使用层压技术来执行人类巩膜共聚焦显微镜
May 6th, 2016
人巩膜组织主要是胶原蛋白;因此，它不易用于免疫组织化学。为了实现对巩膜组织共聚焦显微镜进行免疫组织化学的目标，使用了层压技术。
该方法的总体目标是对人体巩膜进行共聚焦显微镜检查。这种方法可以帮助回答眼科领域的关键问题。如免疫细胞分布和血管状态在健康，以及巩膜中的病理状况。
该技术的主要优点是它允许对致密结缔组织进行共聚焦成像。演示该程序的是我们实验室的研究生 Stefan Kremers。首先，在单独的试管中制备 96% 的乙醇和 PBS。
然后，按照含有 2% BSA 的 PBS 的推荐稀释度，每个样品制备 100 微升一抗，并将所有溶液保存在冰上。布置干净的器械，包括一到两把 Colibri 镊子、直显微解剖剪刀、弯曲剪刀、一把 10 号手术刀或眼科手术刀微羽毛、四根 26 号针头和一根棉签。将铝箔包裹在聚苯乙烯板上，或准备软木板来固定组织。
根据文本协议产生前开的球茎后，将巩膜放在棉签上，开口部分朝上。然后使用 colibri 镊子从内壁膜去除视网膜和色素沉着的葡萄膜层，直到巩膜没有这些层。接下来，如有必要，使用弯曲的剪刀从上去除视网膜和葡萄膜。
然后从浅巩膜中取出剩余的结膜、卵外肌肉和榫囊。现在使用 colibri 镊子轻轻地夹住组织，用直剪刀从组织的不同位置切割大约两平方厘米大小的巩膜样本，避免用镊子重复抓取，这将使该区域不适合共聚焦显微镜检查。将样品放入 1.5 毫升试管中，加入 1.5 毫升 96% 乙醇，孵育 15 分钟以固定组织。
然后，在去除乙醇后，使用 1.5 毫升 PBS 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟，同时摇动。接下来，将样品转移到 1.5 毫升含 5% BSA 的 PBS 中，并在室温下孵育 2 小时，这将诱导样品膨胀，以帮助层压并防止非特异性结合。当样品肿胀时，在立体双目显微镜下，使用边缘弯曲的 26 号针头将后巩膜样品固定在铝箔包裹的聚苯乙烯膜或软木板上。
然后，为了层压全层样品，使用 colibri 镊子水平固定巩膜组织的前缘。用 10 号手术刀，从底层小心地切下一层尽可能薄的浅表巩膜。为防止组织变干，将 50 微升 PBS 移液到各层上。
然后，在切割层后，将它们放入 96 孔板中的 100 微升 PBS 中，并使用防水记号笔标记方向和层。继续分离层并转移到 96 孔板，直到组织完全层压。要进行免疫组织化学，请将移液管靠在每个孔的壁上并吸出液体，从 96 孔板中取出培养基。
然后将 100 微升一抗（在 PBS 中稀释 1 至 100 份，含 2% BSA）中加入适当的孔中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，使用 200 至 300 微升 PBS 在摇床上洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。如果需要，使用另一种一抗，并在 4 摄氏度下再次孵育过夜。
然后加入 100 微升相应的二抗，用 2% 山羊血清在 PBS 中稀释 1 至 300 个，并在室温下避光孵育 1 至 2 小时。孵育后，使用 200 至 300 微升 PBS 在摇床上再次冲洗样品 3 次，每次 5 分钟。然后向每个孔中加入 100 微升 1 比 2000 稀释的 DAPI，并在室温下避光孵育。
在使用 200 至 300 微升 PBS 洗涤样品两次之前。将样品转移到立体双目显微镜下的显微镜载玻片上，以确保样品平躺在载玻片上，并添加一到两滴荧光封固剂。然后在上面放一个盖玻片，用透明指甲油密封边缘。
在 4 摄氏度的避光环境中储存以备后用或直接通过共聚焦显微镜检查。为了验证样本的厚度，采用 z 堆栈，因为厚度在赤道和后部不同，具体取决于巩膜位置。这些图像显示了源自前上巩膜和后上睑下胶的层状人巩膜中血管丛的多样化网络。
血管 CD31 呈阳性，如绿色所示。该图说明了巩膜表层的 LYVE1 阳性免疫细胞及其与 CD31 阳性血管的关系。以 10 倍放大倍率拍摄 z 堆栈系列，以检查血管和免疫细胞的三维关系。
如图所示，也可以分别使用标志物 CD31 和 LYVE1 分析包裹在巩膜内的眼外肌是否存在血管或免疫细胞。一旦掌握了层压技术，如果执行得当，可以在不到一小时的时间内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住防止组织变干。
不要忘记，与人体组织打交道可能具有潜在的传染性，因此应始终事先采取微生物学和病毒学诊断等预防措施。
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概述
本文介绍了一种在人类巩膜组织上进行共聚焦显微镜的方法，该组织主要由胶原蛋白组成，对免疫组织化学提出了挑战。该技术旨在研究健康和病理状态下巩膜中的免疫细胞分布和血管状态。
关键研究组成部分
科学领域
- 眼科学
- 组织学
- 显微镜学
背景
- 人类巩膜是一种主要由胶原蛋白组成的致密结缔组织。
- 由于巩膜的组成，免疫组织化学具有挑战性。
- 共聚焦显微镜可以提供巩膜的详细成像。
- 了解巩膜中的免疫反应对眼科研究至关重要。
研究目的
- 开发人类巩膜组织共聚焦显微镜的方法。
- 评估健康和病理巩膜中的免疫细胞分布。
- 使用先进的成像技术评估巩膜的血管状态。
使用的方法
- 在单独的试管中准备96%乙醇和PBS。
- 组织制备的层压技术。
- 用于成像致密结缔组织的共聚焦显微镜。
- 由研究生展示该程序。
主要结果
- 成功在巩膜组织上应用共聚焦显微镜。
- 不同巩膜条件下的免疫细胞分布的见解。
- 评估健康和病理巩膜的血管状态。
- 展示了层压技术的有效性。
结论
- 开发的方法增强了研究巩膜组织的能力。
- 共聚焦显微镜提供了关于眼部健康的宝贵见解。
- 该技术可以促进眼科领域的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Studying immune cell distribution and vascular status in dense connective tissues like the human sclera presents challenges for target validation in ophthalmic drug development. This laminating technique enables confocal microscopy of otherwise opaque tissues, supporting mechanistic de-risking by providing quantitative spatial data on biomarker expression. The method enhances predictive confidence in preclinical models by allowing analysis of larger tissue samples to reduce sampling bias in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding immune cell localization relative to vascular structures in dense tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying spatial relationships between CD31-positive vessels and LYVE1-positive cells.
- Predictive Value: Improves portfolio triage through quantitative 3D imaging of target engagement in pathological versus healthy sclera.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates standardized, thin tissue layers suitable for reproducible immunohistochemical staining and confocal imaging.
- Quantitative Outputs: Enables z-stack acquisition for thickness-adjusted measurements of biomarker-positive structures across scleral regions.
- Scalability: Facilitates preparation of multiple samples from different anatomical locations for comparative screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by preserving native tissue architecture for analysis of immune-vascular interactions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on vascular and immune biomarkers to inform go/no-go criteria in preclinical advancement.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by directly visualizing co-localization of therapeutic targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling detailed phenotypic screening of immune and vascular targets in dense connective tissues prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial mapping of biomarker expression in human sclera.
- Screening: Delivers assay-ready laminates with standardized thickness for reliable compound evaluation in ophthalmic target validation.
- Analytics: Generates quantitative confocal readouts (e.g., z-stacks, co-localization metrics) for comparing conditions across samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by preserving human tissue relevance in immune-vascular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for confocal analysis of other dense connective tissues beyond the sclera.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in dense tissue analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of tissue preparation for confocal microscopy across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on human tissue target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of biomarker distribution in pathological models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, confocal microscopy, and immunohistochemical staining techniques.
- Dependent on instrumentation including stereo-binocular microscopes, scalpels, and confocal imaging systems.
- Necessitates standardization of laminating thickness and antibody incubation protocols across users.
- Involves adaptation considerations for varying tissue density and anatomical location within the sclera.
- Includes practical limitations such as preventing tissue drying during lamination and managing autofluorescence in dense collagen.
