使用串联亲和纯化的MyoD相互作用组鉴定质谱分析法
2016年5月17日
MyoD 是一种肌原转录因子，具有很强的诱导许多完全分化非肌肉细胞系的肌原转分化的能力。这种转分化所涉及的表观遗传机制在很大程度上是未知的。在这里，我们描述了一种双亲和纯化方法，然后进行质谱分析，以详尽地表征 MyoD 伴侣。
本实验的总体目标是详尽表征 MyoD 蛋白伴侣。这种方法可以回答骨骼肌生物学领域的关键问题，例如关键肌肉转录因子 MyoD 对骨骼肌张力变形的分子调控。这项技术的主要优点是，它允许我们解开选择性低丰度的 MyoD 伴侣，其中一个位于一个特定的亚核区室中。
虽然这种方法可以提供对肌肉分化调节的见解，但它也可以应用于其他系统，例如任何其他组织，特别是核分化。演示该程序的是我们实验室的研究助理 Lauriane Fritsch 博士。在该方案中，将从稳定表达带有 FLAG 谷蛋白标签的 MyoD 的 HeLa S3 细胞中纯化 MyoD 复合物。
用空载体转导的 HeLa S3 细胞将用作对照。如方案文本中所述，两种细胞系先前均在零下 80 摄氏度下生长、收集和储存。在 37 摄氏度的水浴中快速解冻细胞沉淀。
所有缓冲液和均质器都应进行预冷，整个过程应在冷藏室中进行。通常，每个实验点使用 20 克细胞，但出于本演示的目的，将仅处理 10 克或约 10 mL 细胞。首先使用 5 mL 缓冲液，将细胞重悬于 10 mL 低渗缓冲液 A 中。
然后，加入 2.5 mL，然后再加入 2.5 mL。用新鲜缓冲液充分清洗移液器以获得最大的细胞。用紧密贴合的研杵将 20 mL 细胞悬液转移到预冷的匀浆器中。
用 20 次冲程匀浆细胞。将细胞悬液转移到 50 mL 试管中。为了获得细胞的最大回收率，用 3.5 mL 蔗糖缓冲液洗涤匀浆器。
将此悬浮液快速转移到 50 mL 试管中，以保护细胞核并限制泄漏。用 30 微升 4% 台盼蓝对 30 微升等分试样的细胞悬液进行染色，并在显微镜下分析以确定裂解效率。如果裂解成功，所有细胞核都应为蓝色。
如有必要，重复均质化。以 10， 000 x g 和 4 摄氏度离心 7 分钟，使细胞核沉淀。将上清液保存为细胞质组分。
通过将细胞核沉淀重悬于 4 mL 蔗糖缓冲液中，开始制备核盐可提取级分的程序。然后，逐滴加入 4 mL 高盐缓冲液，同时在涡旋中充分混合，得到最终浓度为 300 mM 氯化钠。在冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟混合一次。
接下来，通过添加 8 mL 蔗糖缓冲液将氯化钠浓度降低至 150 mM。在 13， 000 x g 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。收集上清液，即盐可提取部分，并将其置于冰上。
要制备染色质结合部分，请将沉淀细致地重悬于 3.5 mL 蔗糖缓冲液中。加入氯化钙至终浓度为 1 mM 并混合。氯化钙将激活稍后添加的微球菌核酸酶。
将悬浮液在 37 摄氏度下预热一分钟。每微升微球菌核酸酶原液添加 35 微升 5 单位，得到每微升 25 万分之一单位的最终浓度。在 12 摄氏度下孵育 37 分钟。
每 4 分钟混合一次。12 分钟后，立即将反应物置于冰上。为了终止微球菌核酸酶活性，加入 56 微升 5 摩尔 EDTA pH 8.0 至终浓度为 4 mM 并涡旋。
在冰上孵育 5 分钟。以高振幅超声处理 5 次，每次 1 分钟，两次超声处理之间间隔 1 分钟。改变，在 4 摄氏度下以 85， 000 x g 的离心力离心盐可提取部分和富含核小体的组分 30 分钟。
收集上清液。盐可提取部分应约为 13 mL。核小体富集部分应约为 6 mL。
MyoD 蛋白复合物将通过双亲和纯化进行纯化。由于基于 FLAG 和基于 HA 的纯化程序相似，因此将仅演示基于 FLAG 的纯化。添加 TEGN 后，将适当体积的 FLAG 填料转移到 50 mL 试管中。
每个实验点需要 300 μL 来自市售 50% 储备预洗 FLAG 填料的 FLAG 填料。以 1， 000 x g 的离心力离心 2 分钟。去除上清液，加入冷 TEGN，然后再次离心。
用冷 TEGN 洗涤 FLAG 树脂总共五次。最后一次洗涤后，将 FLAG 填料重悬于等体积的 TEGN 中。对于每个实验点，混合 300 微升洗涤的 FLAG 树脂和相应的蛋白质提取物。
对于核小体富集部分，使用 15 mL 试管，对于盐可提取部分，使用 50 mL 试管。将试管在旋转轮上在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，在 4 摄氏度下以 1， 000 x g 的速度离心所有试管 2 分钟。
收集上清液并保持在四摄氏度，直到获得纯化效率试验的结果。对于盐可提取样品，将 FLAG 填料重悬于 4 mL TEGN 中，然后转移至 15 mL 试管中。重复此步骤 3 次，每次转移至相同的 15 mL，以避免磁珠丢失。
在 4 摄氏度下以 1， 000 x g 的离心力离心 2 分钟。去除上清液后，向 FLAG 填料中加入 13 mL TEGN，并在 4 摄氏度下以 1， 000 x g 的离心速度离心 2 分钟。以这种方式清洗树脂七次。
最后一次洗涤后，将树脂重悬于 1 mL TEGN 中，并转移到 1.5 mL 低结合管中。离心 2 分钟，然后去除上清液。在 pH 值为 7.8 的 100 μL FLAG 肽溶液中以 4 mg/mL 的浓度重悬每个实验点的树脂充分混合并添加 100 μL TEGN 缓冲液。
在 4 摄氏度下孵育至少 4 小时以洗脱结合的蛋白质。离心 2 分钟，然后将填料和上清液转移至置于 2 mL 试管中的空离心柱中。将色谱柱以 6， 000 x g 的离心力离心 1 分钟。
将剩余的上清液收集在 2 mL 试管中。然后按照协议文本中的描述测试纯化效率，然后再进行基于 HA 的纯化。此处显示的是来自稳定表达 FLAG HA MyoD 的 HeLa S3 细胞系的核盐、可提取或核小体富集级分的双亲和纯化 MyoD 复合物的代表性结果。
银染鉴定出 FLAG HA MyoD，箭头指示模拟细胞系中不存在。双亲和纯化的 MyoD 复合物在甘油梯度上分级分离。使用抗 FLAG 抗体对组分进行蛋白质印迹，发现两个亚核区室中的 MyoD 亚复合物。
特别是，盐可提取的 MyoD 分布在三个亚复合物中，而染色质结合的 MyoD 主要属于一个复合物。对从核盐可提取和核小体富集级分中分离的 MyoD 相互作用子进行质谱分析，确定了 MyoD 的一系列已知伴侣和新伴侣。在这里，在两个馏分中发现的 MyoD 交互子，或者特别是对于其中一个馏分，根据它们的函数注释进行分组。
一些质谱显示，相互作用因子通过 MyoD 复合物上的 Western blot 得到证实。这些包括转录因子 CBF、SWI/SNF 亚基 BAF47 和 HP1 蛋白。由于 HeLa 细胞不是肌肉细胞，通常不表达 MyoD，因此有必要确认新发现的相互作用者与 MyoD 和成肌细胞之间的相互作用。
来自增殖和分化小鼠成肌细胞的核总提取物用于免疫沉淀和指定抗体的蛋白质免疫分析。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天半内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住在成肌细胞中改进获得的结果。
按照这个程序，可以执行其他方法，如敲低相关系统中的特定伙伴，如成肌细胞，以回答其他问题，如交互的功能意义。开发后，这项技术为发育生物表观遗传学领域的研究人员探索大多数身体系统中五种转录因子的调控网络铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何通过进行细胞组分分离，然后串联亲和纯化--质谱法来识别转录因子的伴侣有一个很好的了解。
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概述
本研究聚焦于MyoD蛋白伴侣的特征分析，这是肌肉生物学中的一个关键转录因子。所采用的方法允许在特定的亚核室中识别低丰度的MyoD伴侣。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肌肉生物学
背景
- MyoD对于肌源性转分化至关重要。
- MyoD的表观遗传机制尚不完全了解。
- 理解MyoD的相互作用可以揭示肌肉分化的机制。
- 本研究利用了一种新的MyoD复合物纯化方法。
研究目的
- 详细特征化MyoD蛋白伴侣。
- 探索骨骼肌功能的分子调控。
- 将研究发现应用于其他组织分化情境。
所用方法
- 双亲和纯化方法。
- 用于伴侣识别的质谱分析。
- 使用表达带FLAG标签的MyoD的HeLa S3细胞。
- 分析MyoD伴侣的亚核定位。
主要结果
- 识别低丰度的MyoD伴侣。
- 对肌肉分化调控的洞见。
- 在其他分化研究中的潜在应用。
- 由Lauriane Fritsch博士展示的方法。
结论
- 该方法提供了研究MyoD相互作用的稳健方法。
- 研究结果可能增强对肌肉生物学的理解。
- 未来应用可能扩展到各种组织类型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the MyoD interactome provides mechanistic insight into skeletal muscle terminal differentiation, a process relevant to regenerative medicine and muscle disorder therapeutics. Identifying low-abundance nuclear partners through tandem affinity purification enables target de-risking in early discovery by clarifying transcriptional regulatory networks. This approach supports predictive confidence in targeting myogenic factors for therapeutic intervention in conditions such as muscular dystrophy and rhabdomyosarcoma.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MyoD-centered transcriptional complexes to validate functional relevance in myogenic pathways.
- Operational Value: Facilitates detection of low-abundance, subnuclear-localized partners that may be missed by conventional co-immunoprecipitation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by mapping MyoD interactions with chromatin remodelers and transcription factors implicated in muscle differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a validated interactome dataset for assay development targeting MyoD-dependent transcriptional regulation.
- Operational Value: Establishes a reproducible purification workflow from heterologous systems compatible with mass spectrometry readouts.
- Scientific Value: Provides quantitative interaction data to support screening campaigns for modulators of MyoD complex assembly.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links MyoD interactors to epigenetic mechanisms regulating skeletal muscle genes, informing biomarker relevance in differentiation models.
- Operational Value: Enables functional validation in disease-relevant systems such as mouse myoblasts to confirm partner roles in myotube formation.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing salt-extractable versus chromatin-bound MyoD subcomplexes with distinct functional annotations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling systematic mapping of transcription factor interactomes prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of MyoD-mediated transcriptional regulation through comprehensive partner identification.
- Screening: Produces standardized, mass spectrometry-ready complexes for assessing compound effects on MyoD interaction networks.
- Analytics: Delivers fractionation and Western blot-validated data to compare MyoD subcomplex distribution across nuclear compartments.
- Translational Research: Connects interactome data to preclinical validation in myoblast differentiation models for functional confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tandem affinity purification platform applicable to other nuclear transcription factors beyond MyoD.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing direct and indirect MyoD partners in physiologically relevant complexes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lysis, fractionation, and dual-tag purification steps performed under controlled conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in MyoD-driven transcriptional programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of myogenic targets based on interaction network centrality and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell fractionation, affinity purification, and mass spectrometry-based proteomics.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment for nucleosome-enriched fraction isolation.
- Necessitates cross-team standardization between proteomics and cell biology units for consistent MyoD complex recovery.
- Involves adaptation considerations when transferring from HeLa S3 to primary myoblast systems for functional validation.
- Limited by the efficiency of tandem affinity purification in capturing transient or low-stoichiometry interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Isolation of Nuclei
3:54
Preparation of HeLa-S3 Nuclear Salt-extractable and Chromatin-bound Fractions
7:05
Protein Complexes Purification
11:22
Results: MyoD Interactors Identified by Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry
13:37
Conclusion
