞的生物学特性及其对各种药理学试剂的反应的模型。

在诱导分化之前，多能干细胞应呈致密集落状，且无自发分化现象。图1A所示的细胞已准备好进行单细胞化处理，并用于后续悬滴法操作，具体步骤详见方案部分的5.1。图1B所示的细胞已发生自发分化，不应用于悬滴的制备。
包含的面板 图2 在分化第2天显示出成功形成的小体。优质的小体通常在均匀分布、形态圆润的悬滴中形成，如图所示。 图2到分化第2天，应可在悬滴末端用肉眼观察到拟胚体，其为正在分化的干细胞形成的球形聚集体图2）。这些拟胚体已准备好进行方案部分5.3所述的洗脱步骤。
在第2至4天期间，悬浮培养中洗涤下来的拟胚体应持续增大。到第4天时，结构良好的拟胚体应呈游离状态，且在...

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子 Grem2，既可增加所获得的心肌细胞数量，又能生成具有心房表型的心肌细胞。

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

从多能干细胞生成心肌细胞群体的方案已经建立，但这些方案通常产生的是混合细胞……

本分化方案的总体目标是在体外培养中生成均一的心房型心肌细胞群体。因此，该方法有助于回答心脏发育及心脏疾病（如心房心律失常）研究中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在体外获得均一的心房型心肌细胞培养物，且操作过程无需复杂的培训即可完成。在建立小鼠胚胎干细胞（mESC）培养物前最多四天，于无菌组织培养罩内，用5毫升0.2%明胶溶液对10厘米培养皿进行编号处理，或在六孔板中每孔加入1毫升明胶溶液。在培养当天，吸除多余的明胶溶液，并向一个已包被明胶的10厘米培养皿中加入10毫升培养基。随后，使用冻存管夹将一支含有1×10⁶个mESC的冻存管置于37°C水浴中轻轻摇动，直至管中心仅剩少量冰晶为止。使用一次性无绒擦拭布干燥小瓶，并用70%乙醇对其进行灭菌。然后将小瓶放入组织培养罩内，使用P1000移液器将ESC加入培养皿中。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的加湿细胞培养孵育箱中，并轻轻前后左右晃动培养板，以均匀分散细胞。孵育结束时，使用明场显微镜确认细胞贴壁情况。可观察到部分碎片和死亡细胞。更换为10毫升新鲜的mESC培养基，并将细胞放回培养箱中。当细胞培养至60%至70%融合时，用5毫升无镁和钙的无菌DPBS冲洗培养板，并在37°C下用2毫升胰蛋白酶EDTA孵育细胞5分钟。在细胞孵育期间，从每次传代所需的一个新的10厘米培养皿中吸除多余的明胶溶液，并向每个培养皿中加入10毫升培养基。然后将脱落的细胞收集到15毫升离心管中，通过离心沉淀，并将沉淀重悬于10毫升mESC培养基中。根据所需的分瓶比例，将 0.5 至 1 毫升细胞悬液加入每个 10 厘米培养皿中，并将培养皿放回培养箱，轻柔地晃动使细胞均匀分布，操作方法如前所述。当传代细胞达到 70% 汇合度时，用胰蛋白酶 EDTA 按前述方法消化并收集细胞，然后将单细胞悬液重悬于 5 毫升拟胚体（embryoid body，EB）培养基中。计数 mESC，随后用适量 EB 培养基稀释，使其最终浓度为每毫升 2.5 × 10³ 个细胞。接下来，向每个悬浮液滴培养用的无菌10厘米细菌培养皿底部加入2毫升PBS，并将EB悬液转移至无菌溶液盆中。现在，取一个已准备好的培养皿，打开皿盖，使用装有六个吸头的多通道移液器，小心地将60个20微升的EB悬液滴加到培养皿内表面。轻轻盖上皿盖，注意避免震落悬滴，并将培养皿放入细胞培养箱中培养两天。为了收集EB，小心地取下悬滴培养的盖子，并将其倾斜45度角。然后，使用含有室温EB培养基的5毫升血清移液管，轻轻地将EB冲洗至盖子底部形成液滴。仔细检查盖子表面是否有EB粘附，随后将EB转移至未包被的6厘米培养皿中。将拟胚体放回组织培养孵育箱中继续培养两天，每天观察拟胚体的聚集和贴壁情况。在接种拟胚体之前，将已准备好的六孔板每孔中的过量明胶包被液更换为2毫升新配制的室温Grem2处理培养基。然后使用设置为100微升的P1000移液器，将30个拟胚体转移至每个孔中，随后将培养板放回孵育箱过夜培养，并通过轻柔晃动使细胞均匀分散，操作方法如演示所示。在胚体（EB）贴附于孔板底部后，每隔两天更换一次Grem2培养基，直至第10天。随后，每隔两天用新鲜的EB培养基喂养细胞，以维持健康的细胞培养状态。在进行悬滴培养之前，多能干细胞应呈致密状态，且无自发分化现象。若观察到自发分化，则不应将这些细胞用于悬滴培养。高质量的拟胚体通常在间距均匀、形态圆润的悬滴中形成最佳。至分化第二天，拟胚体应已肉眼可见，表现为位于悬滴末端、呈球形排列的正在分化中的干细胞团。在第4天，结构良好的类胚体（EB）应呈悬浮状态，且大小和形状均一。一旦接种到培养板上，类胚体（EB）会逐渐扁平化，因为细胞从类胚体迁移至组织培养板表面，如在分化第8天和第10天所观察到的现象。在未经处理的对照孔中，最早可在第6天、最晚至第9天观察到微小且收缩缓慢的细胞区域。而在Grem2处理的孔中，常见较大片且收缩速度相对较快的细胞区域。对分化细胞进行RT-QPCR基因表达分析通常显示，经Grem2处理的培养物中，心脏结构基因和调控基因的表达水平较高。若使用alpha-MHC DsRed nuke细胞系，则可在Grem2处理的孔中观察到DsRed标记的细胞核数量增多，表明心肌细胞产量增加。Grem2 处理还可使分化偏向心房样表型，这已通过 RT-qPCR 和细胞动作电位持续时间的膜片钳测量得到证实。一旦掌握该技术，可在诱导分化的第4天（原肠胚形成标志物如 brachyury 表达达峰后）仅用60分钟即加入 Grem2 进行处理，通常在第7天即可观察到呈串珠状的细胞。完成此操作后，可进一步采用电生理学和定量PCR等方法，以研究所获得细胞的功能特性与分子特征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用Grem2从小鼠ESC诱导生成心房样心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从多能干细胞使用BMP拮抗剂Grem2心房心肌细胞分化

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本方法的目的是在体外生成心区特异的心脏前体细胞，以研究前体细胞的特化过程和功能特性，并生成心腔特异的心脏细胞用于心脏疾病建模。...

体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。...

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

学习使用Grem2从多能干细胞分化心房心肌细胞的方法。该方案可高效产生均一的心房心肌细胞群体，适用于心脏发育和房性心律失常疾病研究，操作简便，适合不同经验水平的研究人员。

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

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