Name: 针对相关生物膜金黄色葡萄球菌使用基于刃天青药物敏感性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 了解使用刃天青染料在96孔板中培养金黄色葡萄球菌生物膜并进行抗生素敏感性检测的方法。该技术可评估抗菌化合物对生物膜相关细菌的抑制效果，为抗生素研发提供可靠工具。

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感谢Saran Kupul提供的技术支持。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01-AI104952（资助对象：FW）支持。此外，本研究还得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）艾滋病研究中心（CFAR）的支持，该中心为美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（P30 AI027767），并由以下NIH研究所共同支持：NIAID、NIMH、NIDA、NICHD、NHLDI、NIA。

1. 生物膜的起始
<ol>
	<li>在营养丰富的培养基中培养能形成生物膜的微生物。接种 金黄色葡萄球菌 从甘油储备液中将Newman菌株接种于10 ml Mueller-Hinton培养基中。所有涉及操作 S. aureus 佩戴手套并在生物安全柜内操作。</li>
	<li>在37 °C下于旋转摇床（100-200 rpm）中孵育16小时。</li>
	<li>测定 OD600 使用分光光度计和标准比色皿（光程：1 cm）测定培养物的光密度。</li>
	<li>计算制备 20 ml 接种液所需培养物的体积（V），其 OD600（接种量） 在经Chelex处理的Roswell Park Memorial Institute培养基（CRPMI）中，浓度为0.19 使用公式：[V = 20 ml×0.1/OD]600（培养）] 
	注：参考文献9提供了CRPMI制备的详细信息。
	<ol>
		<li>加入上述计算好的培养液体积至离心管中，于10,000 × g离心1分钟以收集细胞。为制备生物膜接种物，吸除废弃的培养基，并将细胞沉淀重悬于20 ml CRPMI中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将接种物倒入25 ml储液槽中。</li>
	<li>小心地将无菌96孔板的盖子垂直向上取下。 
	注意：必须注意避免污染从盖子上垂下的插针。可将盖子倒置放在生物安全柜内干净的表面上。</li>
	<li>使用200 µl多通道移液器，向底部板的A至G行每孔加入125 µl接种物。</li>
	<li>在H行每孔中加入125 µl无菌CRPMI培养基作为无菌对照。</li>
	<li>取下带钉盖子，将钉头朝下悬于板底上方。仔细对准每个钉头与对应的孔位，避免板与钉头发生物理接触。对准后，小心地将盖子向下放低。注意避免错位，因为一旦钉头接触到底板后再进行调整，可能会污染H行的无菌对照。</li>
	<li>用石蜡膜将板盖密封，防止蒸发，并放入可密封的塑料袋中，确保密封严实。尽量减少袋内空气体积，以最大限度降低蒸发。</li>
	<li>37 °C、5% CO₂条件下静置培养48小时2 培养箱 
	注意：48 小时的生长对 S. aureus，但会因所用生物体的不同而有所差异。 
	注意：尽管静态培养是优化该检测方法的良好起点，但在微孔板振荡器上以150 rpm轻轻振荡是一种可能的替代方案，或可促进某些生物膜的形成 S. aureus 分离物</li>
</ol>
2. 生物膜挑战平板的制备
<ol>
	<li>在进行生物膜挑战实验的当天，取一个新的96孔板，向B至H行的每个孔中加入100 µl已平衡至室温的CRPMI培养基。为避免结果不一致，应使用当插针插入时可容纳200 µl培养基、且孔的尺寸与生物膜起始板相同的96孔板。</li>
	<li>将最多4种待测化合物分别用1.0 ml CRPMI稀释至目标终浓度的2倍，以补偿步骤2.7中的最终稀释效应。 
	注意：一个合适的起始浓度为浮游细胞抑制浓度的8倍。</li>
	<li>在A1至A3孔中加入200 µl化合物1，在A4至A6孔中加入化合物2，在A7至A9孔中加入化合物3，在A10至A12孔中加入化合物4。</li>
	<li>使用多通道移液器进行系列稀释，从A行向B行转移100 µl，并混匀。</li>
	<li>以此方式逐孔转移100 µl，每次转移后充分混匀，至F行停止。</li>
	<li>混匀后，将F行各孔中的100 µl液体排入废液容器中。不要向G行和H行转移任何液体。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入100 µl CRPMI，使最终体积达到200 µl。最终的板布局参见图1。</li>
</ol>
3. 生物膜挑战
<ol>
	<li>向一个新的无菌96孔板中加入200 µl磷酸盐缓冲液（PBS），该孔板的孔尺寸需与生物膜起始板的孔尺寸完全相同。</li>
	<li>从已孵育的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。</li>
	<li>垂直向上提起盖子，避免插针与板底接触，以免损伤生物膜。保留底部板用于后续的OD600分析（见步骤3.8）。</li>
	<li>将带插针的盖子放入含有PBS的板中（来自步骤3.1），以冲洗掉浮游细胞。将插针浸入PBS中5秒，取出后再浸入一次，注意不要使插针碰撞孔壁。</li>
	<li>将清洗后的带插针盖子放入挑战板中。避免插针与底板之间不必要的接触，以防损坏生物膜，导致结果不一致。</li>
	<li>用石蜡膜密封板，并放入可密封的塑料袋中，操作如步骤1.10所述。</li>
	<li>将板置于5% CO2培养箱中，在37 °C下静置孵育24小时。</li>
	<li>取步骤3.3中保留的生物膜起始板底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌，并用合适的酶标仪测定OD600，以确认除H行的无菌对照孔外，其余各孔均有细菌生长。</li>
</ol>
4. 生物膜测定
<ol>
	<li>使用配备有孵育室并能够进行动力学荧光检测的酶标仪，用于检测刃天青的转化。设置持续24小时的动力学荧光测定程序，激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。</li>
	<li>将孵育室温度设为37 °C，并每20分钟读取一次酶标板。根据仪器制造商的说明，设置酶标仪从酶标板底部进行检测。</li>
	<li>使用多通道移液器向无菌96孔板中加入200 µl PBS，制备洗涤板。</li>
	<li>向20 ml CRPMI培养基中加入400 µl浓度为0.8 mg/ml的刃天青储备液，配制生物膜回收培养基，使刃天青终浓度为16 µg/ml。 
	注意：刃天青为已知皮肤刺激物，操作时应穿戴实验服、防溅护目镜和手套。选用CRPMI作为生物膜回收培养基是因为其背景信号最低，但可根据需要替换为Mueller Hinton培养基。</li>
	<li>使用多通道移液器向新的96孔板的每孔中加入150 µl生物膜回收培养基。</li>
	<li>将挑战板从孵育箱中转移至生物安全柜内，小心移除塑料袋和密封膜。</li>
	<li>取下挑战板的带钉盖板，并按照步骤3.4所述方法用PBS冲洗浮游细胞。保留挑战板底部用于后续的OD600分析（见步骤4.10）。</li>
	<li>冲洗后，将带钉盖板放入含有生物膜回收培养基的酶标板底部。</li>
	<li>用石蜡膜包裹酶标板四周，注意不要遮挡边缘孔的底部。包裹完成后立即把酶标板放入酶标仪中，并启动之前在步骤4.1中设定的刃天青动力学检测程序，开始为期24小时的动力学读数。</li>
	<li>为定量分析在挑战过程中可能产生或不产生的浮游细胞生长情况，使用微孔板读数仪检测整个挑战板底部的OD600值。操作步骤请参照步骤3.8中的说明。 
	注意：应小心重悬各孔中的内容物，因为从生物膜脱落的细胞倾向于在孔底成团生长。孔内任何气泡都会严重干扰OD600读数，因此在检测前必须避免或清除气泡。</li>
</ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
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<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
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<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种改良的生物膜检测方法，用于评估待测抑制剂对S. aureus生物膜的活性，重点关注生物膜相关细胞的代谢状态。尽管所述的生物膜诱导和处理流程主要参照了制造商的建议，但使用刃天青（resazurin）染料检测并定量在24小时抑制剂处理后仍存活的生物膜相关细胞，显著简化了制造商推荐的细胞回收（通过水浴超声）及后续通过菌落形成单位（CFU）计数来定量活细胞的操作流程。制造商推荐的该流程至少包含5个额外的操作步骤，每个步骤均易引入误差、劳动强度大，且难以实现自动化。简化读数流程的优势使 peg plate 检测法在高通量操作和应用中更具吸引力。
尽管该实验步骤较多，但其原理相对简单，关键步骤较少。最重要的是，必须能够重复培养出质量一致的生物膜，这是获得可重复结果的关键。此外，在取放 peg-lid（插针盖）时必须格外小心：任何与孔壁的接触都可能破坏生物膜，导致结果偏差。更重要的是，充分的洗涤至关重要：若未能在任一阶段彻底去除浮游细胞，将无法准确测量与生物膜相关的细菌数量。然而，洗涤也不能过于剧烈；过多的洗涤步骤可能开始破坏生物膜本身，从而导致结果不一致。</p...

致病性微生物可形成生物膜 体内 导致非急性慢性感染 1生物膜相关感染是涉及植入外来物体的医疗操作中一个严重的危险因素例如， 人工骨替代物、乳房假体，或气管插管和导尿管的置入 2在这些情况下，抗感染治疗几乎总是必要的，因为基于生物膜的感染即使在免疫功能健全的个体中也极少能自行清除。 Staphylococcus aureus 是使用侵入性医疗器械期间发生与生物膜相关并发症时最常见的病原体之一 3.
遗憾的是，生物膜作为一种保护性屏障，其本身特性使其对抗治疗的能力强于浮游细胞1,4，因此对药物临床疗效的预测进行评估，是新药研发初期以及耐药性监测中的关键环节。目前人们日益认识到，专注于浮游培养的实验室条件可能无法真实反映实际临床疾病状况5。更为复杂的是，生物膜表型的重复再现较为困难，现有的生物膜模型操作繁琐，且存在较高的实验间和实验内变异度6。因此，许多研究人员出于实际需要，往往默认采用针对浮游细胞的药物敏感性检测，从而可能忽视了细菌毒力和疾病进程中的一个重要方面。
本文描述了利用基于96孔板的生物膜系统检测预形成生物膜中细菌（特别是S. aureus）活性的实验方案7,8。尽管生物膜形成与药物处理的步骤基本遵循制造商的建议，但我们提出了一种信息量更高的替代方法，用于量化处理后生物膜的存活率。简言之，将细菌在 peg 板中培养，使其在连接于板盖上的突出 peg 上形成生物膜。生物膜形成后，将 peg 轻轻浸入装有 PBS 的新板孔中，以去除浮游细胞。随后，将带有生物膜的 peg 板盖转移至含有不同浓度待测抗生素的新处理板中进行药物处理。二次孵育后，取出板盖，清洗后转移至含有刃天青（resazurin）染料的恢复板中，进行最终孵育。刃天青的还原反应可通过动力学方式连续记录，或在设定的恢复期结束后进行终点读数。这种基于染料的生物膜活性定量方法与原始方案中繁琐的菌落形成单位（CFU）计数法有显著区别7。药物处理板的OD600测定值和刃天青还原动力学分别作为浮游菌和生物膜细胞活性的检测指标，提供了一种快速、可靠、信息丰富且技术简便的生物膜存活检测方法。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;穆勒-欣顿培养基</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>遵循制造商的建议</td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>参考文献9</td><td></td><td>使用Chelex 100树脂对RPMI-1640培养基螯合处理1小时，然后添加10%未经螯合的RPMI-1640进行补充</td></tr><tr><td>Chelex 100树脂</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC板</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &amp;micro;g/ml 溶于去离子水中&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 过滤除菌</td></tr><tr><td>微量培养板振荡平台&amp;nbsp;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3酶标仪</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5软件</td><td>Biotek</td><td></td><td>用于记录和分析刃天青的转化情况</td></tr><tr><td>新铜试剂</td><td>Sigma</td><td>N1501&amp;nbsp;</td><td>用100%乙醇配制10 mM储备液，-80 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>硫酸铜</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>用水配制100 mM储备液，4 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>Cu-新铜试剂复合物</td><td>自制</td><td></td><td>通过等摩尔浓度的新铜试剂与硫酸铜混合制备，用CRPMI培养基稀释至所需浓度</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关staphylococcus aureus

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

大多数致病菌在感染过程中能够形成生物膜，但由于生物膜的操作和评估较为困难，绝大多数实验室研究仍使用浮游细胞进行。本文以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为例，介绍一种基于 peg 板的生物膜检测方法。细菌生物膜在连接于 96 孔微孔板盖上的 peg 上生长，通过将 peg 盖轻轻浸入缓冲液中进行清洗后，转移至药物处理板中。经过进一步培养后，再次清洗并转移至最终的恢复板，在恢复板中荧光染料刃天青（resazurin）作为细胞活性的指示剂。该检测方法在进行动力学读数时，具有显著提高的操作便捷性、可靠性和可重复性，并能提供丰富的数据。此外，该方法还可调整为中等通量的药物筛选模式，采用终点荧光读数代替动力学检测，为药物发现研究提供可行路径。

刃天青检测法的灵敏度足以可靠地检测出在药物清除后能在无药培养基中复制的极少量活细胞。在本方法中，我们将最小生物膜清除浓度定义为在24小时内未观察到刃天青颜色转化的最低浓度。刃天青检测依赖于代谢活跃细胞中存在的氧化性分子，这些分子可将染料颜色由蓝色转变为粉红色。因此，染料的颜色变化是细胞生长的指标，并可通过荧光酶标仪进行定量。在本文中，测试了新铜试剂及其铜络合物（Cu-新铜试剂）对生物膜相关 S. aureus 应用一种基于布局的方法 图1. 实验方案执行过程中获得的数据为 OD600 生物膜起始板的读数作为质量控制（数据未显示），其OD600 完成刺激后对培养板底部进行读数（图2A)，以及恢复培养板中刃天青转化为其荧光代谢产物试卤灵的动力学记录（图2B）。此外，挑战平板的终点图像可用于目视检查刃天青的转化情况（图2C如果实验目的仅需对刃天青还原反应进行是/否判...

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。

使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

大多数致病菌在感染过程中能够形成生物膜，但由于生物膜的操作与评估存在困难，绝大多数……

本实验的总体目标是利用与盖子相连的悬臂，在96孔板体系中简便且可重复地培养细菌生物膜，并通过活性染料进行抗生素敏感性测试。该方法有助于解答抗生素发现与开发领域的关键问题，通过研究生物膜相关细胞的活性，而这些细胞通常更能代表体内感染状态。该技术的主要优势在于，能够在三段式培养基体系中轻松地对已形成的生物膜进行干预，并利用常见的活性染料测定其抑制效果。首先，在营养丰富的培养基中培养可形成生物膜的微生物。将金黄色葡萄球菌 Newman 菌株从甘油保存管接种至 10 毫升 Mueller-Hinton 培养基中。所有涉及 S.aureus 操作的实验步骤均须戴手套，并在生物安全柜内进行。在37摄氏度下于旋转摇床上孵育16小时。将计算好的培养液体积加入离心管中，以10,000 G离心一分钟收集细胞沉淀。为制备生物膜接种物，吸除用过的培养基，并将细胞沉淀重悬于20毫升CRPMI培养基中。使用200微升多通道移液器，从25毫升储液器中向底部板A至G行的每孔加入125微升接种物。在 H 行的每个孔中加入 125 微升无菌 CRPMI 培养基，作为无菌对照。取 peg 盖，将其置于板底上方，使 peg 朝下。小心地将各个 peg 与对应的孔对齐。避免平板与插针发生物理接触。对齐后，小心地将盖子放下。用石蜡膜将盖子与平板密封，以防止蒸发，并将其放入可密封的塑料袋中，紧密封好。尽量减少袋内空气体积，以降低蒸发。将培养板置于5%二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下静置培养48小时。在进行生物膜挑战实验当天，取一块新的96孔板，向B至H行的每孔中加入100微升已平衡至室温的CRPMI。将最多四种待测化合物分别用1.0毫升CRPMI稀释至目标终浓度的2倍。在 A1-A3 孔中加入 200 微升化合物 1，在 A4-A6 孔中加入 200 微升化合物 2，在 A7-A9 孔中加入 200 微升化合物 3，在 A10-A12 孔中加入 200 微升化合物 4。使用多通道移液器对测试化合物进行连续稀释。首先，从 A 行向 B 行转移 100 µL，并混匀。以此方式继续逐孔转移 100 µL，每次转移后均需混匀，至 F 行停止。混匀后，将 F 行中的 100 µL 排入废液容器中。不要将任何液体转移到 G 和 H 行。最后，使用多通道移液器向每孔加入 100 微升 CRPMI，使最终体积达到 200 微升。向一个新的无菌 96 孔板中每孔加入 200 微升磷酸盐缓冲液，该板的孔尺寸需与生物膜起始板完全相同。接着，从孵育后的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。垂直向上提起盖子，避免插针与培养板底部接触，以免损坏生物膜。保留底部部分用于后续的OD600分析。将带有插针的盖子放入含有PBS的培养板中，以冲洗掉浮游细胞。将 peg 浸入 PBS 中 5 秒。取出后再次浸入，注意避免 peg 与孔壁碰撞。将清洗后的 peg 盖放入挑战培养板中。避免 pegs 与底板之间发生不必要的接触，否则会破坏生物膜，导致结果不一致。用石蜡膜密封平板，并像之前一样放入可密封的塑料袋中。将平板置于 5% 二氧化碳培养箱中，在 37 摄氏度下静置培养 24 小时。取生物膜起始板的底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌。使用合适的微孔板读板仪测定OD600，以确认除H行的无菌对照孔外，其余各孔均有细菌生长。使用配备孵育腔且能够进行动力学荧光检测的微孔板读板仪，以检测刃天青（resazurin）的转化。设置持续24小时的动力学荧光检测程序，激发波长为530纳米，发射波长为590纳米。将培养箱温度设置为 37 摄氏度，并每 20 分钟读取一次酶标板。根据制造商说明，设置酶标仪从酶标板底部进行测量。使用多通道移液器向无菌 96 孔板的每个孔中加入 200 微升 PBS，以准备洗涤酶标板。然后，通过将 400 微升浓度为 0.8 毫克/毫升的刃天青（resazurin）储备液加入到 20 毫升 CRPMI 培养基中，制备生物膜回收培养基，使刃天青的终浓度为 16 微克/毫升。接着，使用多通道移液器将 150 微升生物膜回收培养基加入至新的 96 孔板的每孔中。将培养后的挑战板从培养箱中取出，转移至生物安全柜内，小心移除塑料袋和封口膜。取下挑战板的插针盖，用 PBS 冲洗掉浮游细胞，方法同前，并保留挑战板底部用于后续的 OD600 分析。冲洗后，将插针盖放入含有生物膜回收培养基的板底部中。用石蜡膜包裹板的四周，注意不要遮挡周边孔的底部。用封口膜包裹酶标板后，立即将其放入酶标仪中，并启动预先设置的刃天青动力学检测程序，进行为期24小时的动力学读数。为定量检测挑战过程中可能产生或不产生的浮游细胞生长情况，使用微孔板读板仪读取整个挑战板底部的OD600值。图中展示的是一个挑战板的示例布局，采用两倍系列稀释法对化合物浓度进行滴定。将已形成的生物膜用新铜试剂或其铜复合物处理。24小时后，对挑战平板底部进行OD600测定，结果显示：新铜试剂铜复合物（而非单独的新铜试剂）在浓度为1.25微摩尔或更高时，可阻止处理后生物膜中活细胞的脱落及后续生长。随后，对相应的生物膜采用刃天青显色法进行检测。24小时后进行肉眼观察，可对并行处理的多块平板快速给出有无生物膜存活的定性结果。活性生物膜会使刃天青（resazurin）变为粉红色，而生物膜被彻底清除的孔中则保持蓝色。通过动力学检测刃天青的还原反应，可揭示药物浓度依赖性的生物膜活性变化，本实验以庆大霉素（gentamicin）为例展示了该方法。染料转化起始时间的浓度依赖性延迟，表明生物膜活力下降。在进行该操作时，应注意避免使小柱与孔壁发生碰撞。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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