使用覆膜技术对人巩膜进行共聚焦显微镜观察

本方法学的总体目标是对人巩膜进行共聚焦显微镜成像。该方法有助于解答眼科领域中的关键问题，例如巩膜在健康状态及病理状态下免疫细胞的分布情况和血管状态。

该技术的主要优势在于能够对致密结缔组织进行共聚焦成像。演示该实验步骤的是本实验室的研究生 Stefan Kremers。首先，将 96% 的乙醇和 PBS 分别准备在单独的离心管中。

然后，按推荐的稀释比例，用含2% BSA的PBS配制每份样品100微升的一抗溶液，并将所有溶液置于冰上保存。准备好洁净的器械，包括一到两把Colibri镊子、直头显微解剖剪、弯头剪、10号手术刀或眼科用显微羽毛手术刀、四根26号针头以及一个棉签。用铝箔包裹聚苯乙烯板，或准备一个软木板用于固定组织。

根据文本方案制备出前部开口的巩膜囊后，将巩膜置于棉签上，开口朝上。然后使用精细镊子从巩膜内面去除视网膜及色素性葡萄膜层，直至巩膜表面完全清除这些组织。必要时，可使用弯头剪刀进一步清除视盘部位的视网膜和葡萄膜组织。

然后从表层巩膜上去除残留的结膜、眼外肌及滕囊。现在使用精细镊子轻轻夹住组织，用直剪刀从组织的不同部位剪取约2平方厘米大小的巩膜样本，注意避免用镊子反复夹取同一区域，以免影响共聚焦显微镜观察。将样本放入1.5毫升离心管中，加入1.5毫升96%乙醇，固定15分钟。

然后，在去除乙醇后，用1.5毫升PBS振荡洗涤样品三次，每次五分钟。接着，将样品转移至含5% BSA的1.5毫升PBS中，在室温下孵育两小时，以诱导样品膨胀，有助于后续贴片操作并防止非特异性结合。待样品充分膨胀后，在体视显微镜下使用边缘弯曲的26号针头将后部巩膜样品固定于包裹铝箔的聚苯乙烯膜或软木板上。

然后，使用Colibri镊子水平夹住巩膜组织的前缘，以制备全层样本。用10号手术刀片小心地从深层组织上剥离尽可能薄的一层表层巩膜。为防止组织干燥，用移液器向组织层上滴加50 µL的PBS。

将切好的组织层置于96孔板中，每孔加入100 µL PBS，并使用防水标记笔标注组织的方向和层次。持续分离组织层并转移至96孔板，直至完成整个组织的分层。进行免疫组织化学染色时，将移液器紧贴每个孔的孔壁，吸出液体以去除孔板中的液体介质。

然后向适当的孔中加入100微升用含2% BSA的PBS按1:100稀释的一抗溶液，在4°C下孵育过夜。次日，在摇床上用200至300微升PBS每次洗涤样品5分钟，重复三次。如需使用另一种一抗，则再次在4°C下孵育过夜。

然后每孔加入100微升相应的二抗，用含2%羊血清的PBS按1:300稀释，于室温避光孵育1至2小时。孵育结束后，在摇床上用200至300微升PBS将样品再漂洗三次，每次5分钟。随后每孔加入100微升DAPI稀释液（1:2000稀释），于室温避光孵育。

使用 200 至 300 微升 PBS 将样品清洗两次后，在体视显微镜下将样品转移至载玻片上，确保样品平铺于载玻片表面，然后加入一至两滴荧光封片剂。接着盖上盖玻片，并使用透明指甲油密封边缘。

置于4°C避光保存以备后续使用，或直接进行共聚焦显微镜观察。为验证样品厚度，需采集Z轴层扫图像，因为样品厚度随巩膜位置不同而在赤道部与后极部存在差异。这些图像显示了来源于前部和后部表层巩膜的分层人巩膜中血管丛的多样化网络结构。

血管呈CD31阳性，如绿色所示。本图展示了巩膜上层中LYVE1阳性的免疫细胞及其与CD31阳性血管的关系。采用10倍放大倍数获取z轴层扫图像序列，以观察血管与免疫细胞之间的三维空间关系。

如图所示，位于巩膜内的眶外肌也可通过分别使用 CD31 和 LYVE1 标记物来分析其血管或免疫细胞的存在情况。一旦掌握，若操作得当，层压技术可在一小时之内完成。在进行该操作时，重要的是要注意防止组织干燥。

请注意，处理人体组织可能存在潜在感染风险，因此必须事先采取微生物学和病毒学诊断等预防措施。