利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞
2016年3月10日
从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子 Grem2，既可增加所获得的心肌细胞数量，又能生成具有心房表型的心肌细胞。
本分化方案的总体目标是在体外培养中生成均一的心房型心肌细胞群体。因此，该方法有助于回答心脏发育及心脏疾病（如心房心律失常）研究中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在体外获得均一的心房型心肌细胞培养物，且操作过程无需复杂的培训即可完成。
在建立小鼠胚胎干细胞（mESC）培养物前最多四天，于无菌组织培养罩内，用5毫升0.2%明胶溶液对10厘米培养皿进行编号处理，或在六孔板中每孔加入1毫升明胶溶液。在培养当天，吸除多余的明胶溶液，并向一个已包被明胶的10厘米培养皿中加入10毫升培养基。随后，使用冻存管夹将一支含有1×10⁶个mESC的冻存管置于37°C水浴中轻轻摇动，直至管中心仅剩少量冰晶为止。
使用一次性无绒擦拭布干燥小瓶，并用70%乙醇对其进行灭菌。然后将小瓶放入组织培养罩内，使用P1000移液器将ESC加入培养皿中。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的加湿细胞培养孵育箱中，并轻轻前后左右晃动培养板，以均匀分散细胞。
孵育结束时，使用明场显微镜确认细胞贴壁情况。可观察到部分碎片和死亡细胞。更换为10毫升新鲜的mESC培养基，并将细胞放回培养箱中。
当细胞培养至60%至70%融合时，用5毫升无镁和钙的无菌DPBS冲洗培养板，并在37°C下用2毫升胰蛋白酶EDTA孵育细胞5分钟。在细胞孵育期间，从每次传代所需的一个新的10厘米培养皿中吸除多余的明胶溶液，并向每个培养皿中加入10毫升培养基。然后将脱落的细胞收集到15毫升离心管中，通过离心沉淀，并将沉淀重悬于10毫升mESC培养基中。
根据所需的分瓶比例，将 0.5 至 1 毫升细胞悬液加入每个 10 厘米培养皿中，并将培养皿放回培养箱，轻柔地晃动使细胞均匀分布，操作方法如前所述。当传代细胞达到 70% 汇合度时，用胰蛋白酶 EDTA 按前述方法消化并收集细胞，然后将单细胞悬液重悬于 5 毫升拟胚体（embryoid body，EB）培养基中。计数 mESC，随后用适量 EB 培养基稀释，使其最终浓度为每毫升 2.5 × 10³ 个细胞。
接下来，向每个悬浮液滴培养用的无菌10厘米细菌培养皿底部加入2毫升PBS，并将EB悬液转移至无菌溶液盆中。现在，取一个已准备好的培养皿，打开皿盖，使用装有六个吸头的多通道移液器，小心地将60个20微升的EB悬液滴加到培养皿内表面。轻轻盖上皿盖，注意避免震落悬滴，并将培养皿放入细胞培养箱中培养两天。
为了收集EB，小心地取下悬滴培养的盖子，并将其倾斜45度角。然后，使用含有室温EB培养基的5毫升血清移液管，轻轻地将EB冲洗至盖子底部形成液滴。仔细检查盖子表面是否有EB粘附，随后将EB转移至未包被的6厘米培养皿中。
将拟胚体放回组织培养孵育箱中继续培养两天，每天观察拟胚体的聚集和贴壁情况。在接种拟胚体之前，将已准备好的六孔板每孔中的过量明胶包被液更换为2毫升新配制的室温Grem2处理培养基。然后使用设置为100微升的P1000移液器，将30个拟胚体转移至每个孔中，随后将培养板放回孵育箱过夜培养，并通过轻柔晃动使细胞均匀分散，操作方法如演示所示。
在胚体（EB）贴附于孔板底部后，每隔两天更换一次Grem2培养基，直至第10天。随后，每隔两天用新鲜的EB培养基喂养细胞，以维持健康的细胞培养状态。在进行悬滴培养之前，多能干细胞应呈致密状态，且无自发分化现象。
若观察到自发分化，则不应将这些细胞用于悬滴培养。高质量的拟胚体通常在间距均匀、形态圆润的悬滴中形成最佳。至分化第二天，拟胚体应已肉眼可见，表现为位于悬滴末端、呈球形排列的正在分化中的干细胞团。
在第4天，结构良好的类胚体（EB）应呈悬浮状态，且大小和形状均一。一旦接种到培养板上，类胚体（EB）会逐渐扁平化，因为细胞从类胚体迁移至组织培养板表面，如在分化第8天和第10天所观察到的现象。在未经处理的对照孔中，最早可在第6天、最晚至第9天观察到微小且收缩缓慢的细胞区域。
而在Grem2处理的孔中，常见较大片且收缩速度相对较快的细胞区域。对分化细胞进行RT-QPCR基因表达分析通常显示，经Grem2处理的培养物中，心脏结构基因和调控基因的表达水平较高。若使用alpha-MHC DsRed nuke细胞系，则可在Grem2处理的孔中观察到DsRed标记的细胞核数量增多，表明心肌细胞产量增加。
Grem2 处理还可使分化偏向心房样表型，这已通过 RT-qPCR 和细胞动作电位持续时间的膜片钳测量得到证实。一旦掌握该技术，可在诱导分化的第4天（原肠胚形成标志物如 brachyury 表达达峰后）仅用60分钟即加入 Grem2 进行处理，通常在第7天即可观察到呈串珠状的细胞。
完成此操作后，可进一步采用电生理学和定量PCR等方法，以研究所获得细胞的功能特性与分子特征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用Grem2从小鼠ESC诱导生成心房样心肌细胞。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案详细描述了在体外从多能干细胞生成均一的心房型心肌细胞群体的方法。利用心房化因子Grem2可提高细胞产量并促进心房表型的形成，从而推动心脏发育及心脏疾病相关研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏生物学
- 干细胞分化
- 心律失常
背景
- 心肌细胞对于研究心脏功能和疾病至关重要。
- 多能干细胞可分化为多种细胞类型，包括心肌细胞。
- 心房心肌细胞在理解心房心律失常方面发挥关键作用。
- 现有方法在细胞群体的效率和均一性方面可能存在不足。
研究目的
- 在体外生成心房型心肌细胞，用于科研目的。
- 利用Grem2提高心肌细胞的产量。
- 提供一种简便的实验方案，便于经基础培训的研究人员使用。
使用的方法
- 明胶包被培养皿的制备。
- 小鼠胚胎干细胞（mESCs）的培养。
- 应用Grem2以增强心肌细胞分化。
- 维持培养条件以促进心房表型的形成。
主要结果
- 成功生成均一的心房型心肌细胞群体。
- 应用Grem2可提高心肌细胞的产量。
- 该方案操作简便，适用于研究人员使用。
- 在心脏疾病与心脏发育研究中具有潜在应用价值。
结论
- 本方案提供了一种可靠的方法用于生成心房型心肌细胞。
- 产量和表型的提升有助于推动心脏研究。
- 适用于不同经验水平的研究人员。
常见问题
行业重要性概述
从多能干细胞生成均一的心房型心肌细胞群体，满足了心脏药物发现和安全性药理学中的关键需求。该方法能够对心房特异性靶点进行机制性风险评估，并提高心房心律失常临床前模型的预测可靠性。该技术通过提供与疾病相关的系统，支持靶点验证和检测方法开发，从而实现转化研究的连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可验证心房特异性治疗假设并阐明相关通路。
- 操作价值：提供均一的细胞系统，用于功能靶点验证和生物学风险评估。
- 预测价值：通过降低心房心肌细胞生物学机制的不确定性，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可生成标准化的心房心肌细胞培养物，适用于检测方法开发和表型筛选。
- 操作价值：确保收缩功能和电生理检测结果的可重复性与可扩展性。
- 检测适用性：通过稳定一致的细胞反应和成熟时间进程，实现对化合物的可靠评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：建立心房心肌细胞的体外模型，用于研究心房心律失常的机制。
- 转化生物标志物：支持与心房表型的分子和电生理标志物相一致的研究。
- 临床前连续性：有助于从发现到临床前验证阶段的基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可融入从干细胞分化到功能检测准备的发现全过程，支持早期心血管靶点验证和先导化合物筛选工作。
- 发现生物学：支持在心脏发育和疾病模型中进行假设验证和通路解析。
- 筛选：提供即用于检测的心房型心肌细胞群体，具有可量化的收缩和电生理输出。
- 分析：通过实时定量PCR（RT-QPCR）、膜片钳和组织学分析实现定量测量，用于不同条件间的比较。
- 转化研究：通过心房样表型确认和药理学反应评估，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的心房型心肌细胞分化平台，适用于多个项目间的细胞生成。
运营与企业影响
- 科学价值：提高心房靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：实现标准化、可重复且可扩展的心肌细胞生产，且对操作人员培训要求最低。
- 战略价值：通过增强生物学相关性并降低后期淘汰风险，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过提升临床前模型的保真度，实现对靶向心房化合物的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备干细胞培养、类胚体形成及心肌细胞分化的专业技术。
- 依赖于明胶包被表面、悬滴法以及在精确的发育阶段添加Grem2。
- 需要在不同实验团队和实验之间对类胚体大小、接种密度和换液时间表进行标准化。
- 在转化为人类多能干细胞模型或使用其他心房标志物时，需考虑相应的适应性调整。
- 受限于Grem2施加时间必须精确对应原肠胚形成标志物的表达时机。
