Name: 使用串联亲和纯化的MyoD相互作用组鉴定质谱分析法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: 了解串联亲和纯化结合质谱技术鉴定MyoD蛋白相互作用组的方法。该技术利用HeLa S3细胞分离低丰度亚核区室中的MyoD复合物，为肌肉生物学和细胞分化研究提供新见解。

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Ait-Si-Ali 实验室的工作得到了法国肌病协会 Téléthon（AFM-Téléthon）；法国国家癌症研究院（INCa）；法国国家科研署（ANR）；癌症研究协会基金会（Fondation ARC）；法国企业抗癌联合会（GEFLUC）；法国国家科学研究中心（CNRS）；巴黎狄德罗大学；以及由法国政府通过“未来投资”计划资助、ANR 管理的“我是谁？”卓越实验室 #ANR-11-LABX-0071（项目编号 #ANR-11-IDEX-0005-01）的支持。EB 获得了 INCa 基金项目的资助。

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所介绍的方法能够全面鉴定转录因子 MyoD 的相互作用蛋白。该方法在一种对 MyoD 诱导分化具有抗性的异源系统（即 HeLa-S3 细胞）中揭示了 MyoD 的相互作用蛋白。因此，根据定义，所鉴定出的 MyoD 相互作用蛋白为普遍表达的蛋白，包括通用转录因子和序列特异性转录因子、染色质修饰酶、RNA 加工蛋白、激酶（表1 和 2）。由于HeLa-S3细胞对MyoD诱导的转分化具有抗性，MyoD的活性主要表现为抑制作用，因此所鉴定出的互作蛋白很可能是MyoD的共抑制因子。这一点由Id蛋白的存在得以凸显（表1 和 2，图 2），已知可抑制 MyoD 的转录激活能力8重要的是，这种抑制状态对应于增殖期成肌细胞中 MyoD 的状态。事实上，我们证实了通过所述方法鉴定出的 MyoD 互作蛋白 CBFβ 与 MyoD 的相互作用可在增殖期 C2C12 成肌细胞中被检测到，但在细胞发生分化后该相互作用则消失（见 图 3D）。然而，需要注意的是，本研究所提出方法...

真核多细胞生物由不同的器官和组织构成。每种功能性组织都具有特定的基因表达模式，这种模式在每个分化阶段被确定。细胞分化涉及特定基因的激活、其表达的维持，以及通常对一组基因的沉默，例如参与细胞增殖的基因。因此，骨骼肌分化，即成肌作用，是一个多步骤过程，始于中胚层干细胞向成肌细胞的决定，随后这些成肌细胞逐步终末分化为单核、进而多核的肌管细胞。因此，成肌细胞是&#34;已决定&#34;的细胞，仍具有增殖能力，但已特化于骨骼肌谱系，因此只能在胚胎发育过程中或成体肌肉再生时分化为骨骼肌细胞。骨骼肌终末分化过程由特定的遗传程序调控，该程序始于成肌前体细胞永久性退出细胞周期，导致与增殖相关基因（如E2F靶基因）的永久沉默1。事实上，在终末分化过程中，成肌细胞的增殖停滞是关键步骤，先于骨骼肌特异性基因的表达以及成肌细胞融合形成肌管细胞2。这一程序使得成体肌肉干细胞（也称为卫星细胞）能够在骨骼肌损伤后的再生过程中进行分化。
哺乳动物的成肌作用关键依赖于一组成肌性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，即 MyoD、Myf5、MRF4 和肌生成素（Myogenin），这些因子常被称为骨骼肌决定因子家族或 MRFs（肌肉调控因子）3。它们各自在骨骼肌细胞的命运决定和分化过程中发挥着重要作用，并具有特定的表达模式45-7。Myf5 和 MyoD 的激活是细胞进入成肌谱系的决定性步骤，随后肌生成素的表达启动成肌过程，并激活骨骼肌特异性基因（如 MCK，即肌肉肌酸激酶）的表达。成肌性 bHLH 转录因子与 MEF2 家族成员协同作用，激活原本处于沉默状态的肌肉基因位点8。它们还可与普遍存在的 bHLH 蛋白 E12 和 E47（称为 E 蛋白）形成异源二聚体，结合到多种基因调控区域中的所谓 E-box 序列，从而促进骨骼肌基因的转录8。Twist、Id（分化抑制因子）及其他因子则通过与 MyoD 竞争结合 E 蛋白的方式，负向调控这一过程8。
MyoD 被认为是触发肌肉终末分化的关键因子9，因为它能够在许多完全分化的非肌细胞系统中诱导成肌决定/分化（转分化）程序10-13。事实上，强制表达 MyoD 可诱导多种细胞类型的转分化，甚至包括来自不同胚胎起源的细胞12。例如，MyoD 可将肝细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、神经母细胞和脂肪细胞转化为类肌细胞。MyoD 的转分化作用涉及在非肌细胞环境中异常激活成肌遗传程序（尤其是其靶基因），同时伴随原有遗传程序（特别是增殖相关基因）的沉默。
在增殖的成肌细胞中，MyoD 虽然表达，但即使结合到靶基因的启动子上，也无法激活这些基因的表达14-16。因此，MyoD 在未分化成肌细胞中持续表达的必要性仍不明确。在增殖的成肌细胞中，MyoD 可能通过招募抑制性染色质修饰酶，从而在激活性染色质重塑酶加载之前抑制其靶基因的表达14,17。例如，在增殖的成肌细胞中，MyoD 与转录共抑制因子 KAP-1、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）以及抑制性赖氨酸甲基转移酶（KMTs）相关联，包括组蛋白 H3 赖氨酸 9（H3K9）和 H3K27 甲基转移酶，并通过建立局部抑制性染色质结构主动抑制其靶基因的表达14,17。重要的是，最近一项研究表明，MyoD 本身可被 H3K9 甲基转移酶 G9a 直接甲基化，从而抑制其转录激活活性16。
MyoD介导非肌细胞转分化过程中的表观遗传机制在很大程度上尚不清楚。值得注意的是，某些细胞系对MyoD诱导的转分化具有抗性。例如，在HeLa细胞中，由于染色质重塑复合物SWI/SNF的BAF60C亚基表达缺失，MyoD可能处于失活状态，甚至可能发挥转录抑制因子而非激活因子的功能18。因此，该模型可用于深入表征MyoD诱导基因抑制的分子机制。此外，该模型也适用于检测MyoD与其协同因子共同在其靶向位点建立抑制性染色质环境的能力，从而揭示在增殖性成肌细胞中依赖MyoD的抑制机制，以精确调控终末分化过程。
本文描述了利用串联亲和纯化（TAP-Tag）结合质谱分析（MS）鉴定MyoD相互作用蛋白的实验方案。通过使用稳定表达Flag-HA-MyoD的HeLa-S3细胞，可获得足量材料，从分级的核提取物中纯化MyoD复合物。在异源系统中鉴定出MyoD相互作用蛋白后，进一步在相关生物学系统中进行验证。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转培养瓶</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器：&amp;nbsp;Dounce 匀浆器&amp;nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 和 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>旋转培养瓶振荡装置</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Marienfeld Superior&amp;nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>低吸附离心管</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>空离心柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-聚丙烯酰胺 4-12%&amp;nbsp;凝胶</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x 上样缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x 还原剂</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>银染试剂盒</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤装置，10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protein G 琼脂糖珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&amp;nbsp;树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Flag 树脂（抗 Flag M2-琼脂糖亲和凝胶）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA 树脂（单克隆抗 HA 琼脂糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Flag 游离肽（DYKDDDDK）</td><td>Ansynth Service BV</td><td>定制合成</td><td>用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml</td></tr><tr><td>HA 游离肽（YPYDVPDYA）</td><td>Ansynth Service BV</td><td>定制合成</td><td>用 50 mM Tris-HCl（pH 7.8）溶解至浓度不超过 4 mg/ml</td></tr><tr><td>基于双辛可宁酸的蛋白定量检测试剂盒：BCA 试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>基于鲁米诺的增强型化学发光（ECL）HRP 底物</td><td>Life technologies</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>剪切的鲑鱼精子 DNA（鲑鱼精脱氧核糖核酸钠盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>四盐酸精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 电泳缓冲液</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>使用前于 37 &amp;deg;C 预热&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05% 酚红）</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>血清</td><td>GE healthcare life sciences&amp;nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>每批血清在使用前均需针对您的细胞进行测试。</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>水（无菌过滤）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自大鼠的 HA（12CA5）</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>用于免疫共沉淀和 Western 印迹</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

利用串联亲和纯化联合质谱技术鉴定myod相互作用组

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

骨骼肌终末分化的起始始于多能中胚层前体细胞向成肌细胞的定向分化。这些细胞仍具有增殖能力，也可进一步分化并融合形成多核的肌管，最终成熟为肌纤维。骨骼肌的终末分化过程由多种转录因子协同调控，尤其是肌肉调节因子（Muscle Regulatory Factors，MRFs）家族成员（MyoD、Myogenin、Myf5 和 MRF4），也称为成肌性bHLH转录因子家族。这些因子与染色质重塑复合物协同作用，构成复杂的转录调控网络，以实现骨骼肌的发生。其中，MyoD 被认为是启动骨骼肌终末分化的关键成肌转录因子。这一观点得到了 MyoD 能将非肌源性细胞转化为骨骼肌细胞这一能力的支持。本文介绍一种系统性鉴定 MyoD 蛋白相互作用伙伴的方法，旨在全面揭示参与骨骼肌终末分化的各类因子。长期目标是阐明调控骨骼肌基因表达的表观遗传机制。 即., MyoD 靶点。通过串联亲和纯化（TAP-Tag）结合质谱（MS）分析，从异源系统中鉴定 MyoD 相互作用蛋白，随后验证这些相关蛋白在骨骼肌终末分化过程中的作用。成肌因子的异常形式或其调控异常与多种肌肉疾病相关，包括先天性肌无力、强直性肌营养不良、横纹肌肉瘤以及肌肉再生缺陷。因此，成肌因子为肌肉疾病的治疗提供了潜在靶点库，不仅涉及致病机制本身，也涵盖可改善疾病治疗的再生机制。因此，深入理解成肌因子调控的分子间相互作用及其遗传程序，对于合理设计高效治疗策略至关重要。

为了理解 MyoD 活性的调控机制，我们采用生化纯化方法对 MyoD 复合物进行了全面表征，该方法基于对双标签形式的 MyoD 进行免疫纯化，随后进行质谱分析（MS）。利用表达 Flag-HA 标签 MyoD 的 HeLa-S3 细胞系以及表达 Flag-HA 的对照细胞系，可以获得足够的材料，通过针对 Flag-HA-MyoD 的双亲和纯化来分离 MyoD 复合物。
我们将细胞提取物分离为细胞质和细胞核组分，随后进一步将细胞核组分分离为盐提取组分（核盐提取物，SE）和核小体富集组分（核小体富集，NE）。从这些分离的细胞核组分中进行TAP-Tag纯化（图1，表1 和 2) 使得在某一特定核内区域局部浓度相对较低的相互作用伙伴得以被揭示。此外，该策略还被用于发现非结合型（SE）的相互作用伙伴。 与 通过检测与DNA结合的（核提取物中的）MyoD，以深入了解MyoD活性的...

MyoD 是一种成肌转录因子，具有强大的能力可诱导多种完全分化的非肌肉细胞系发生成肌转分化。参与该转分化过程的表观遗传学机制在很大程度上尚不清楚。本文介绍了一种双重亲和纯化方法，随后进行质谱分析，以全面表征 MyoD 的相互作用蛋白伙伴。

利用串联亲和纯化联合质谱技术鉴定MyoD相互作用组

骨骼肌终末分化的起始阶段始于多能中胚层前体细胞向成肌细胞的定向分化。这些细胞仍具有……

本实验的总体目标是全面表征 MyoD 蛋白的相互作用伙伴。该方法可以解答骨骼肌生物学领域中的关键问题，例如关键肌肉转录因子 MyoD 对骨骼肌张力性形变的分子调控机制。该技术的主要优势在于，它能够揭示那些丰度极低、且局限于特定核内亚区室的 MyoD 相互作用蛋白。尽管该方法可用于研究肌肉分化的调控机制，也可应用于其他系统，例如其他任何组织，特别是细胞核分化。本实验操作将由本实验室的研究助理 Dr.Lauriane Fritsch 博士演示。在本方案中，将从稳定表达带有 FLAG 谷蛋白标签的 MyoD 的 HeLa S3 细胞中纯化 MyoD 复合物。使用空载体转导的HeLa S3细胞作为对照。两种细胞系此前均已按照方案文本所述方法进行培养、收集，并于负80摄氏度保存。将细胞沉淀块迅速置于37摄氏度水浴中解冻。所有缓冲液和匀浆器均应预先冷却，并且整个操作过程应在冷室中进行。通常每个实验点使用 20 克细胞，但为了演示目的，此处仅处理 10 克或约 10 mL 的细胞。先用 5 mL 低渗缓冲液 A 将细胞重悬于 10 mL 低渗缓冲液 A 中。然后加入 2.5 mL，再加入另外 2.5 mL。用新鲜缓冲液充分清洗移液管，以获得尽可能多的细胞。将 20 mL 细胞悬液转移至预冷的、配有严密切合研杵的匀浆器中。用20次研磨充分匀浆细胞。将细胞悬液转移至50毫升离心管中。为最大程度回收细胞，用3.5 mL蔗糖缓冲液冲洗匀浆器。迅速将此悬浮液转移至50 mL离心管中，以保护细胞核并减少泄漏。取30微升细胞悬液，加入30微升4%台盼蓝染色液进行染色，并在显微镜下分析，以确定裂解效率。若裂解成功，所有细胞核均应呈蓝色。如有必要，可重复匀浆步骤。在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 7 分钟，以沉淀细胞核。将上清液保留作为胞质组分。通过将细胞核沉淀重悬于4 mL蔗糖缓冲液中，开始制备核盐可提取组分的步骤。然后在涡旋振荡充分混合的同时逐滴加入4 mL高盐缓冲液，使氯化钠的终浓度为300 mM。在冰上孵育30分钟，每5分钟混合一次。接下来，加入 8 mL 蔗糖缓冲液，将氯化钠浓度降低至 150 mM。在 4°C 条件下，以 13,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液，即为盐可提取组分，并将其置于冰上保存。为制备染色质结合组分，将沉淀物仔细重悬于 3.5 mL 蔗糖缓冲液中。加入氯化钙至终浓度为 1 mM，并混匀。氯化钙将激活后续添加的微球菌核酸酶。将悬浮液在 37 摄氏度预热一分钟。加入 35 微升浓度为每微升 5 个单位的微球菌核酸酶储备液，使终浓度达到每微升 0.025 个单位。在 37 摄氏度精确孵育 12 分钟。每4分钟混匀一次。12分钟后，立即将反应体系置于冰上。为终止微球菌核酸酶活性，加入56微升5摩尔/升pH 8.0的EDTA，使终浓度为4毫摩尔/升，涡旋混匀。在冰上孵育五分钟。高振幅超声处理五次，每次一分钟，两次超声之间间隔一分钟。在4°C、85,000 × g条件下离心30分钟，分别收集盐可提取组分和核小体富集组分。收集上清液。盐可提取组分的体积应约为 13 mL，而核小体富集组分的体积应约为 6 mL。将通过双亲和纯化方法纯化 MyoD 蛋白复合物。由于基于 FLAG 和基于 HA 的纯化步骤相似，此处仅展示基于 FLAG 的纯化过程。加入 TEGN 后，将适量体积的 FLAG 树脂转移至一个 50 mL 离心管中。每个实验点需要300微升商用50%预洗FLAG树脂。在1,000 × g下离心两分钟。弃去上清液，加入冷TEGN，再次离心。用预冷的TEGN缓冲液洗涤FLAG树脂，共洗涤五次。最后一次洗涤后，将FLAG树脂重悬于等体积的TEGN缓冲液中。针对每个实验点，取300微升洗涤后的FLAG树脂与相应的蛋白提取物混合。使用15 mL离心管收集染色质片段富集部分，使用50 mL离心管收集盐可提取部分。将离心管置于旋转仪上，于4°C条件下孵育过夜。次日，在4°C条件下，以1,000 × g离心力离心所有离心管2分钟。收集上清液，并在4 °C下保存，直至获得纯化效率检测结果。对于可溶于盐的样品，将FLAG树脂重悬于4 mL TEGN中，转移至15 mL离心管。重复此步骤三次，每次均转移至同一个15 mL离心管，以避免丢失树脂珠。在4°C、1,000 × g条件下离心两分钟。弃去上清液后，向FLAG树脂中加入13 mL TEGN，于4°C、1,000 × g再次离心两分钟。以此方式洗涤树脂七次。最后一次洗涤后，将树脂重悬于 1 mL TEGN 中，并转移至 1.5 mL 低吸附离心管中。离心 2 分钟后弃去上清液。将每份实验样品的树脂重悬于 100 微升 FLAG 肽溶液（4 mg/mL，pH 7.8）中，充分混匀，再加入 100 微升 TEGN 缓冲液。在4°C下孵育至少4小时，以洗脱结合的蛋白质。离心2分钟，将树脂和上清液转移至置于2 mL离心管中的空自旋柱中。在6,000 × g下离心柱子1分钟。收集2 mL离心管中的剩余上清液。在进行基于HA的纯化之前，按方案文本中所述方法检测纯化效率。此处展示的是稳定表达FLAG HA MyoD的HeLa S3细胞系中，来自核盐可提取组分或核小体富集组分的双亲和纯化MyoD复合物的代表性结果。银染检测到由箭头指示的 FLAG HA MyoD，该蛋白在对照细胞系中缺失。经过双重亲和纯化的 MyoD 复合物在甘油梯度中进行分级分离。利用抗 FLAG 抗体对各组分进行蛋白质印迹分析，揭示了 MyoD 亚复合物存在于两个核内亚区室中。特别地，可被盐溶液提取的 MyoD 分布于三个亚复合物中，而染色质结合型的 MyoD 主要存在于一个复合物中。通过对来自细胞核盐提取组分和核小体富集组分的 MyoD 相互作用蛋白进行质谱分析，鉴定出一系列已知及新的 MyoD 相互作用蛋白。此处，根据功能注释对在两个组分中均存在或仅特异性存在于某一组分中的 MyoD 相互作用蛋白进行了分类整理。通过 Western 印迹在 MyoD 复合物上验证了部分质谱分析发现的相互作用蛋白，其中包括转录因子 CBF、SWI/SNF 亚基 BAF47 以及 HP1 蛋白。由于 HeLa 细胞并非肌细胞，通常不表达 MyoD，因此有必要验证新鉴定出的相互作用蛋白与 MyoD 在成肌细胞中的相互作用。使用增殖和分化的小鼠成肌细胞的核总提取物，通过指定的抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹分析。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在两天半内完成。在进行该实验时，重要的是要记得在成肌细胞中对获得的结果进行优化。通过该实验流程，还可采用其他方法，例如在成肌细胞等相关体系中对特定互作蛋白进行敲低，以回答该相互作用的功能意义等进一步的科学问题。该技术建立后，将为发育生物学表观遗传学领域的研究人员探索五种转录因子在多数体系统中的调控网络提供重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过细胞分馏结合串联亲和纯化与质谱分析，来鉴定转录因子相互作用蛋白的方法。

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生物学

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