Name: 使用层压技术来执行人类巩膜共聚焦显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学习使用层压技术对人类巩膜进行共聚焦显微镜检查的方法，以研究免疫细胞分布和血管状态。该技术可深入分析致密结缔组织，为眼科疾病研究提供重要支持。

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德国研究基金会（FOR2240“眼内炎症性疾病的（淋巴）血管生成与细胞免疫”项目资助 CC 和 LMH；LMH 获 HE 6743/2-1 和 HE 7643/3-1 项目资助；CC 获 CU47/6-1 项目资助），德国抗癌协会（资助 LMH 和 CC），科隆大学 GEROK 项目（资助 SLS 和 LMH），以及欧盟 COST BM1302“角膜再生联合行动”项目（资助 CC）。

使用人体组织必须经过机构审查委员会或同等机构的审查和批准。本研究所描述的工作已获得当地伦理委员会的批准，并获准进行科学研究。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。人眼巩膜标本来自德国科隆大学眼科医院眼库的眼球捐献者（死后获取时间最长为24小时）。
1. 实验准备
<ol>
	<li>在不同的离心管中分别准备96%乙醇和磷酸盐缓冲液（PBS）。将一抗用含有2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS按推荐稀释比例配制，并将所有溶液置于冰上。每份样品准备100 μl。</li>
	<li>清洁所有器械，并使用锋利的手术刀片。同一把刀片反复切割后，应及时更换新刀片。</li>
	<li>准备1-2把科尔比镊子、直头显微解剖剪、#10手术刀片或眼科用显微刀片（micro feather），以及四根26 G针头。</li>
	<li>用铝箔包裹聚苯乙烯板或使用软木板以固定组织。在双目体视显微镜下操作。如需无菌操作，应在超净工作台的层流条件下进行。</li>
</ol>
2. 准备巩膜
<ol>
	<li>轻轻握住眼球，对角巩膜部分进行穿孔性环钻，然后旋转环钻。小心且均匀地在表面旋转环钻，以获得一个均匀的圆形切口。使用直径为15.5 mm的环钻。用弯剪剪断剩余的连接组织，移除角巩膜环钻部分。这将使眼球前部打开。
	<ol>
		<li>将巩膜组织置于棉签上，开口朝上。使用蜂鸟镊子将视网膜和葡萄膜从巩膜上剥离（同时移除视网膜和葡萄膜两层），避免在巩膜内表面残留色素性葡萄膜。使用弯剪将视网膜和葡萄膜从视盘处清除。从巩膜表面去除残留的结膜、眼外肌和滕囊。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用直剪刀和蜂鸟镊子按所需大小取下巩膜样本。从不同部位取约2 cm2大小的巩膜样本。由于样本较小，应轻柔夹持巩膜，并用直剪刀将其剪成方形。角巩膜环钻切口定义了巩膜样本的前缘。
	<ol>
		<li>避免反复用镊子夹取组织，因为被镊子夹过的区域不适合进行共聚焦显微镜分析。根据实验类型（例如前部与后部比较，参见图1）以及所用抗体的量，准备所需数量的样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本放入1.5 ml离心管中备用。在1.5 ml 96%乙醇中固定样本15分钟，然后在1.5 ml PBS中于摇床上洗涤三次，每次5分钟。若使用冷冻组织，应在速冻前完成此步骤。</li>
	<li>建议使用新鲜组织。若无法实现，则将巩膜在液氮中速冻，并保存于-20 °C备用。若使用冷冻组织，使用前需解冻。避免反复冻融循环。</li>
	<li>将每个样本置于含1.5 ml 5% BSA的PBS中，室温孵育2小时。此步骤可诱导样本膨胀，有助于后续分层操作，同时防止非特异性结合。</li>
	<li>待样本充分膨胀后，准备进行巩膜片的分层操作。在显微镜下操作，例如双目体视显微镜下。使用26 G针头将后部巩膜样本固定在铝箔包裹的聚苯乙烯膜或软木板上。</li>
	<li>弯曲针头边缘，使其不干扰显微镜下的视野。</li>
	<li>对全层巩膜样本进行分层。
	<ol>
		<li>首先用蜂鸟镊子夹住巩膜前缘，然后使用#10手术刀、眼科微羽手术刀或刮匙刀片小心地切取浅层巩膜的一薄层。保持刀片水平，尽可能薄地从深层组织上切下浅层组织。</li>
		<li>从巩膜方片上解剖出一层薄的巩膜组织。该方法类似于小梁切除术中制作瓣膜的标准外科技术，所得组织层厚度应为30–80 µm（参见图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向组织中添加少量PBS（例如使用移液器加入50 µl PBS）防止巩膜干燥。</li>
	<li>将切下的各层组织放入96孔板中含100 µl PBS的孔内，并标记其方向（外侧与内侧）及层次（浅层与深层），例如使用防水彩色标记。</li>
	<li>重复步骤2.7–2.9，直至组织完全分层完毕。</li>
</ol>
3. 进行免疫组织化学染色
<ol>
	<li>加入100 µl所需的一抗至推荐的稀释比例中。此处， 例如 使用CD31（单克隆小鼠抗人）和LYVE1抗体（兔抗人），两者均以1:100的比例溶于含2% BSA的PBS中，4 °C孵育过夜。更换96孔板中的培养基时，将移液器管尖紧贴孔壁吸取液体。</li>
	<li>次日，在摇床上用 200–300 µl PBS 每次洗涤样品，共洗涤三次，每次 5 分钟。加入 100 µl 对应的二抗；此处使用山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）和山羊抗兔氰染料 3（Cy3），将样品在室温下孵育 1–2 小时。用含 2% 山羊血清的 PBS 将二抗按 1:300 稀释。</li>
	<li>将样品在摇床中用 200–300 µl PBS 各冲洗三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>进行细胞核染色， 例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:2,000 稀释，每孔加入 100 µl，室温孵育 10 分钟），然后在摇床上用 200–300 µl PBS 洗涤 2 次。</li>
	<li>将样品转移至载玻片上，加入1-2滴荧光封片剂，盖上盖玻片，用透明指甲油封固边缘，于4 °C保存以备后续使用，或直接用共聚焦显微镜观察。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜（或同等设备）分析样品。选择所需的放大倍数， 例如 10-40倍放大倍数。</li>
	<li>为验证样品的厚度，使用共聚焦显微镜结合Z轴层扫进行测量。可能获得的巩膜切片数量取决于巩膜取材位置，因为赤道部与后部的巩膜厚度存在差异（参见引言部分）。</li>
</ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
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</ol>

作者声明无财务披露。本文内容完全由作者负责。

对人巩膜进行封片是对此组织进行共聚焦显微镜观察的一种方法。该过程中的一个关键步骤是使用乙醇而非福尔马林来固定组织。根据我们的经验，使用乙醇固定相比福尔马林可获得更好的结果。钝的手术刀会加重操作困难，应避免使用。同样，应避免巩膜干燥，因为干燥会使操作复杂化并降低图像质量。
关于免疫组织化学染色，除本实验所使用的抗体外，也可使用其他抗体。通常情况下，胶原蛋白在绿色通道中表现出更强的自发荧光和背景信号，因此使用红色、蓝色和远红通道可获得背景更低、效果更好的结果。
然而，该技术也存在一些局限性。由于巩膜分层是在显微镜下进行的显微外科操作，因此需要大量的练习才能掌握。由于该技术为手工操作，同一组织样本中各单层切片的尺寸并不完全一致，厚度也存在差异。若需获得尺寸完全相同的组织样本，可考虑采用环钻法作为替代方案，但其层厚仍可能存在变化。为了获得精确设定厚度的巩膜切片，未来实验中可考虑使用自动显微角膜刀作为替代方法。若分层时切取的组织过厚，则盖玻片可能发生移位，组织也存在干燥的风险。一旦完成分层操作，巩膜表层与基质层之间的确切边界可能较难区分...

巩膜是覆盖眼球的坚硬外层，由致密结缔组织构成。它有助于保护眼内结构并维持眼内压，因此对清晰视力至关重要。巩膜内无淋巴管 1,2 从而在其与无淋巴管的内眼之间形成一个无淋巴管的外层边界 3-7它还为眼外肌提供附着位点，因此在解剖结构上与肌腱具有相似性。 因为巩膜主要由密集的I型胶原纤维束构成，且含有较少数量的其他胶原类型 三、四、五、六、八 8,9 和弹性蛋白 10,11该组织不易用于免疫组织化学。
从解剖学上讲，巩膜可分为三层主要结构：（1）表层富含血管的巩膜上层（episclera），位于结膜和滕囊下方，分布于眼球侧面及朝向眼眶后部的区域；（2）巩膜基质，即巩膜的主要部分；（3）棕黑层（lamina fusca），为一层位于葡萄膜正上方的薄而有色素的结构。我们对巩膜的解剖学认识主要来源于20th世纪上半叶。当时，研究人员主要通过印度墨水注射12和血管铸型技术13-15来研究血管系统的解剖结构。此后，相关研究进一步通过血管造影研究得以开展16-19。
从那时起，旧的技术得到了改进，新的技术也相继出现，使我们能够补充以往的解剖学知识。例如，可靠的淋巴管标记物，如淋巴管内皮特异性透明质酸受体-1（LYVE1）20 或足突蛋白（podoplanin）21，仅在过去大约十年间才得以应用。共聚焦显微镜为研究眼部不同组织的解剖特征提供了新的可能性。它允许多重染色，以区分细胞标记物，或确定细胞相对于血管及其他解剖结构的位置。当样本尺寸较大时，该技术可提供整体视野，并便于在寻找特定细胞类型时对样本进行逐层扫描。借助Z轴层扫技术，共聚焦显微镜可用于厚度达100–200 µm的样本。巩膜的厚度在肌肉附着处后方约为0.3 mm，而在后极部可达1 mm11。由于其厚度和不透明性，巩膜不适合采用传统方法进行共聚焦显微镜观察。
为解决这一问题，将巩膜组织进行切片处理，以便利用共聚焦显微镜进行分析。该技术有助于更深入地理解人巩膜的生理及病理状态。

<table><tbody><tr><td>96% 乙醇</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>双目体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G 针头&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm 打孔器</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>10 号手术刀&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>眼科显微手术刀片（Micro Feather）&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD31 抗体（单克隆小鼠抗人）</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 抗体&amp;nbsp;（多克隆兔抗人）</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 FITC 抗体</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Cy3 抗体</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>24 mm × 24 mm 盖玻片</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 荧光封片剂&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

使用覆膜技术对人巩膜进行共聚焦显微镜观察

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

巩膜是一种致密的结缔组织，覆盖并保护眼球，主要由致密的胶原纤维束（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ型）构成。由于其自发荧光性、不透明性及较厚的结构，巩膜被认为不适合用于共聚焦显微镜观察。一种替代方法是采用福尔马林固定、石蜡包埋的巩膜组织进行免疫组织化学染色，但该方法存在技术上的挑战，尤其是在抗原修复过程中需要对组织进行加热时。由于巩膜中细胞和血管均相对稀少，因此尝试使用较大的组织样本，以帮助避免遗漏细胞，并有助于理解细胞相对于血管及其他解剖位置的分布情况。为了能够在共聚焦显微镜下分析较大的组织样本，采用了一种切片贴合技术，以从巩膜制备出较薄的组织层。在分析了已获得科学研究许可的CD31标记的血管以及淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）阳性细胞的结果后，本文讨论了该方法的优势与局限性。

在本研究进行的代表性实验中，采用这种特定的层压技术可带来显著优势。第一个实验通过三幅代表性图像展示了巩膜上血管丛的复杂网络结构（图3）。这些血管对CD31呈阳性。
第二个实验展示了免疫细胞，特别是巩膜上层的LYVE1+细胞及其与CD31阳性血管的关系。此处采用Z-堆栈技术，在10倍放大倍数下对组织进行扫描，以了解血管与免疫细胞之间的三维空间关系（图4）。
可以分析巩膜以及包埋的眶外肌是否存在血管或免疫细胞。图5显示了LYVE1阳性细胞和CD31阳性血管。
<img alt="眼睛解剖图；标注角膜、晶状体、视网膜；...

人巩膜组织主要成分为胶原，因此不易用于免疫组织化学检测。为了实现对巩膜组织进行共聚焦显微镜免疫组织化学分析的目标，采用了切片贴附技术。

巩膜是一种致密的结缔组织，覆盖并保护眼球。其主要由致密的胶原纤维束（I型、III型、IV型、V型、VI型及其他类型）构成。

本方法学的总体目标是对人巩膜进行共聚焦显微镜观察。该方法有助于解答眼科领域中的关键问题，例如在健康状态以及病理状态下巩膜中的免疫细胞分布和血管状况。该技术的主要优势在于能够对致密结缔组织进行共聚焦成像。演示该实验步骤的是本实验室的研究生 Stefan Kremers。首先，将 96% 的乙醇和 PBS 分别准备在单独的离心管中。然后，按推荐的稀释比例，用含2% BSA的PBS配制每份样品100微升的一抗溶液，并将所有溶液置于冰上保存。准备好洁净的器械，包括一到两把Colibri镊子、直头显微解剖剪、弯头剪、10号手术刀或眼科用显微羽毛手术刀、四根26号针头以及一个棉签。用铝箔包裹聚苯乙烯板，或准备一个软木板用于固定组织。根据文本方案制备出前部开口的巩膜杯后，将巩膜置于棉签上，使开口朝上。然后使用雀科镊子从巩膜内表面去除视网膜及色素性葡萄膜层，直至巩膜完全清除这些组织。必要时，使用弯头剪刀从视乳头处进一步清除残留的视网膜和葡萄膜。然后从表层巩膜上去除残留的结膜、眼外肌及滕氏囊。现在使用细镊子轻轻夹住组织，用直剪刀从组织的不同部位剪取约2平方厘米大小的巩膜样本，注意避免用镊子反复抓取同一区域，以免影响共聚焦显微镜观察。将样本置于1.5 mL离心管中，加入1.5 mL 96%乙醇，固定15分钟。随后除去乙醇，使用1.5毫升PBS在振荡条件下清洗样品三次，每次五分钟。接着，将样品转移至含5% BSA的1.5毫升PBS中，室温孵育两小时，以诱导样品膨胀，有助于后续贴片操作并防止非特异性结合。待样品充分膨胀后，在体视显微镜下使用边缘弯曲的26号针头将后部巩膜样品固定于包裹铝箔的聚苯乙烯膜或软木板上。然后，为了制备全层厚度的样本，使用Colibri镊子水平夹住巩膜组织的前缘。用10号手术刀小心地从深层组织上方切下尽可能薄的一层表层巩膜。为防止组织干燥，用移液器向各层滴加50 µL的PBS。随后，将切好的层片放入96孔板中含100 µL PBS的孔内，并使用防水标记笔标注每片的方向和层次。持续分离层片并转移至96孔板，直至组织完全分层。进行免疫组织化学染色时，将移液枪头紧贴各孔壁，吸出培养基液体。然后向相应的孔中加入100 µL用含2% BSA的PBS按1:100稀释的一抗溶液，在4°C下孵育过夜。次日，在摇床上用200至300 µL PBS洗涤样品，每次5分钟，共洗三次。如需使用另一种一抗，则再次在4°C下孵育过夜。然后每孔加入100 µL相应二抗，用含2% goat serum的PBS按1:300稀释，于室温避光孵育1至2小时。孵育结束后，在摇床上用200至300 µL PBS再次清洗样品，每次5分钟，共洗三次。随后每孔加入100 µL DAPI稀释液（1:2000稀释），于室温避光孵育。使用 PBS 清洗样品两次，每次 200 至 300 微升。在体视显微镜下将样品转移至载玻片上，确保样品平铺于载玻片表面，然后加入一至两滴荧光封片剂。接着盖上盖玻片，并用透明指甲油密封边缘。4°C 避光保存以备后续使用，或直接通过共聚焦显微镜观察。为验证样品厚度，需采集Z轴层扫图像，因为厚度随巩膜部位的不同而在赤道部与后极部存在差异。这些图像显示了来源于人眼前部与后部巩膜上组织的分层巩膜中血管丛的多样化网络结构。血管呈CD31阳性，如绿色所示。本图展示了巩膜上层中LYVE1阳性的免疫细胞及其与CD31阳性血管的关系。通过10倍放大下的z轴层扫系列图像，观察血管与免疫细胞之间的三维空间关系。如图所示，位于巩膜内的眶外肌也可分别使用 CD31 和 LYVE1 标记物分析其血管或免疫细胞的存在情况。熟练掌握切片技术后，若操作得当，整个过程可在一小时内完成。进行该操作时，需注意防止组织干燥。请务必注意，处理人体组织可能存在潜在感染风险，因此必须事先采取微生物学和病毒学诊断等预防措施。

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