使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

本实验的总体目标是利用与盖子相连的悬臂，在96孔板体系中简便且可重复地培养细菌生物膜，并通过活性染料进行抗生素敏感性测试。该方法有助于解答抗生素发现与开发领域的关键问题，通过研究生物膜相关细胞的活性，而这些细胞通常更能代表体内感染状态。该技术的主要优势在于，能够在三段式培养基体系中轻松地对已形成的生物膜进行干预，并利用常见的活性染料测定其抑制效果。

首先，在营养丰富的培养基中培养可形成生物膜的微生物。将金黄色葡萄球菌 Newman 菌株从甘油保存管接种至 10 毫升 Mueller-Hinton 培养基中。所有涉及 S.aureus 操作的实验步骤均须戴手套，并在生物安全柜内进行。

在37摄氏度下于旋转摇床上孵育16小时。将计算好的培养液体积加入离心管中，以10,000 G离心一分钟收集细胞沉淀。为制备生物膜接种物，吸除用过的培养基，并将细胞沉淀重悬于20毫升CRPMI培养基中。使用200微升多通道移液器，从25毫升储液器中向底部板A至G行的每孔加入125微升接种物。

在 H 行的每个孔中加入 125 微升无菌 CRPMI 培养基，作为无菌对照。取 peg 盖，将其置于板底上方，使 peg 朝下。小心地将各个 peg 与对应的孔对齐。

避免平板与插针发生物理接触。对齐后，小心地将盖子放下。用石蜡膜将盖子与平板密封，以防止蒸发，并将其放入可密封的塑料袋中，紧密封好。

尽量减少袋内空气体积，以降低蒸发。将培养板置于5%二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下静置培养48小时。在进行生物膜挑战实验当天，取一块新的96孔板，向B至H行的每孔中加入100微升已平衡至室温的CRPMI。将最多四种待测化合物分别用1.0毫升CRPMI稀释至目标终浓度的2倍。

在 A1-A3 孔中加入 200 微升化合物 1，在 A4-A6 孔中加入 200 微升化合物 2，在 A7-A9 孔中加入 200 微升化合物 3，在 A10-A12 孔中加入 200 微升化合物 4。使用多通道移液器对测试化合物进行连续稀释。

首先，从 A 行向 B 行转移 100 µL，并混匀。以此方式继续逐孔转移 100 µL，每次转移后均需混匀，至 F 行停止。混匀后，将 F 行中的 100 µL 排入废液容器中。

不要将任何液体转移到 G 和 H 行。最后，使用多通道移液器向每孔加入 100 微升 CRPMI，使最终体积达到 200 微升。向一个新的无菌 96 孔板中每孔加入 200 微升磷酸盐缓冲液，该板的孔尺寸需与生物膜起始板完全相同。接着，从孵育后的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。

垂直向上提起盖子，避免插针与培养板底部接触，以免损坏生物膜。保留底部部分用于后续的OD600分析。将带有插针的盖子放入含有PBS的培养板中，以冲洗掉浮游细胞。

将 peg 浸入 PBS 中 5 秒。取出后再次浸入，注意避免 peg 与孔壁碰撞。将清洗后的 peg 盖放入挑战培养板中。

避免 pegs 与底板之间发生不必要的接触，否则会破坏生物膜，导致结果不一致。用石蜡膜密封平板，并像之前一样放入可密封的塑料袋中。将平板置于 5% 二氧化碳培养箱中，在 37 摄氏度下静置培养 24 小时。

取生物膜起始板的底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌。使用合适的微孔板读板仪测定OD600，以确认除H行的无菌对照孔外，其余各孔均有细菌生长。使用配备孵育腔且能够进行动力学荧光检测的微孔板读板仪，以检测刃天青（resazurin）的转化。设置持续24小时的动力学荧光检测程序，激发波长为530纳米，发射波长为590纳米。

将培养箱温度设置为 37 摄氏度，并每 20 分钟读取一次酶标板。根据制造商说明，设置酶标仪从酶标板底部进行测量。使用多通道移液器向无菌 96 孔板的每个孔中加入 200 微升 PBS，以准备洗涤酶标板。

然后，通过将 400 微升浓度为 0.8 毫克/毫升的刃天青（resazurin）储备液加入到 20 毫升 CRPMI 培养基中，制备生物膜回收培养基，使刃天青的终浓度为 16 微克/毫升。接着，使用多通道移液器将 150 微升生物膜回收培养基加入至新的 96 孔板的每孔中。将培养后的挑战板从培养箱中取出，转移至生物安全柜内，小心移除塑料袋和封口膜。

取下挑战板的插针盖，用 PBS 冲洗掉浮游细胞，方法同前，并保留挑战板底部用于后续的 OD600 分析。冲洗后，将插针盖放入含有生物膜回收培养基的板底部中。用石蜡膜包裹板的四周，注意不要遮挡周边孔的底部。

用封口膜包裹酶标板后，立即将其放入酶标仪中，并启动预先设置的刃天青动力学检测程序，进行为期24小时的动力学读数。为定量检测挑战过程中可能产生或不产生的浮游细胞生长情况，使用微孔板读板仪读取整个挑战板底部的OD600值。图中展示的是一个挑战板的示例布局，采用两倍系列稀释法对化合物浓度进行滴定。

将已形成的生物膜用新铜试剂或其铜复合物处理。24小时后，对挑战平板底部进行OD600测定，结果显示：新铜试剂铜复合物（而非单独的新铜试剂）在浓度为1.25微摩尔或更高时，可阻止处理后生物膜中活细胞的脱落及后续生长。随后，对相应的生物膜采用刃天青显色法进行检测。

24小时后进行肉眼观察，可对并行处理的多块平板快速给出有无生物膜存活的定性结果。活性生物膜会使刃天青（resazurin）变为粉红色，而生物膜被彻底清除的孔中则保持蓝色。通过动力学检测刃天青的还原反应，可揭示药物浓度依赖性的生物膜活性变化，本实验以庆大霉素（gentamicin）为例展示了该方法。

染料转化起始时间的浓度依赖性延迟，表明生物膜活力下降。在进行该操作时，应注意避免使小柱与孔壁发生碰撞。