利用串联亲和纯化联合质谱技术鉴定MyoD相互作用组

本实验的总体目标是全面表征 MyoD 蛋白的相互作用伙伴。该方法可以解答骨骼肌生物学领域中的关键问题，例如关键肌肉转录因子 MyoD 对骨骼肌张力性形变的分子调控机制。该技术的主要优势在于，它能够揭示那些丰度极低、且局限于特定核内亚区室的 MyoD 相互作用蛋白。

尽管该方法可用于研究肌肉分化的调控机制，也可应用于其他系统，例如其他任何组织，特别是细胞核分化。本实验操作将由本实验室的研究助理 Dr.Lauriane Fritsch 博士演示。在本方案中，将从稳定表达带有 FLAG 谷蛋白标签的 MyoD 的 HeLa S3 细胞中纯化 MyoD 复合物。

使用空载体转导的HeLa S3细胞作为对照。两种细胞系此前均已按照方案文本所述方法进行培养、收集，并于负80摄氏度保存。将细胞沉淀块迅速置于37摄氏度水浴中解冻。

所有缓冲液和匀浆器均应预先冷却，并且整个操作过程应在冷室中进行。通常每个实验点使用 20 克细胞，但为了演示目的，此处仅处理 10 克或约 10 mL 的细胞。先用 5 mL 低渗缓冲液 A 将细胞重悬于 10 mL 低渗缓冲液 A 中。

然后加入 2.5 mL，再加入另外 2.5 mL。用新鲜缓冲液充分清洗移液管，以获得尽可能多的细胞。将 20 mL 细胞悬液转移至预冷的、配有严密切合研杵的匀浆器中。

用20次研磨充分匀浆细胞。将细胞悬液转移至50毫升离心管中。为最大程度回收细胞，用3.5 mL蔗糖缓冲液冲洗匀浆器。

迅速将此悬浮液转移至50 mL离心管中，以保护细胞核并减少泄漏。取30微升细胞悬液，加入30微升4%台盼蓝染色液进行染色，并在显微镜下分析，以确定裂解效率。若裂解成功，所有细胞核均应呈蓝色。

如有必要，可重复匀浆步骤。在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 7 分钟，以沉淀细胞核。将上清液保留作为胞质组分。

通过将细胞核沉淀重悬于4 mL蔗糖缓冲液中，开始制备核盐可提取组分的步骤。然后在涡旋振荡充分混合的同时逐滴加入4 mL高盐缓冲液，使氯化钠的终浓度为300 mM。在冰上孵育30分钟，每5分钟混合一次。

接下来，加入 8 mL 蔗糖缓冲液，将氯化钠浓度降低至 150 mM。在 4°C 条件下，以 13,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液，即为盐可提取组分，并将其置于冰上保存。

为制备染色质结合组分，将沉淀物仔细重悬于 3.5 mL 蔗糖缓冲液中。加入氯化钙至终浓度为 1 mM，并混匀。氯化钙将激活后续添加的微球菌核酸酶。

将悬浮液在 37 摄氏度预热一分钟。加入 35 微升浓度为每微升 5 个单位的微球菌核酸酶储备液，使终浓度达到每微升 0.025 个单位。在 37 摄氏度精确孵育 12 分钟。

每4分钟混匀一次。12分钟后，立即将反应体系置于冰上。为终止微球菌核酸酶活性，加入56微升5摩尔/升pH 8.0的EDTA，使终浓度为4毫摩尔/升，涡旋混匀。

在冰上孵育五分钟。高振幅超声处理五次，每次一分钟，两次超声之间间隔一分钟。在4°C、85,000 × g条件下离心30分钟，分别收集盐可提取组分和核小体富集组分。

收集上清液。盐可提取组分的体积应约为 13 mL，而核小体富集组分的体积应约为 6 mL。

将通过双亲和纯化方法纯化 MyoD 蛋白复合物。由于基于 FLAG 和基于 HA 的纯化步骤相似，此处仅展示基于 FLAG 的纯化过程。加入 TEGN 后，将适量体积的 FLAG 树脂转移至一个 50 mL 离心管中。

每个实验点需要300微升商用50%预洗FLAG树脂。在1,000 × g下离心两分钟。弃去上清液，加入冷TEGN，再次离心。

用预冷的TEGN缓冲液洗涤FLAG树脂，共洗涤五次。最后一次洗涤后，将FLAG树脂重悬于等体积的TEGN缓冲液中。针对每个实验点，取300微升洗涤后的FLAG树脂与相应的蛋白提取物混合。

使用15 mL离心管收集染色质片段富集部分，使用50 mL离心管收集盐可提取部分。将离心管置于旋转仪上，于4°C条件下孵育过夜。次日，在4°C条件下，以1,000 × g离心力离心所有离心管2分钟。

收集上清液，并在4 °C下保存，直至获得纯化效率检测结果。对于可溶于盐的样品，将FLAG树脂重悬于4 mL TEGN中，转移至15 mL离心管。重复此步骤三次，每次均转移至同一个15 mL离心管，以避免丢失树脂珠。

在4°C、1,000 × g条件下离心两分钟。弃去上清液后，向FLAG树脂中加入13 mL TEGN，于4°C、1,000 × g再次离心两分钟。以此方式洗涤树脂七次。

最后一次洗涤后，将树脂重悬于 1 mL TEGN 中，并转移至 1.5 mL 低吸附离心管中。离心 2 分钟后弃去上清液。将每份实验样品的树脂重悬于 100 微升 FLAG 肽溶液（4 mg/mL，pH 7.8）中，充分混匀，再加入 100 微升 TEGN 缓冲液。

在4°C下孵育至少4小时，以洗脱结合的蛋白质。离心2分钟，将树脂和上清液转移至置于2 mL离心管中的空自旋柱中。在6,000 × g下离心柱子1分钟。

收集2 mL离心管中的剩余上清液。在进行基于HA的纯化之前，按方案文本中所述方法检测纯化效率。此处展示的是稳定表达FLAG HA MyoD的HeLa S3细胞系中，来自核盐可提取组分或核小体富集组分的双亲和纯化MyoD复合物的代表性结果。

银染检测到由箭头指示的 FLAG HA MyoD，该蛋白在对照细胞系中缺失。经过双重亲和纯化的 MyoD 复合物在甘油梯度中进行分级分离。利用抗 FLAG 抗体对各组分进行蛋白质印迹分析，揭示了 MyoD 亚复合物存在于两个核内亚区室中。

特别地，可被盐溶液提取的 MyoD 分布于三个亚复合物中，而染色质结合型的 MyoD 主要存在于一个复合物中。通过对来自细胞核盐提取组分和核小体富集组分的 MyoD 相互作用蛋白进行质谱分析，鉴定出一系列已知及新的 MyoD 相互作用蛋白。此处，根据功能注释对在两个组分中均存在或仅特异性存在于某一组分中的 MyoD 相互作用蛋白进行了分类整理。

通过 Western 印迹在 MyoD 复合物上验证了部分质谱分析发现的相互作用蛋白，其中包括转录因子 CBF、SWI/SNF 亚基 BAF47 以及 HP1 蛋白。由于 HeLa 细胞并非肌细胞，通常不表达 MyoD，因此有必要验证新鉴定出的相互作用蛋白与 MyoD 在成肌细胞中的相互作用。

使用增殖和分化的小鼠成肌细胞的核总提取物，通过指定的抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹分析。若操作熟练，该技术在正确实施的情况下可在两天半内完成。在进行该实验时，重要的是要记得在成肌细胞中对获得的结果进行优化。

通过该实验流程，还可采用其他方法，例如在成肌细胞等相关体系中对特定互作蛋白进行敲低，以回答该相互作用的功能意义等进一步的科学问题。该技术建立后，将为发育生物学表观遗传学领域的研究人员探索五种转录因子在多数体系统中的调控网络提供重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过细胞分馏结合串联亲和纯化与质谱分析，来鉴定转录因子相互作用蛋白的方法。